Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Published: July 22, 2015 doi: 10.3791/52867
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Interfaculty Institute for Biochemistry, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems, 3German Cancer Research Center

Introduction

Atomic Force Microscopy (AFM) genererer et bilde av en overflate ved å scanne over et område av prøven ved hjelp av en utligger med en meget skarp spiss 1. Bevegelsen av cantilever sonder overflaten topologien av prøven. AFM har blitt mye brukt til biologiske molekyler - inkludert proteiner, DNA og membraner, på grunn av sin allsidighet i å analysere faste prøver i luft eller tilnærmet opprinnelig tilstand i flytende 2-5.

Bortsett fra den høye oppløsning avbildning i nanometerområdet, fungerer AFM cantilever som en fjær for å sondere interaksjonskreftene (vedheft og frastøting) og mekaniske egenskapene til prøven 5,6. Dette er kjent som kraft-spektroskopi. I denne modusen sonden først nærmer prøven og utøver en kraft på den, og er trukket tilbake inntil den mister kontakt med prøven (figur 1A). De genererte kurver viser kraft som en funksjon av avstanden av braket for både appmort og tilbaketrekking. Flere egenskaper inkludert elastisitetsmodulen for å måle stivheten av et materiale, og adhesjonskreftene kan utledes.

Støttede lipidbilag er biologiske modell membraner som ligger på toppen av en solid støtte - vanligvis glimmer, borsilikatglass, smeltet silisiumdioksid, eller oksidert silisium 7. De er forberedt ved hjelp av ulike teknikker som vesikkel deponering, Langmuir-Blodgett metode og spin-belegg 8,9. AFM avbildning har blitt brukt for å følge dannelsen av disse støttede bilag 10, og sonden ulike strukturer dannet av membraner av forskjellige sammensetninger 11-15.

Utøvende kraft spektroskopi på støttede dobbeltlag resulterer i en topp i tilnærmingen kurve. Denne topp indikerer den kraft som er nødvendig for å stikke hull i bilaget, og kalles gjennombrudd kraft. Den to-lags tykkelse kan også måles ved hjelp av den kraft som kurve 6. Den typiske gjennombrudd kraft bilagrange mellom 1-50 Nn 6. Disse egenskapene er avhengig av lipid pakning (væske eller gel fase) og struktur (acylkjedelengde og grad av umettethet) og endret ved membranaktive midler 16. Teorien bak bruddet har blitt forklart 17 og andre eksperimentelle parametre som cantilever mykhet, tannradius og tilnærming hastighet påvirker også gjennombruddet kraft 15,16,18. Force spektroskopi har blitt brukt til å analysere egenskapene til ulike faser lipid 11,19, sammensetning avhengige endringer 12,20, så vel som effekten av andre biomolekyler, for eksempel peptider, på stabiliteten av 21 membranen.

Den flate orientering av støttede dobbeltlag er fordelaktig for å kombinere AFM med andre metoder slik som overflate-plasmonresonans 22 og fluorescens mikroskopi 11,19 for bedre å karakterisere strukturen og egenskapene til membraner.

Denne detaljerte video protocol er ment å forberede lipid bilag som støttes ved hjelp av vesikkel-avleiring og analysere dem med AFM og kraft-spektroskopi. Mens vesikler av forskjellige størrelser kan anvendes for å fremstille bilag, fokuserer denne protokollen på små og store unilamellære vesikler. Støttede bilag at fase skille til flytende bestilt (L o) og flytende uordnede (L d) faser ble preget 11,15. Membranen består av di-oleoyl-fosfatidylcholin (DOPC), sfingomyelin (SM), og kolesterol (Chol) på 2: 2: 1-forhold. Denne sammensetningen modeller lipid flåter, som er foreslått til å oppføre seg som plattformer viktige for protein trafficking og sortering, celle signalisering og andre cellulære prosesser 23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Supported lipidbilagene (SLB) 11,12,21

  1. Utarbeidelse av Lipid blandingen og multilamellære vesikkel utestengelse
    1. Forbered følgende buffere forhånd.
      1. Forbered PBS-buffer i konsentrasjoner på 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2PO 4, 8 mM Na HPO 2 til 4, og 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Forbered SLB (støttes lipidbilag) buffer i konsentrasjoner på 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Forbered en løsning av en M CaCl 2.
    2. Oppløs følgende lipider i kloroform ved en ønsket konsentrasjon, for eksempel, di-oleoyl-fosfatidylcholin (DOPC) ved 25 mg / ml, sfingomyelin (SM) ved 25 mg / ml og kolesterol (Chol) ved 10 mg / ml.
    3. Ta 18,38 ul DOPC, 17,10 pl av SM og 11,30 ul Chol for å lage en løsning med 1 mg av totale lipider i en 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol molforhold. Varierer volumene følgelig basert på den concentrations av lipider utarbeidet i 1.1.2. Imidlertid opprettholde det molare forhold på 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, som å endre molforholdet vil endre fasen egenskapene til membranen 25.
    4. Bland løsningen helt ved virvling. Legg til et fluorescerende fargestoff lipidic 0.05 mol% dersom man ønsker å visualisere dobbeltlaget av et fluorescens mikroskop.
      Merk: Familien til langkjedede dialkylcarbocyanines, som gjorde, Dil og Dio spenner over et bredt spekter av bølgelengder og kan være ideelt brukes til å merke lipidmembraner. Alternativt kan fluorescerende merkede lipider, som rhodamin-fosfatidyletanolamin eller BODIPY-kolesterol benyttes. I alle tilfelle bør konsentrasjonen av fargestoffet være optimalisert i henhold til den mikros innstilling, med tanke på at høye konsentrasjoner av fluoroforen som er bundet til lipid kan endre virkemåten lipid 19.
    5. Tørk av kloroform ved hjelp av N2-gass (eller hvilken som helst tilgjengelig inert gass, såsom Ar og He).
    6. Ytterligere tørr tHan lipidblanding under vakuum i minst 1 time.
      Merk: Hvis lagre denne lipidblandingen, rense luften med inert gass (N2, Ar eller He) og oppbevares ved -20 ° C. Alikvoter skytende lipider-i-kloroform i små brune ampuller. Tørk dem på en lignende måte som den lipidblandingen, fortrenger luft med inert gass (N2, Ar eller He) og oppbevares ved -20 ° C.
    7. Oppløs de tørkede lipidene i PBS-buffer til en konsentrasjon på 10 mg / ml.
    8. Vortex blandingen kraftig i ca 20 sek til 1 min å få en uklar suspensjon, som inneholder multilamellære vesikler. Pass på at det ikke er noen Lipidfilmene stikker til sidene av hetteglasset.
    9. Distribuere denne suspensjonen i 10 ul aliquoter (1 mg lipid gjør 10 aliquoter).
    10. Oppbevar ved -20 ° C inntil videre bruk.
  2. Utarbeidelse av unilamellære vesikler
    Merk: Forskjellige størrelser av unilamellære vesikler kan fremstilles ved hjelp av ultralydbehandling metoden eller ekstruderingsmetode. Lydbehandling bruker sound energi for å agitere blandingen og separer lagene i multilamellære suspensjon. Dette indikeres ved oppklaring av disig suspensjon. Ekstrudering tvinger multilamellære vesikler til å passere gjennom et membranfilter med en bestemt porestørrelse.
    1. Ultralydmetode
      1. Ta 10 mL av multilamellære lipid suspensjoner og tilsett 150 mL av SLB buffer.
      2. Overfør blandingen i små (2 ml) avkortet hetteglass og forsegle med Parafilm.
      3. Sonikere blandingen ved romtemperatur i et bad sonikator i 10 minutter eller inntil det blir klart til å gi små unilamellære vesikler (SUVer, under 50 nm i diameter).
    2. Extrusion Metode
      1. Ta 10 mL av multilamellære lipid suspensjoner og tilsett 150 mL av SLB buffer.
      2. Overfør suspensjonen inn i en kryogenisk rør.
      3. Frys lipid suspensjonen ved å senke den kryogene rør i et par sekunder i flytende nitrogen.
      4. Tinelipid suspensjon ved å senke den kryogene røret i et vannbad ved romtemperatur eller 37 ° C i noen minutter. Gjenta fryse-tine-fremgangsmåten på minst 10 ganger.
      5. For å kunne ekstrudere lipid suspensjonen ved å bruke en polykarbonatmembran med 200 nm porestørrelse (andre porestørrelse som er tilgjengelige, 100 nm eller 400 nm) og en kommersiell enhet 26 ekstrudering.
        Merk: For tiden er det to ekstruder anordninger kommersielt tilgjengelige: en manuell ekstruder er tilgjengelig for små volumer (200 ul til noen få ml). I dette tilfellet, blir prøven ekstrudert gjennom membranen ved manuelt å skyve suspensjon frem og tilbake mellom to sprøyter. Avhengig av produsenten, ville lipid alikvoter må kombineres for å oppnå minimumsvolum av oppsettet. For større volumer (opptil 50 ml) mer avanserte innretninger brukes i hvilken suspensjonen tvinges gjennom polykarbonatmembran ved hjelp av komprimert gass. Set-up og ekstruderingsbetingelser kan endres i henhold til model. Se instruksjonene fra produsenten før bruk. Denne protokollen refererer til den manuelle ekstruderen for små volumer.
      6. Ekvilibrere ekstruderen i vann, ved å føre vann gjennom ekstruderen. Fordyp membranen i vann.
      7. Plasser membranen mellom de to stempler, montere enheten og likevekt i buffer, ved å føre bufferen gjennom ekstruderen, fra en sprøyte til den andre. I dette trinnet kan også teste leakiness av systemet. Hvis det lekker, demontere og montere det igjen endrer membranen.
      8. Ta lipid suspensjonen med en sprøyte av ekstruder ("skitne side ').
      9. Fest sprøyten inneholdende lipid suspensjonen på den ene kammer og den tomme sprøyten på den motstående kammer.
      10. Press sprøyten i den ene enden. Passere løsningen gjennom membranen og inn i det motstående sprøyten. Dette er en st pass.
      11. Passerer det gjennom membranen for totalt 31 ganger slikeat løsningen ender opp på motstander sprøyten ("ren side").
        Merk: Kontroller membranen etter ekstrudering. Hvis det var ødelagt, så ekstrusjonsprosess var ikke vellykket, og må gjentas.
      12. Tømme sprøyten inn i en liten tube. Store unilamellære vesikler (LUV'er) er stabile i 1-2 dager hvis de oppbevares ved 4 ° C.
  3. Utarbeidelse av Mica og Dekk
    1. Vask Dekk først i vann og deretter i etanol. Lufttørke.
    2. Ta glimmer plater og skrelle av det ytterste laget med tape.
    3. Fest glimmer platen på dekkglass. Transparente optiske lim er optimale, slik at man kan kontrollere dobbeltlag med et fluorescensmikroskop.
    4. Fest plastflasker (2,5 cm ytre diameter, 2 cm indre diameter og 0,5 cm høyde) med optisk lim / fett. Sørg for at alt er tett, og at det ikke er noen lekkasjer. Bruk fett når du ønsker å gjenbruke sylindrene som de lett kan løsnes fra the dekkglass og vasket. Dimensjonene av plastsylindre avhenge av størrelsen på AFM cantilever holderen og bør justeres tilsvarende.
  4. Nedfall av unilamellære vesikler på Solid Support
    1. Pipetter hele liposomoppløsningen direkte på glimmer. Tilsett mer SLB-buffer for å oppnå et volum på 300 ul.
    2. Legg 0,9 ul 1 M kalsiumklorid-løsning for å nå en sluttkonsentrasjon på 3 mM Ca2 +.
    3. Inkuber ved 37 ° C i 2 minutter og deretter ved 65 ° C i minst 10 min. Dekk alltid de bilagene med buffer. Kontakt med luft og luftbobler vil ødelegge det. I løpet av inkubasjonen, tilsett mer buffer om nødvendig, spesielt hvis inkubering ved høyere temperaturer.
      Merk: inkubasjonstemperaturer variere i henhold til de lipidblandinger og faser som kreves. Inkubasjonstid på minst 10 minutter er nødvendig for å danne støtte bilag, men det kan være lengre, avhengig av temperatur og sammensetning.
    4. Vaskbilaget med varmt (65 ° C) SLB-buffer 15 til 20 ganger for å fjerne kalsium og usammensmeltede vesikler. Vær ekstra forsiktig under vaske skritt for å holde bilaget henhold buffer og forsiktig pipettér vaske løsning for å unngå å ødelegge bilaget.
    5. Cool støttede bilag til romtemperatur før AFM målinger. Dette er nødvendig for å danne de forskjellige faser av membranen, samt minimalisere termisk drift i apparatet.

2. Atomic Force Mikros Målinger 11,12

  1. Imaging
    Merk: Utfør atomic force mikroskopi bildebehandling i kontakt modus eller banke-modus. Bilde støttet bilag i løsningen; tillater ikke løsningen å fordampe helt da dette vil ødelegge bilagene. Som man ville jobbe med buffer, følg sikkerhetsanvisningene i å sørge for at eventuelle AFM delen er beskyttet mot væskesøl.
    1. Velg en myk cantilever (under 0,2 N / m fjærkonstant anbefales) og montere den til than AFM. Valget av cantilever stivhet er mer kritisk for kraft-spektroskopi (og dette vil bli diskutert senere).
    2. Monter prøven på AFM scenen og sørge for at alle vibrasjons isolasjon modulene er slått på. Vent i minst 15 minutter for å stabilisere og redusere termisk drift av systemet. Avhengig av AFM set-up, kan tuning og bilde spesifikasjonene variere. Rådfør produsentens håndbok.
    3. Nærme prøven med AFM tips til kontakt.
    4. Siden lipidbilag er vanligvis 4 nm i høyden, bruker Z-spekter av instrumentet som vil gi den høyeste z-oppløsning (for eksempel 1,5 um).
    5. Velg en region til bilde. For å få en oversikt over lipidbilaget, en 50 mikrometer x 50 mikrometer eller 25 mikrometer x 25 mikrometer regionen vil være et godt utgangspunkt for å image. Hvis mindre funksjoner vises, kan man bildet i mindre områder (10 mikrometer x 10 mm, eller 2 mikrometer x 2 mikrometer). Valget av avbildningsområdet avhenger også av arbeids range av den piezoelektriske skanneren. Vennligst ta kontakt med instrumentet manual for dette.
    6. Som bilag er svært skjør, justere settpunktet for AFM spissen under bildebehandling for å holde styrken på minimum og riktig for termisk drift, og samtidig opprettholde kontakt med prøven. Ved kontakt-modus, minimalinnstillingspunktet. I tappe modus, maksimere settpunktet.
    7. Behandle bilder ved å montere hver skanning linje til polynomfunksjoner utjevning. Utfør linje fjerning for skanninger som mister kontakt med membranen bruker proprietær programvare på AFM produksjonsbedrift.
  2. Force spektroskopi
    1. Kalibrere cantilever følge instruksjonene i henhold til produsentens protokoll. Kalibreringen tillater omdannelse av det elektriske signalet fra fotodiodene i kraft (figur 1B).
      1. Kalibrer s tuppen følsomhet for å måle avbøyning som z-piezo bevegelse (i enheter av lengde) i stedet for elektriske signaler i volt.
      2. Beregn cantilever våren konstant hjelp av termisk frekvensstøy metode, vanligvis innlemmet i AFM programvare. I denne metoden, plotte vibrasjonsamplituden fra støyen i forhold til svingningsfrekvensen for å skape en kraft spektraltetthet plot. Dette plottet viser en topp rundt resonansfrekvensen. Frekvensen der amplitude jegs den største er resonansfrekvensen. Monter en Lorentzian funksjon rundt toppen for å automatisk beregne fjærkonstant av programvaren. Noen nyttige ressurser for teorien om termisk støy metoden er gitt i referanser 27-30.
    2. Etter å avbilde et område av bilaget, velger en 5 um x 5 mikrometer region i bilaget til å utføre kraft spektroskopi.
    3. Sett opp AFM, slik at det tar kraft kurver i en 16 x 16 rutenett av den regionen. Dette resulterer i 256 force kurver per region. Mellomrommet mellom to nabopunkter bør være nok til å unngå at membranen området blir analysert ved et punkt ville falle sammen med den neste punkt. Dette er avhengig av tannradius. En 100 nm avstand mellom to punkter ville være ideelt. Fordel 5 mikrometer x 5 mikrometer regionen inn i 16 x 16 rutenett. Avhengig av størrelsen av fasen kan man velge et mindre eller større område, og deretter justere rutestørrelsen tilsvarende.
    4. Satt z-piezo forskyvning til400 nm. Dette bestemmer maksimal rekkevidde på bevegelse av z-piezo. Det bør være stor nok til å sørge for at cantilever har fullstendig trukket bort fra prøven i mellom målingene.
    5. Still tilnærming hastighet til 800 nm / sek og trekke hastighet til 200 nm / sek. Bruke en tilnærming hastighet mellom 400 til 6000 nm / sek, avhengig av sammensetning og bilags lipidfase som skal studeres 6,16.
    6. Etter å ha satt opp alle parametrene, erverve force kurver, ved å trykke på "run" knappen på AFM programvare.
    7. Lagre kraftkurver som kraft vs. høydekurver (et mål på z-piezo bevegelse). Dette tar ikke hensyn til bøyning av braket når den er i kontakt med prøven. I løpet av dataprosesseringstrinnet, gjør det mulig for programvaren AFM korreksjon for cantilever bøye å få kraft vs. tip-prøven separasjons kurver (figur 1C), som vil gi riktige verdier for dobbeltlag tykkelse. Korreksjonsverdiene er vanligvis innarbeidet i calibrasjon, som er lagret med hver kraft kurve. Beregn tip-prøveseparasjon ved å subtrahere den vertikale avbøyning fra piezo-bevegelse i et gitt punkt.
      Merk: topp i tilnærmingen kraft kurven (den kraftverdi går ned selv om cantilever bevegelsen er fortsatt på tilnærming syklus) er gjennombruddet kraften av membranen, mens forskjellen mellom posisjonen av denne topp og posisjonen til punktet hvor kraften begynner å stige opp igjen gir tykkelsen av membranen.
    8. Anskaffe minst 500 force kurver for hver betingelse for å få god statistikk. Plotte et histogram av verdiene ved å bruke programmer som Origin eller Matlab, og passer histogrammene til en Gaussisk fordeling for å få topp og bredde av fordelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Støttede lipidbilag sammensatt av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ble fotografert i AFM (figur 2 AC). På grunn av lipidsammensetningen, ble SM / Chol-rik L o, og DOPC-rike L d faser observert. Høyden profil fra AFM avbildning kan gi viktig informasjon om membranstruktur. Ved å se på høydeprofil, kan den to-lags tykkelse måles i nærvær av defekter i membranen (figur 2B), eller forskjellen i høyde mellom de L O / L D-faser kan gis. I tillegg gir AFM å spesifikt utvalgte regioner representerer disse fasene og analysere deres mekaniske egenskaper ved hjelp av kraft-spektroskopi (Figur 2 D - F). Kraftkurver avledet fra kraft-spektroskopi-modus blir brukt til å måle den kraft gjennombrudd ved å finne den kraftverdi på toppen av kraftkurven (figur 2D og E), og den Membrane tykkelse ved å trekke avstandsverdien fra toppen av kraften kurven til avstandsverdien når kraften kurven begynner å stige igjen (figur 2D og F).

Sensitiviteten av AFM-målinger er avhengig av piezoelektrisk materiale og elektroniske tilbakekoblingssløyfer. Som sådan, før du gjør eksperimenter, er det viktig å bli kjent med AFM satt opp. Det finnes to vanlig instrument satt opp for de piezoelektriske materialer: (1) tube skanner i hvilken prøven plasseres på toppen av det piezo-elektrisk materiale, og prøven blir skannet på en ubevegelig spiss; eller (2) utbøyning-trinn hvor spissen er montert på det piezoelektriske materialet i stedet for prøven. I det sistnevnte tilfelle blir det piezoelektriske materialet og annen elektronikk beskyttet mot søl. Mange AFM modeller for biologiske programmer har denne konfigurasjonen.

Under avbildning, kan AFM spiss mister kontakt med prøven, og føre til feilaktige megasurements. Avhengig av hvor mange skanninger er tapt, kan bildet bli korrigert ved å fjerne skannelinjer og bruker en gjennomsnittlig intensitet filter for å avlede de nye verdiene fra nærområdet (figur 3). Men i de fleste tilfeller, ikke dette gi et godt bilde, og det anbefales å bare forkaste bildet. Det er andre gjenstander som må overvåkes. Disse oppstår fra butte / skadet / skitne tips samt diffraksjon av laserpunktet bak cantilever 31. I slike tilfeller bør bildene bli forkastet og AFM spissen bør byttes ut.

Under kraftspektroskopi-målinger, kan flere utfordringer oppstår: (1) fraværet av topper (figur 4A), (2) nærvær av skuldrene i stedet for godt definerte topper (figur 4b), (3) en liten økning og påfølgende plateauing ved svært lave krefter (Figur 4C - D). Fraværet av en topp kan tilskrives måling i en region uten en bilAyer eller til oppkjøp forholdene ikke blir optimalisert. Det anbefales at en AFM bilde er ervervet før du gjør kraft spektroskopi for å være sikker på at bilaget er faktisk blir målt. Oppkjøps forhold samt tippe / cantilever spesifikasjoner påvirke sannsynligheten for et gjennombrudd event 17. En skarpere spissen kan enkelt punktere et bilag, som sådan, kan gjennombruddet kraft vises lav eller ikke vises i det hele tatt fordi det er under støynivået. . Øke tilnærming hastigheten øker også gjennombrudd kraft 16. Som bilaget blir presset av spissen, er lipidmolekyler også reagere til å avgi denne kraften. Ved en lavere tilnærming hastighet, har det ytre lipid bilaget nok tid til å stabilisere seg før det neste trinnet i kraft, og dette øker sannsynligheten for at et gjennombrudd hendelse kan skje. Ved en høyere hastighet tilnærming, kraftamper raskere enn reaksjonen av lipider og, som sådan, er sannsynligheten for et gjennombrudd arrangement er lavere ved samme kraft. Det er possusynlige at ved å bruke høy tilnærming hastighet, er settpunktet nås før bilaget pauser resulterer i ingen observer topper. Det finnes ingen rapporter å forklare utseendet skuldre på kurven, men vi postulere at det kan være grunn til materialet kompresjon før gjennombruddet. Videre kan et platå eller brede topper ved meget lave krefter indikere tilstedeværelse av smuss eller løs lipidmateriale i tuppen. Tips kan samle seg skitt og lipidic materiale i span av flere målinger. Smuss og materiale festet til tuppen gjør det butt, og dermed øke styrken gjennombrudd.

Det anbefales at kraft kurvene er kjøpt i ulike områder dersom disse utfordringene oppstår. En annen anbefaling er å endre tips (dette vil kreve rekalibrering). Endelig kan tilnærmingen hastigheten må justeres eller bruk av en spiss med forskjellige spesifikasjoner (neseradius og stivhet) kan vurderes. Gjennombruddet kraft varierer mellom 0-50 Nn 6, som sådan, tHan fjærkonstant av braket kan være i området fra 0,05 til 0,7 N / m. De fleste kommersielle bommene har en nominell tips radius rundt 20-40 nm. I stedet for å bruke konvensjonelle tips, kan tipless bommene også kjøpes og kuler med kjent radius (som vanligvis er monodisperse i størrelsesfordeling) kan festes til dem. For å få reproduserbare data, alltid bruke de samme oppkjøps forhold og cantilever spesifikasjoner for det samme settet med eksperimenter.

Figur 1
Figur 1: Principles of Force spektroskopi (A) Sekvens av tilnærming-tilbaketrekking av cantilever fra prøven.. Den røde linjen viser cantilever nedbøyning fra sin likevektsposisjon (svart linje). (B) Cantilever kalibrerings konverterer elektrisk signal (i volt) å tvinge (i Newton). Ved kjøp av cantilever sensivitet og fjærkonstant vertikal defleksjon (i volt) omdannes til avstand og avstanden i kraft ved hjelp av Hookes lov. (C) Ved kontakt i kraft spektroskopi målinger, ikke z-piezo skanning bevegelsen tar ikke hensyn til cantilever bøying. En korreksjon for dette kan gjøres ved å subtrahere den vertikale avbøyning, x (i avstandsenheter) fra z-piezo bevegelse, z (også i avstandsenheter). På denne måten, kan den faktiske tip-prøven separasjon, i stedet for bare z-piezo bevegelse kan bli rapportert, som er en mer nøyaktig måling av avstander og er viktig for å måle tykkelsen på prøven.

Figur 2
Fig. 2: AFM av SLBs (A) Reaksjonsskjema for SLBs sammensatt av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) skilte seg i flytende uordnede (L d) og væske (L bestilte o) faser. (B (C) tilsvarer den gule firkanten i B (10 um x 10 um). L o og L d faser er merket. Linjen profil nedenfor tilsvarer den gule linje i bildet. L o fasen synes 1-2 nm høyere enn L d fasen. (D) En prøve kraft kurve som viser hvordan gjennombrudd kraft og membrantykkelsen er utledet. (E) Gjennombrudd kraft og (F) membrantykkelse fordeling for L D- og L-o faser med Gaussian passende for kvantifisering.

Figur 3
Figur 3: Tap av kontakt under bildebehandling fører til. skannelinjer som ikke svarer til resten av bildet En støttet dobbeltlag bestående av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) med tap av kontakt i enkelte linjeavsøkinger. Scale bar 2 mikrometer.

Figur 4
Figur 4:. Utfordringer i Force spektroskopi (A) Noen force kurver vil ikke ha noen topper. (B) Kurven kan ha skuldrene i stedet for veldefinerte topper. (C) Etter en liten økning et platå kan forekomme i fravær av toppen. (D) Utseende av et platå sammen med en godt definert topp.

Membran region Gjennombrudd Force (NN) Membrantykkelse (nm)
L d fase 6 ± 1 4.7 &# 177; 0.5
L o fase 8 ± 1 6 ± 1

Tabell 1: Membran egenskaper av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBs L d fasen har et gjennombrudd kraft på 6 ± 1 nN og en tykkelse på 4,7 ± 0,5 nm. L o har 8 ± 1 nN og en tykkelse på 6 ± 1 nm. Høydeforskjellen mellom de to fasene er 2 ± 1.4 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SLBs sammensatt av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ble dannet på glimmer etter vesikkel adsorpsjon og brudd fremkalt av kalsiumklorid. Denne lipidsammensetning separeres i D- og L L o faser. L o Fasen anriket på sphingomyelin og kolesterol, og er mindre væske / mer viskøst (figur 1A) enn L d fasen 11. Separasjonen av L o L d fra fase manifesterer seg som sirkelformede strukturer hevet over den omgivende (figur 1 B, C). Plattformene er de L o faser omgitt av L d faser. Membranfeil (eller hull i membranen) er også sett (figur 1B, blå pil) og en høydeprofil over denne defekten viser tykkelsen av bilaget. L d / L o høydeforskjellen kan også undersøkes ved å se på en AFM høydeprofil (figur 1C).

Fremstillingen av lipidblandingen er meget viktig fordi den bestemmer sammensetningen bilaget egenskaper. Under fremstillingen av den bårede bilaget, er det viktig å arbeide ved de angitte temperaturer for riktig dannelse av lipid-faser (trinn 1.4.5). Under avbildning, å holde en lav kraft er meget viktig for ikke å ødelegge dobbeltlaget og ikke samle skitt på spissen.

Etter AFM bildebehandling, er deler av SLB valgt og analysert ved hjelp av kraft spektroskopi. Force spektroskopi tillater oss å undersøke andre egenskaper hos membranen, spesielt gjennombrudd kraft (Fig 1 D). L D og L o fasene viser ulike gjennombrudd kraft og tykkelse (figur 1E, F). Egenskapene er sammenfattet i tabell 1. Vi ser at i forhold til Chiantia et al. 11, ble tilsvarende verdier for gjennombrudd kraft i L d fasen oppnådd, men en lavere verdi for L-O-fase. Dette kan blipå grunn av lavere mengder kolesterol som brukes i våre membraner (vi brukte DOPC: SM: Chol-forholdet 2: 2: 1, mens de anvendt på 1,5: 1,5: 1). Dette viser også viktigheten av å blande rett lipidforhold - en kritisk faktor i reproduserbarhet av resultater. Videre bruk av ulike lipider (kjedelengde og grad av umettethet) endrer også bilags egenskaper 6,15,18.

Mens plotting fordelingen av krefter gjennombrudd er nyttig og kan allerede viser forskjeller i bilaget egenskaper, kan videre analyse av gjennombrudd kraftfordelingen bli brukt til å utlede andre mekaniske egenskaper inkludert linestrekk og spredningstrykk 11,17,21. I korthet er sannsynligheten P (F) for å måle en viss gjennombrudd kraft, F, beskrevet av kontinuum nukleasjon modell 11,15,17:

Ligning 1

der A er Resonance frekvens av braket, K er fjærkonstanten av braket, v er hastigheten av tilnærming, er Γ det linestrekk (kanten energi som kreves for å holde et hull i membranen åpen), R er radien av AFM spissen, k er Boltzmanns konstant B er, T er temperatur, og S er spredningstrykket eller energi ved å lukke hullet (motsatt av membranen spenning - den energien som trengs for å bli utøvet av membranen for å åpne et hull 32). Denne ligningen kan integreres og dP / dF kan beregnes som:

Ligning 2

A, K, R er egenskaper ved AFM cantilever / tips som kan være ervervet gjennom cantilever kalibrering. T og V er eksperimentelle parametere som bør holdes konstant gjennom forsøkene. dP / dF blir så satt på histogrammet for å erverve linestrekk og spredningstrykket. Som flere parametre som påvirker P (f), experimentalists rådes til å bruke lignende tips og oppkjøps forhold til å ha sammenlignbare verdier for linestrekk og spre press. Forurensning av AFM spissen (herunder skitt og usammensmeltede blemmer på ervervet under bilde tip) fører til ikke-reproduserbare resultater. Videre er valget av støtte påvirker de mekaniske egenskapene til membranen 20.

En annen teknikk som kan karakterisere mekaniske egenskapene lipidbilag er mikropipette aspirasjon av gigantiske unilamellære vesikler (GUVs) 33. I denne teknikk blir membranen strekk beregnes ut fra deformasjonen av GUVs under aspirasjon. Videre, ved å øke suge, kan man beregne spenningen ved hvilken Guv brister (eller lysis spenningen) 34, som kan være relatert til det linestrekk i kontinuiteten kjernemodellen. En ulempe med denne teknikk er kompleksiteten av membranspenningen for å beregne faseskillemembraner, som de forskjellige phases har ulike mekaniske egenskaper 35. Dette er i motsetning til AFM kraft-spektroskopi, hvor de enkelte faser kan karakteriseres separat. Videre, mens mange GUVs er nødvendig for å produsere statistisk relevante resultater kan AFM frembringe en fordeling pr SLB. Imidlertid er membran ombygging effekter (f.eks, tubulation og invaginations) lettere visualisert med GUVs, noe som gjør dem bedre systemer for å karakterisere disse formrelaterte effekter sammen med mekaniske egenskaper.

I ytterligere anvendelser for å studere effektene av membranproteiner på dobbeltlag-egenskaper kan rensede proteiner bli inkorporert i disse vesikler til å gjøre proteoliposomes. En teknikk for å gjøre dette bruker vaskemidler til å hjelpe proteinene å stabilisere og sette inn i membranen. Påfølgende rensing via dialyse eller størrelseseksklusjonskromatografi fjerner frie proteiner og vaskemiddel i oppløsning 36. En annen tilnærming krever merking avde rensede proteiner (for eksempel Histidin eller streptavidin tags) og omfatter tilhørighet partnere for denne koden i liposomer (med nikkel-nitriloacetic syre (Ni-NTA) eller biotinylerte lipider).

Oppsummert har vi beskrevet en metode for å analysere lipid bilag. På grunn av sin høye oppløsning, kan AFM avsløre sub-mikrometer strukturer i membranen, som inkluderer lipid faser blant andre. Force spektroskopi, her anvendt for å karakterisere lipidmembraner, kan også brukes på membran proteiner og andre biomolekyler på membranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Max Planck Society, den tyske Cancer Research Center, University of Tübingen, og Bundesministerium für Bildung und Forschung (gi nr. 0312040).

Vi takker Eduard Hermann for å hjelpe oss med automat analysen av styrken kurven data og Dr. Jakob Suckale for forsiktig tolkning av dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
  3. Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
  4. Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
  5. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
  6. Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  7. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  8. Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
  11. Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
  12. Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
  13. Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
  14. Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
  15. Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
  16. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
  17. Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
  18. Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
  19. Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
  20. Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
  21. García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
  22. Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
  23. Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
  24. Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
  25. Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  26. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
  27. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
  28. Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
  29. Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
  30. Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
  31. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
  32. Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
  33. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
  34. Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
  35. Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
  36. Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).

Tags

Bioteknologi støttet lipidbilag atomic force mikroskopi kraft spektroskopi lipid flåter flytende bestilt fase gjennombrudd kraft lipidmembraner
Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Unsay, J. D., Cosentino, K.,… More

Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter