Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Introduction

Atomkraftsmikroskopi (AFM) alstrar en bild av en yta genom att skanna över ett område av provet under användning av en fribärande med en mycket vass spets ^1. Förflyttningen av fribärande sonder ytan topologi av provet. AFM har i stor utsträckning till biologiska molekyler - inklusive proteiner, DNA och membran, på grund av sin mångsidighet i att analysera fasta prover i luften eller i närheten av infödda tillstånd i flytande ^2-5.

Bortsett från sin höga upplösning avbildning förmåga i nanometerområdet, fungerar AFM fribärande som en fjäder för att undersöka interaktionskrafter (vidhäftning och repulsion) och mekaniska egenskaper hos provet ^5,6. Detta kallas kraft spektroskopi. I det här läget, sonden först närmar provet och utövar en kraft på den och sedan dras tillbaka tills den förlorar kontakt med provet (Figur 1A). De genererade kurvor visar kraft som en funktion av avståndet av konsolen för både appenmört och indragning. Flera egenskaper inkluderande elasticitetsmodulen för att mäta styvheten hos ett material, och adhesionskrafter kan härledas.

Stödda lipiddubbelskikt är biologiska modellmembran som ligger på toppen av en fast bärare - vanligtvis glimmer, borsilikatglas, kvartsglas, eller oxiderad kisel ^7. De framställs med hjälp av olika tekniker som vesikler nedfall, Langmuir-Blodgett metod och spin-beläggning ^8,9. AFM avbildning har använts för att följa bildningen av dessa uppburna dubbelskikt ^10, och sond olika strukturer bildade genom membran av olika kompositioner ^11-15.

Utföra kraft spektroskopi på stöd dubbelskikt resulterar i en topp i kurvan tillvägagångssättet. Denna topp indikerar den kraft som behövs för att genomtränga tvåskiktsmembran, och kallas genombrotts kraft. Dubbelskiktet tjocklek kan även mätas med hjälp av kraftkurvan ^6. Den typiska genombrott kraft dubbelskiktintervall mellan 1-50 NN ^6. Dessa egenskaper beror på lipid packning (vätska eller gelfas) och struktur (acylkedja längd och omättnadsgrad) och förändras av membranaktiva medel ^16. Teorin bakom bristning har förklarats ¹⁷ och andra experimentella parametrar såsom fribärande mjukhet, spetsradie och ingångshastighet påverkar också genombrottskraften ^15,16,18. Force-spektroskopi har använts för att analysera egenskaper hos olika lipidfaser ^11,19, sammansättning beroende förändringar ^12,20, liksom effekterna av andra biomolekyler, såsom peptider, på stabiliteten hos membranet ^21.

Den platta orienteringen av dubbelskikt som stöds är fördelaktig för att kombinera AFM med andra metoder, såsom ytplasmonresonans ²² och fluorescensmikroskopi ^11,19 för att bättre karakterisera strukturen och egenskaperna hos membranen.

Denna detaljerade video protocol syftar till att förbereda stöds lipiddubbelskikt använder blåsavsättning och analysera dem med AFM och kraft spektroskopi. Medan vesiklar av olika storlekar kan användas för att framställa dubbelskikt, fokuserar detta protokoll på små och stora unilamellära vesiklar. Biskikten stöds att fasseparera i vätske beställt (L _o) och flytande oordnade (L _d) faserna kännetecknas ^11,15. Membranet är sammansatt av di-oleoyl-fosfatidylkolin (DOPC), sfingomyelin (SM), och kolesterol (Chol) vid 2: 2: 1-förhållande. Denna sammansättning modeller från lipidaggregat, som föreslås att bete sig som plattformar som är viktiga för protein trafficking och sortering, cellsignalering och andra cellulära processer ^23,24.

Protocol

1. Framställning av stöds lipiddubbelskikt (SLB) ^11,12,21

1. Framställning av lipidblandning och Multilamellära vesikel Suspensioner
   1. Bered följande buffertar i förväg.
      1. Bered PBS-buffert vid koncentrationer av 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO _4, 8 mM Na ₂ HPO _4, och 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Förbered SLB (stöds lipiddubbelskikt) buffert vid koncentrationer av 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Framställ en lösning av 1 M _CaCl2.
   2. Lös följande lipider i kloroform vid en önskad koncentration: till exempel di-oleoyl-fosfatidylkolin (DOPC) på 25 mg / ml, sfingomyelin (SM) vid 25 mg / ml och kolesterol (Chol) vid 10 mg / ml.
   3. Ta 18.38 il DOPC, 17.10 il SM och 11.30 il Chol att göra en lösning med 1 mg av totala lipider i en 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol molförhållande. Variera volymer följaktligen baserad på concentrations av lipider framställda i 1.1.2. Dock upprätthålla molförhållandet vid 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, som att ändra det molära förhållandet kommer att ändra fasegenskaperna hos membranet ^25.
   4. Blanda lösningen fullständigt genom att vortexa. Lägg ett fluorescerande lipidisk färgämnet vid 0,05 mol-% om man önskar att visualisera dubbelskiktet genom ett fluorescensmikroskop.
      Obs: Familjen av långkedjiga dialkylcarbocyanines, liksom DiD, Dil och DiO spänner över ett brett intervall av våglängder och kan idealt användas för att märka lipidmembran. Alternativt kan fluorescerande lipider, såsom rodamin-fosfatidyletanolamin eller BODIPY-kolesterol användas. I varje fall bör koncentrationen av färgämnet optimeras enligt inställningen mikroskopi, med tanke på att höga koncentrationer av fluoroforen bunden till lipiden kan ändra lipid beteende ^19.
   5. Torka av kloroform med användning av N _2-gas (eller någon tillgänglig inert gas såsom Ar och He).
   6. Ytterligare torr than lipidblandning under vakuum under åtminstone en timme.
      Obs: Om lagring av denna lipidblandning, rensa luften med inert gas _(N2, Ar eller He) och förvara vid -20 ° C. Alikvotera överskott lipider-i-kloroform i små bruna flaskor. Torka dem på ett liknande sätt som lipidblandningen, förskjuta luft med inert gas _(N2, Ar eller He) och förvara vid -20 ° C.
   7. Lös de torkade lipiderna i PBS-buffert till en koncentration av 10 mg / ml.
   8. Vortex blandningen kraftigt i ca 20 sek till 1 min för att få en grumlig suspension, innehållande multilamellära vesiklar. Se till att det inte finns några lipidfilmer klibbar till sidorna av kärlet.
   9. Fördela denna suspension i 10 pl portioner (1 mg lipid gör 10 portioner).
   10. Förvara vid -20 ° C tills vidare användning.
2. Framställning av unilamellära vesiklar
   Notera: Olika storlekar av unilamellära vesiklar kan framställas med användning av sonikering metod eller strängsprutningsmetod. Sonikering använder sound energi för att omröra blandningen och separera skikten av den multilamellära suspensionen. Detta indikeras genom att rensa upp i den dimmiga fjädring. Extrudering tvingar multilamellära vesiklar att passera genom ett membranfilter med en bestämd porstorlek.
   1. Sonication Metod
      1. Ta 10 il multilamellära lipidsuspensioner och tillsätt 150 pl SLB buffert.
      2. Överför blandningen i små (2 ml) tillslutna glasflaskor och försegla med Parafilm.
      3. Sonikera blandningen vid rumstemperatur i en badsonikator för 10 min eller tills det blir klart för att ge små unilamellära vesiklar (SUV, under 50 nm i diameter).
   2. Extrudering Metod
      1. Ta 10 il multilamellära lipidsuspensioner och tillsätt 150 pl SLB buffert.
      2. Överför suspensionen i en kryogen rör.
      3. Freeze lipidsuspensionen genom att sänka ned den kryogena röret under några sekunder i flytande kväve.
      4. Tinalipidsuspension genom nedsänkning den kryogena röret i ett vattenbad vid rumstemperatur eller 37 ° C under några minuter. Upprepa frys-tö steg åtminstone 10 gånger.
      5. För att pressa lipidsuspensionen använda ett polykarbonatmembran med 200 nm porstorlek (andra porstorlekar finns liknande, 100 nm eller 400 nm) och en kommersiell extrudering anordning ^26.
         Obs: För närvarande finns det två strängsprut enheter kommersiellt tillgängliga: en manuell extruder är tillgänglig för små volymer (200 mikroliter till några ml). I detta fall är provet extruderades genom membranet genom att manuellt trycka på suspensionen fram och tillbaka mellan två sprutor. Beroende på tillverkaren, skulle lipid portioner måste kombineras för att nå minimivolym av inrättandet. För större volymer (upp till 50 ml) mer sofistikerade enheter används i vilka suspensionen tvingas genom polykarbonatmembran med komprimerad gas. Set-up och extrudering förhållanden kan ändras beroende på model. Se instruktionerna från tillverkaren innan användning. Detta protokoll avser den manuell extruder för små volymer.
      6. Jämvikta extrudern i vatten genom att leda vatten genom extrudern. Sänk membranet i vatten.
      7. Placera membranet mellan de två kolvarna, montera anordningen och jämvikt i buffert, genom att passera bufferten genom strängsprutmaskinen, från en spruta till den andra. Detta steg gör dessutom testa läckage av systemet. Om det läcker, ta isär och sätta ihop den igen ändra membranet.
      8. Ta lipidsuspensionen med användning en spruta av strängsprutmaskinen ("smutsig sida").
      9. Fäst sprutan innehåller lipidsuspensionen på en kammare och den tomma sprutan på den motsatta kammaren.
      10. Skjut sprutan i ena änden. Passera lösningen genom membranet och in i den motstående sprutan. Detta är den ^{1: a} pass.
      11. Passa genom membranet för totalt 31 gånger sådanaatt lösningen hamnar på den motstående spruta ("rena sidan").
          Obs: Kontrollera membranet efter extrudering. Om det var bruten, sedan extruderingsprocessen var inte framgångsrik och måste upprepas.
      12. Töm sprutan i ett litet rör. Stora unilamellära vesiklar (LUV) är stabila i 1-2 dagar om den förvaras vid 4 ° C.
3. Framställning av Mica och Täck
   1. Tvätta täckglas först i vatten och sedan i etanol. Lufttorka.
   2. Ta glimmerskivor och dra av det yttre lagret med tejp.
   3. Fäst glimmer skiva i täck. Transparent optiska lim är optimala så att man kan kontrollera de dubbla skikten med ett fluorescensmikroskop.
   4. Fäst plastcylindrar (2,5 cm ytterdiameter, 2 cm inre diameter och 0,5 cm höjd) med optisk lim / fett. Försäkra dig om att allt är tät och att det inte finns några läckor. Använd fett när man vill återanvända cylindrarna eftersom de lätt kan tas loss från the täck och tvättas. Måtten för de plastcylindrar beroende på storleken av AFM fribärande hållaren och bör anpassas därefter.
4. Deponering av unilamellära vesiklar på Solid Support
   1. Pipet hela liposomlösningen direkt på glimmer. Tillsätt mer SLB buffert för att nå en volym på 300 pl.
   2. Lägg 0,9 pl 1 M kalciumkloridlösning för att nå en slutlig koncentration av 3 mM Ca2 ^+.
   3. Inkubera vid 37 ° C under 2 minuter och därefter vid 65 ° C under minst 10 minuter. Täck alltid dubbelskikten med buffert. Kontakt med luft och luftbubblor kommer att förstöra det. Under inkubationen, tillsätt mer buffert om så är nödvändigt, speciellt om inkubering vid högre temperaturer.
      Obs: Inkubationstemperaturer variera beroende på de lipidblandningar och faser som krävs. Behövs inkubationstid på åtminstone 10 min för att bilda dubbelskikt som stöds, men det skulle kunna vara längre, beroende på temperaturen och kompositionen.
   4. Tvättadubbelskiktet med varmt (65 ° C) SLB-buffert 15-20 gånger för att avlägsna kalcium och ofuserade vesiklar. Var extra försiktig under tvättningsstegen för att hålla biskiktet i buffert och försiktigt pipettera tvättlösningen för att undvika att förstöra biskiktet.
   5. Cool stöds biskikt till rumstemperatur före AFM mätningar. Detta behövs för att bilda de olika faserna av membranet samt minimera termisk drift i instrumentet.

2. atomkraftsmikroskopi Mätningar ^11,12

1. Imaging
   Obs: Utför atomkraftsmikroskopi avbildning i kontakt läge eller knacka läge. Bild stöds biskikten i lösning; tillåter inte lösningen avdunsta helt eftersom detta kommer att förstöra de dubbla skikten. Som man skulle arbeta med buffert, observera säkerhetsåtgärder för att se till att alla AFM del är skyddad från vätskespill.
   1. Välj en mjuk fribärande (under 0,2 N / m fjäderkonstant rekommenderas) och montera den till than AFM. Valet av fribärande styvhet är mer kritisk för kraftspektroskopi (och detta kommer att diskuteras senare).
   2. Montera provet på AFM scenen och se till att alla vibrationsisoleringsmoduler är påslagna. Vänta åtminstone 15 minuter för att ekvilibrera och minska termisk drift av systemet. Beroende på AFM set-up, kan tuning och avbildnings specifikationer variera. Rådfråga tillverkarens handbok.
   3. Närma provet med AFM spets tills kontakt.
   4. Eftersom lipiddubbelskikt är vanligtvis 4 nm i höjd, använd Z-området för instrument som kommer att ge den högsta z-upplösning (till exempel 1,5 pm).
   5. Välj en region till bilden. För att få en överblick över lipiddubbelskiktet, en 50 | im x 50 um eller 25 um x 25 um-regionen kommer att vara en god utgångspunkt för att avbilda. Om mindre funktioner visas, man kan bild i mindre områden (10 um x 10 um, eller 2 pm x 2 pm). Valet av avbildningsområdet beror också på arbets range av den piezoelektriska scannern. Rådgör instrumentets manual för detta.
   6. Som dubbelskikt är mycket bräckliga, justera börvärdet AFM spets under avbildning att hålla kraften vid minsta och korrigera för termisk drift, utan att förlora kontakten med provet. I kontaktläget minimera börvärdet. I knacka läget maximera börvärdet.
   7. Process bilder genom att montera varje sveplinje till polynom utjämning funktioner. Utför linje borttagning för genomsökningar som förlorar kontakt med membranet med hjälp av den egenutvecklade programvaran i AFM tillverkande företaget.
2. Force spektroskopi
   1. Kalibrera fribärande följa instruktionerna enligt tillverkarens protokoll. Kalibreringen tillåter omvandling av den elektriska signalen av fotodioder att tvinga (Figur 1B).
      1. Kalibrera spetsen känslighet för att mäta böjning som z-piezo rörelse (i enheten längd) i stället för elektriska signalen i volt.
         
      2. Beräkna fribärande fjäderkonstanten använder brusfrekvensmetoden termisk, vanligen ingår i AFM programvara. I denna metod, plotta vibrationsamplituden från brus med avseende på svängningsfrekvens, vilket skapar en spektraltäthet tomt. Denna kurva visar en topp runt resonansfrekvensen. Den frekvens där amplituden iär den största är resonansfrekvensen. Montera en Lorentzisk funktion runt toppen för att automatiskt beräkna fjäderkonstanten av programvaran. Några användbara resurser för teorin om termiskt brus metod anges i hänvisningarna ^27-30.
   2. Efter avbildning av ett område av dubbelskiktet för att välja 5 um x 5 um-regionen i dubbelskiktet att utföra kraftspektroskopi.
   3. Ställ in AFM så att det tar kraftkurvor i en 16 x 16 rutnät av denna region. Detta resulterar i 256 kraftkurvor per region. Utrymmet mellan två angränsande punkter bör vara tillräckligt för att undvika att membranet område som undersöktes med en poäng skulle sammanfalla med nästa punkt. Detta är beroende av spetsradien. En 100 nm avstånd mellan två punkter skulle vara idealiskt. Dela upp 5 um x 5 um regionen till 16 x 16 rutnät. Beroende på storleken av fasen, kan man välja en mindre eller större region, och sedan justera nätet storlek därefter.
   4. Ställ z-piezo förskjutning till400 nm. Detta bestämmer den maximala rörelseområde z-piezo. Det bör vara tillräckligt stor för att vara säker på att den fribärande har helt tillbakadraget bort från provet i mellan mätningarna.
   5. Ställ ingångshastighet till 800 nm / s och dra tillbaka hastigheten till 200 nm / s. Använd en ingångshastighet mellan 400 till 6000 nm / s beroende på dubbelskiktskompositionen och lipidfas studeras ^6,16.
   6. När du har ställt in alla parametrar, förvärva kraftkurvor, genom att trycka på "kör" -knappen på AFM programvara.
   7. Spara kraftkurvor som kraft mot höjdkurvorna (ett mått på z-piezo rörelse). Detta tar inte hänsyn till böjning av konsolen när den är i kontakt med provet. Under databehandlingssteget tillåter AFM programvara korrigering för överhängs att få kraft kontra tip-prov separationskurvorna (Figur 1C), som kommer att ge korrekta värden för dubbelskiktstjocklek. Korrigeringsvärdena införlivas vanligtvis i kalibrtion, som sparas med varje kraftkurva. Beräkna tip-prov separation genom att subtrahera vertikalavböjnings från piezo rörelse vid en given punkt.
      Obs: Toppen i inflygningskraftkurvan (den kraftvärdet går ner även om den fribärande rörelsen är fortfarande på det tillvägagångssätt cykel) är genombrottet kraft av membranet, medan skillnaden mellan positionen för denna topp och läget för den punkt där kraften börjar stiga upp igen åstadkommer membranets tjocklek.
   8. Skaffa minst 500 kraftkurvor för varje tillstånd för att få bra statistik. Rita ett histogram över värdena med program som Origin eller MatLab, och montera histogram till en Gaussfördelning att få toppen och bredden av fördelningen.

Representative Results

Stöds lipiddubbelskikt sammansatta av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) till avbildade i AFM (figur 2 AC). På grund av lipidkompositionen var SM / Chol-rika _Lo och DOPC-rika L _d faser observeras. Höjden profilen från AFM avbildning kan ge viktig information om membranstruktur. Genom att titta på höjdprofil, kan dubbelskiktet tjockleken mätas i närvaro av defekter i membranet (fig 2B), eller skillnaden i höjd mellan de L _o / L _d faser kan tillhandahållas. Dessutom kan AFM till specifikt utvalda områden som representerar dessa faser och analysera deras mekaniska egenskaper med hjälp av kraft-spektroskopi (Figur 2 D - F). Kraftkurvor härledda från kraftspektroskopi läget används för att mäta genombrottskraft genom att hitta kraften värdet på toppen av kraftkurvan (Figur 2D och E), och Membrane tjocklek genom att subtrahera avståndsvärdet från toppen av kraftkurvan till avståndet värde när kraftkurvan börjar stiga igen (Figur 2D och F).

Känsligheten hos AFM mätningar är beroende av piezoelektriskt material och elektroniska återkopplingsslingor. Som sådan, innan du gör experiment, är det viktigt att bekanta sig med AFM inrättas. Det finns två vanliga instrument inrättas för piezoelektriska material: (1) rör scanner där provet placeras ovanpå det piezoelektriska materialet och provet skannas på en orörlig spets; eller (2) böjnings stadium där spetsen är monterad på det piezoelektriska materialet i stället för provet. I det senare fallet, är det piezoelektriska materialet och annan elektronik skyddas från spill. En hel del av AFM modeller för biologiska tillämpningar har denna konfiguration.

Under avbildning kan AFM spets tappa kontakten med provet och leda till felaktiga migasurements. Beroende på hur många genomsökningar går förlorade, kan bilden korrigeras genom att ta bort skanningslinjer och använder en genomsnittlig intensitet filter för att härleda de nya värdena från omgivningen (Figur 3). Men i de flesta fall inte detta ge en bra bild och det rekommenderas att helt enkelt kasta bilden. Det finns andra artefakter som måste övervakas. Dessa uppkommer från trubbiga / skadade / smutsiga tips samt diffraktion av laserpunkt bakom konsolen ^31. I dessa fall bör bilder kasseras och AFM spets bör bytas ut.

Under kraftspektroskopimätningar, kan flera utmaningar uppstå: (1) frånvaro av toppar (Figur 4A), (2) Förekomsten av axlar i stället för väldefinierade toppar (Figur 4B), (3) en liten ökning och efterföljande plateauing vid mycket låga krafter (Figur 4C - D). Frånvaron av en topp kan hänföras till att mäta i en region utan en bilAyer eller förvärv villkor inte optimeras. Det rekommenderas att en AFM bild förvärvas innan du gör kraft spektroskopi för att säkerställa att biskiktet är verkligen mäts. Förvärvs villkor samt tips / konsol specifikationer påverkar sannolikheten för ett genombrott händelse ^17. En vassare spets kan lätt punktera ett dubbelskikt, som sådan, kan genombrottskraft förefaller låg eller inte visas alls eftersom det är under bullernivåerna. . Ökning av ingångshastighet ökar också genombrottskraft ^16. Såsom dubbelskiktet pressas av spetsen, de lipidmolekyler reagerar också att avleda denna kraft. Vid en lägre ingångshastighet, har lipiddubbelskiktet tillräckligt med tid för att jämvikt innan nästa steg i kraft, och detta ökar sannolikheten för att ett genombrott händelse kan inträffa. Vid en högre ingångshastighet, kraft ramper snabbare än reaktionen av lipiderna och, som sådan, är sannolikheten av ett genombrott händelse lägre vid samma kraft. Det är möjlliga att med hjälp av hög ingångshastighet, är börvärdet nås innan dubbelskikts raster leder till några observerbara toppar. Det finns inga rapporter att förklara utseendet ansatser på kurvan men vi postulera att det kan vara på grund av materialkompression före genombrottet. Vidare kan en platå eller breda toppar vid mycket låga krafter indikera närvaron av smuts eller löst lipidmaterial i spetsen. Tips kan samlas smuts och lipidisk material under loppet av flera mätningar. Smuts och materialet fäst till spetsen gör det trubbiga, vilket således ökar genombrottskraften.

Det rekommenderas att kraftkurvor förvärvas i olika områden om dessa utmaningar uppstår. En andra rekommendation är att byta tips (detta kommer att kräva omkalibrering). Slutligen, kan ingångshastighet behöva justeras eller användning av en spets med olika specifikationer (spetsradie och styvhet) kan övervägas. Genombrottet kraften varierar mellan 0-50 NN ^6, som sådan, than fjäderkonstant av konsolen kan vara inom intervallet från 0,05 till 0,7 N / m. De flesta kommersiella konsoler har en nominell spetsradie runt 20-40 nm. Istället för att använda konventionella tips kan tipless konsoler också köpas och sfärer med känd radie (som vanligtvis är monodispersa i storleksfördelning) kan fästas på dem. För att få reproducerbara data alltid använda samma förvärvsvillkor och fribärande specifikationer för samma uppsättning experiment.

Figur 1: Principer för Force spektroskopi (A) Sekvens av strategi-tillbakadragning av fribärande från provet.. Den röda linjen visar fribärande böjningen från sitt jämviktsläge (svart linje). (B) Gren kalibrering omvandlar elektrisk signal (i volt) för att tvinga (i Newton). Genom förvärv av den fribärande sensitivitet och fjäderkonstant den vertikala avböjningen (i volt) omvandlas till avstånd och avståndet i kraft med användning av Hookes lag. (C) Vid kontakt gällande spektroskopimätningar, inte z-piezo scan rörelsen inte beakta överhängs. En korrigering för detta kan göras genom att subtrahera den vertikala avböjningen, x (i avståndsenheter) från z-piezo rörelse, z (även i avståndsenheter). På detta sätt, den faktiska spetsprovseparation, i stället för att helt enkelt z-piezo rörelse, kan rapporteras, som är en mer noggrann mätning av avstånd och är viktigt för att mäta tjockleken på provet.

Figur 2:. AFM av SLBs (A) Scheme of SLBs består av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) separera till vätska störda (L _d) och flytande beställt (L _o) faser. (B (C) motsvarar den gula fyrkanten i B (10 | j, m x 10 | im). L _o och L _d faserna är märkta. Linjen profil nedan motsvarar den gula linjen i bilden. Den _Lo fasen visas 1-2 nm högre än _Ld fasen. (D) Ett prov kraftkurva som visar hur genombrottet kraften och membrantjockleken är härledda. (E) Genombrotts kraft och (F) membrantjockleksfördelning för L _d och L _o faser med Gaussisk passande för kvantifiering.

Figur 3: Förlust av kontakt under avbildning leder till. skanna linjer som inte överensstämmer med resten av bilden A stöds dubbelskikt bestående av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) med förlust av kontakt i vissa linjeavsökningar. Skalstreck 2 | im.

Figur 4:. Utmaningar i Force spektroskopi (A) Vissa kraftkurvorna kommer att ha några toppar. (B) Kurvan kan ha axlar istället för väldefinierade toppar. (C) Efter en liten ökning en platå kan ske i frånvaro av toppeffekten. (D) Utseende av en platå tillsammans med en väldefinierad topp.

Membranregion	Genombrott Force (NN)	Membran Tjocklek (nm)
L d fas	6 ± 1	4,7 &# 177; 0,5
Lo fas	8 ± 1	6 ± 1

Tabell 1: Membran egenskaper DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBs Den _Ld fasen har en genombrottskraft av 6 ± 1 NN och en tjocklek av 4,7 ± 0,5 nm. Den _Lo har 8 ± 1 NN och en tjocklek av 6 ± 1 nm. Skillnaden i höjd mellan de två faserna är 2 ± 1,4 nm.

Discussion

SLBs sammansatta av DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) bildades på glimmer efter vesikel adsorption och bristning inducerad av kalciumklorid. Denna lipid-komposition separeras i L _d och L _o faser. Den _Lo fasen är anrikad på sfingomyelin och kolesterol och är mindre vätska / mer viskös (Figur 1A) än _Ld fasen ^11. Separationen av _Lq från L _d fas manifesteras som cirkulära strukturer förhöjda ovanför det omgivande (Figur 1B, C). Plattformarna är L _o faserna omgiven av L _d faserna. Membrandefekter (eller hål i membranet) är också ses (Figur 1B, blå pil) och en höjd profil över denna defekt visar tjockleken av dubbelskiktet. L _d / _Lo höjdskillnad kan också undersökas genom att titta på en AFM höjdprofil (Figur 1C).

Framställningen av lipidblandning är mycket viktigt eftersom kompositionen bestämmer dubbelskiktsegenskaper. Under förberedelserna av den uppburna dubbelskiktet, är det viktigt att arbeta vid de angivna temperaturerna för korrekt bildning av lipidfaser (steg 1.4.5). Under avbildning, är mycket viktigt att hålla en liten kraft för att inte förstöra det dubbla skiktet eller att samla smuts på spetsen.

Efter AFM avbildning, är delar av SLB valda och sonde använda våld spektroskopi. Force-spektroskopi ger oss möjlighet att undersöka andra egenskaper hos membranet, särskilt genombrottet kraft (Figur 1D). L _d och L _o faser visar olika genombrott kraft och tjocklek (Figur 1E, F). Egenskaperna sammanfattas i tabell 1. Vi noterar att jämfört med Chiantia et al. ^11, har liknande värden för banbrytande kraft i L _d fasen som framställts men ett lägre värde för _Lo fasen. Detta skulle kunna varapå grund av att lägre mängder av kolesterol används i våra membran (vi använde DOPC: SM: Chol-förhållande 2: 2: 1, medan de som används av 1,5: 1,5: 1). Detta visar också betydelsen av blandning av den högra lipid - en kritisk faktor i reproducerbarheten hos resultaten. Dessutom, med hjälp av olika lipider (kedjelängd och omättnadsgrad) också ändrar tvåskiktsmembran egenskaper ^6,15,18.

Medan rita fördelningen av genombrotts krafter är användbar och kan redan visa skillnader i tvåskiktsmembran egenskaper, kan ytterligare analys av genombrottskraftfördelning användas för att härleda andra mekaniska egenskaper inkluderande produktions spänning och spridningstryck ^11,17,21. I korthet är sannolikheten, P (F) för att mäta en viss genombrott kraft, F, beskrivs av kontinuum kärnmodellen ^11,15,17:

där A är Resonaiou frekvens av konsolen, K är fjäderkonstanten av konsolen, v är hastigheten på tillvägagångssätt är Γ bandspänningen (den kant energi som krävs för att hålla ett hål i membranet öppen), R är radien hos AFM spets, k _B är Boltzmanns konstant, T är temperaturen, och S är spridningstrycket eller den energi som förknippas att stänga hålet (motsatsen till membranets spänning - den energi som behövs som skall utövas av membranet för att öppna ett hål ^32). Denna ekvation kan integreras och dP / dF kan beräknas som:

A, K, R är egenskaper hos AFM fribärande / tips som kan förvärvas genom fribärande kalibrering. T och v är experimentella parametrar som bör hållas konstant under experimenten. dP / dF inpassas sedan till histogrammet att förvärva bandspänningen och spridningstrycket. Eftersom flera parametrar påverkar P (F), erfamental rekommenderas att använda liknande tips och förvärvs villkor att ha jämförbara värden för linje spänningar och sprida tryck. Förorening av AFM spets (inklusive smuts och ofuserade blåsor på spetsen som förvärvats under imaging) leder till icke-reproducerbara resultat. Vidare är valet av stödet påverkar de mekaniska egenskaperna hos membranet ^20.

En annan teknik som kan karakterisera mekaniska egenskaper hos lipiddubbelskikt är mikropipett aspiration av jätte unilamellära vesiklar (GUVs) ^33. I denna teknik, är membranspänningen beräknas utifrån deformationen av GUVs under aspiration. Vidare, genom att öka sugning, kan man beräkna spänningen vid vilken GUV brister (eller lys spänning) ^34, som kan vara relaterad till bandspänningen i kontinuum kärnbildningsmodellen. En nackdel med denna teknik är komplexiteten i beräkningen av membran spänning för att fasa separera membran, som de olika PHASES har olika mekaniska egenskaper ^35. Detta är i motsats till AFM kraft spektroskopi, där enskilda faserna kan karakteriseras separat. Dessutom, medan många GUVs behövs för att ge statistiskt relevanta resultat, kan AFM producera en fördelning per SLB. Men membran remodeling effekter (till exempel, röran och invaginationer) lättare visualiseras med GUVs, vilket gör dem bättre system för att karakterisera dessa formrelaterade effekter tillsammans med mekaniska egenskaper.

I ytterligare program för att studera effekterna av membranproteiner på tvåskiktsmembran egenskaper, kan renade proteiner införlivas i dessa vesiklar att göra proteoliposomer. En teknik för att göra detta använder rengöringsmedel för att hjälpa proteiner för att stabilisera och infoga i membranet. Efterföljande rening via dialys eller storlek kromatografi avlägsnar fria proteiner och tvättmedel i lösning ^36. Ett annat tillvägagångssätt kräver märkning avde renade proteinerna (t.ex. histidin eller Streptavidin taggar) och innehåller affinitetspartner för denna tagg i liposomer (med nickel-nitriloacetic syra (Ni-NTA) eller biotinylerade lipider).

Sammanfattningsvis har vi beskrivit en metod för att analysera lipiddubbelskikt. På grund av sin höga upplösning kan AFM avslöja undermikrometer strukturer i membranet, som omfattar lipidfaser bland annat. Kraft-spektroskopi, här används för att karakterisera lipidmembran, kan också användas på membranproteiner och andra biomolekyler på membranet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200