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Bioengineering

Génération des solutions évolutives de métal de très haute-Aspect Ratio nanocomposites dans un milieu liquide biologique

doi: 10.3791/52901 Published: July 8, 2015

Summary

Ici, nous présentons un protocole à synthétiser de nouveaux, de haute rapport d'aspect biocomposites dans des conditions biologiques et dans des milieux liquides. Les biocomposites échelle du nanomètre au micromètre de diamètre et de la longueur, respectivement. nanoparticules de cuivre (CNPS) et du sulfate de cuivre combinés avec la cystine sont les éléments clés pour la synthèse.

Abstract

L'objectif de ce protocole est de décrire la synthèse de deux nouveaux biocomposites avec des structures de ratio d'aspect élevé-. Les biocomposites sont en cuivre et la cystine, soit avec des nanoparticules de cuivre (CNPS) ou du sulfate de cuivre qui contribue le composant métallique. La synthèse est effectuée dans un liquide dans des conditions biologiques (37 ° C) et la forme des composites auto-assemblées après 24 h. Une fois formés, ces composites sont très stables dans les deux milieux liquides et sous une forme séchée. Les composites échelle du nano aux micro gamme de longueur, et de quelques microns à 25 nm de diamètre. La microscopie électronique à balayage à émission de champ avec une spectroscopie à dispersion d'énergie aux rayons X (EDX) a montré que le soufre était présent dans les structures linéaires NP-dérivés, tandis qu'il est absent de la matière CNP départ, ce qui confirme la cystine en tant que source de soufre dans les nanocomposites finaux . Lors de la synthèse de ces nano et micro-composites linéaires, un large éventail de longueurs de structures est formée dans le récipient de synthèse. La sonication du mélange liquide après la synthèse a été démontrée pour aider à contrôler la taille moyenne des structures en diminuant la longueur moyenne avec l'augmentation du temps de sonication. Étant donné que les structures formées sont très stables, ne pas agglomérer, et sont formées dans la phase liquide, la centrifugation peut également être utilisée pour aider à concentrer et séparer les composites formés.

Protocol

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1. Planification d'expériences

  1. Déterminer le volume de nanocomposites de cuivre nécessaires pour la synthèse. Sur cette base, choisir un certain nombre de petits flacons de volume (25 cm 2), ou les grands flacons, comme indiqué ci-dessous dans la préparation des matériaux.
  2. Pour cette synthèse, en utilisant un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 et au moins 40% d'humidité. Assurez-vous que un tel incubateur est disponible et qu'il ne sera pas perturbé à plusieurs reprises au cours de la période de synthèse (environ 24 h).
    ATTENTION: l'ouverture et la fermeture répétées de l'incubateur va certainement causer des fluctuations de température qui peuvent résulter de la synthèse modifiée des structures nanocomposites.

2. Préparation des matériaux

  1. Préparer tous les nouveaux matériaux avant le début d'une expérience, en ajoutant des matériaux solides aux solvants juste avant la synthèse est de commencer. Garder solutions de stockage de matériaux de cystine et de départ de cuivre dans le liquide pour de longues durées bvant l'expérience est déconseillé et peut conduire à des résultats variables. Une fois ouvert auprès du fournisseur, garder les matières sèches en enveloppant le haut du conteneur avec du Parafilm départ.
    Remarque: Le protocole suivant est utilisé comme un exemple de réaction dans un 25 flacon de culture cm 2 de cellules en utilisant 7 ul de cystine, 6,643 pi d'eau stérile, et 350 ul de CNPs.
  2. Préparer une solution à 2 mg / ml de nanoparticules de cuivre en pesant au moins 2 mg de CNPs. Porter des gants jetables lors de cette étape pour éviter tout risque de contact avec la peau du CNPS. Placez les nanoparticules dans un vide stérile 16 ml flacon en verre.
    1. Pour le flacon contenant CNPS, ajouter de l'eau déminéralisée stérile dans le volume approprié de faire une solution à 2 mg / ml et vortex la solution pendant 20 secondes afin de fournir dispersion des nanoparticules de synthèse commence avant (au moins 1 ml volume total est recommandé). Ne pas remplir le plus de la moitié du flacon avec de l'eau car cela va inhiber le mélange au vortex. CNPs will régler rapidement au fond du flacon et apparaîtra de couleur foncée (gris au noir).
    2. Soniquer la solution CNP pour 17 min à température ambiante pour assurer une dispersion maximale de CNPs avant le début de la synthèse. Vérifiez régulièrement pour vous assurer que CNPs confondez due à ultrasons. Après un traitement par ultrasons succès, CNPs restent en suspension dans la solution pendant au moins 30 min et la solution sera de couleur foncée.
  3. Peser une masse suffisante de la cystine pour former une solution / ml de 72,9 mg pour la synthèse. Depuis cystine est pas directement soluble dans l'eau, placez la cystine pesé dans un récipient de pesée antistatique.
    1. Dans le récipient contenant la cystine pesage, ajouter un volume suffisant de, 1 M de NaOH stérile, de sorte que la cystine se dissout complètement. Par exemple, dissoudre 7,29 mg de cystine complètement dans 100 pi de NaOH 1 M, de faire un / ml solution 72,9 mg.
    2. Pour maintenir des conditions stériles, réaliser cette étape dans un tissu d'écoulement culture hotte stérile.
      ATTENTION: NaOHà 1 M concentration est caustique, donc porter des gants jetables lors de cette étape pour éviter le contact de NaOH concentré avec la peau
  4. Travailler dans une culture tissulaire hotte stérile, ajouter 7 pi de cystine avec 6643 ul d'eau stérile dans le flacon de synthèse stérile premier, et laisser incuber pendant 30 minutes dans l'incubateur à 37 ° C avec le bouchon de flacon ventilé (en vrac) pour fournir efficace mélange. Reprendre le / ml solution CNP 2 mg par vortex pendant 30 secondes, depuis CNPs aura réglé après l'étape de traitement par ultrasons.
    1. Ajouter CNP solution dans le ballon de synthèse (en utilisant une technique stérile) afin de maintenir les rapports de composants suivants: combiner une cystine parties, 50 parties CNPS, et 949 parties d'eau stérile dans un 25 cm2 ballon de culture de cellule pour commencer la synthèse. Par exemple, pour un volume de synthèse 7 ml, mélanger 7 pi de solution cystine boursier, 350 pi du CNPS, et 6643 pi d'eau stérile. Replacez le bouchon sur le flacon et serrer de sorte qu'il est sécure.
    2. Après combinant tous les composants pour la synthèse, mélanger doucement dans le ballon en secouant 4-5 fois. Placer la fiole dans incubateur à CO 2 et évacuer la fiole en dévissant le bouchon de sorte qu'il y ait un échange de gaz dans et hors de la fiole pendant la synthèse.
  5. Laisser la synthèse afin de fonctionner dans l'incubateur pendant environ 24 h. Lors de la synthèse, on peut observer, à la microscopie et à l'oeil, la formation de composites très linéaires.
    Remarque: Le processus de formation des structures peut arriver tout à coup dans le sens que les structures sont d'abord difficile à détecter, puis apparition procède rapidement à une augmentation de la densité. Formation peut donc se produire avant 24 h. Le processus peut également être observée à l'oeil fois que les structures deviennent plus grandes et leur densité augmente. Alors que la génération des structures peut être observée au fil du temps sous le microscope et à l'œil à des moments plus tard, interrompant continuellement les conditions de synthèse et la température va conduire à une mauvaiseles résultats de la synthèse.
  6. Mettre fin à la synthèse de biocomposites en coiffant hermétiquement la fiole de synthèse et le stockage du récipient dans un réfrigérateur (4 ° C). Structures, une fois générés, restent stables sous cette forme pendant au moins un an. Etiqueter le flacon avec des conditions de synthèse, y compris les composants utilisés, la date de la synthèse, et le temps d'incubation de la synthèse avant la fin.

3. Synthèse Utilisation de sulfate de cuivre

  1. Réaliser la synthèse auto-assemblage en remplaçant CNPs avec du sel de sulfate de cuivre. En utilisant une technique stérile, dissoudre au moins 2 mg de sulfate de cuivre dans un volume suffisant d'eau déminéralisée stérile de faire un / ml, solution à 2 mg. Les cristaux de sulfate de cuivre vont facilement dans la solution à cette concentration, mais Vortex le flacon si nécessaire, et inspectent visuellement à assurer que tous les cristaux sont dissous.
  2. Après la préparation du sulfate de cuivre, de réaliser la synthèse comme décrit précédemment, mais en remplaçant CNPs avec le sulfate de cuivre.
    Remarque: nanocomposites auto-assemblées à l'aide de sulfate de cuivre comme matériau de départ ont été trouvés à être beaucoup plus cohérent dans la forme finale que pour des structures synthétisées à partir de PNC.
  3. Terminer la synthèse de biocomposites de sulfate de cuivre pour les composites CNP (étape 2.6) et les stocker à long terme à 4 ° C.

4. Caractérisation et la manipulation des Biocomposites post-synthèse

  1. Caractériser biocomposites dérivés de CNPs et de sulfate de cuivre par microscopie à lumière blanche 9 et par microscopie électronique 9.
    1. Pour la caractérisation et l'inspection des biocomposites post-synthèse par microscopie de lumière blanche, utiliser un microscope inversé comme composites se déposent à la surface inférieure de la fiole à quelques minutes de la pose du flacon plat, et peuvent ensuite être mis en évidence. Utilisez le réglage de champ clair sur le microscope pour optimiser le contraste entre les biocomposites et le milieu liquide. Composites dérivés de PNC et flicpar sulfate seront tous deux être clair à opaque en couleur, mais agrégats CNP pas réagi apparaît une couleur très sombre.
      1. Utilisation d'un appareil photo numérique connecté au microscope pour capturer des images des composites. Une gamme de longueurs pour les structures individuelles sera observée.
    2. Pour la caractérisation et l'inspection des biocomposites post-synthèse et après stockage à 4 ° C, permettent flacons à venir à la température ambiante pendant au moins 15 min en flacons formeront condensation initialement lors de l'enlèvement du réfrigérateur, qui obscurcir efficace en se concentrant tout en effectuant l'imagerie microscopique. Après avoir laissé l'équilibre à la température ambiante, essuyer les surfaces supérieure et inférieure de la fiole avec une serviette en papier propre pour maximiser la qualité de l'imagerie microscopique.
    3. Lorsque vous travaillez avec ou imagerie composites qui ont été stockées à long terme, vortex le flacon pendant 30 secondes à se dissocier des touffes de composites qui forment alors dans le réfrigérateur. Après vortex, inspecter les structures avec un micro inverséroscope pour assurer que les agrégats ont dissocié, et répéter vortex si nécessaire.
    4. Utilisez microscopie inversée de lumière blanche pour évaluer l'efficacité de la synthèse d'une expérience donnée en utilisant CNPs. Par exemple, le document de la présence ou de l'absence de CNPs qui n'a pas réagi dans des flacons de synthèse utilisés pour biocomposites CNP-dérivés de flacons avec différents paramètres tels que le temps de synthèse.
      Remarque: individuel CNPs sont trop petits pour observer avec un microscope optique, mais qui n'a pas réagi CNP regroupe apparaîtra comme forme arrondie et objets sombres, contrairement aux CNP-composites synthétisés avec succès ce qui aura un rapport de haute aspect, forme linéaire, et aura une gamme de longueurs différentes. Éviter d'effectuer la synthèse pendant trop longtemps d'une période de temps avant la fin, car cela va entraîner très ramifiées structures de type «oursins», qui sont difficiles à disperser dans des structures individuelles une fois formés.
    5. Utilisez la microscopie de lumière blanche inversée pour évaluer l'efficacitéde la synthèse pour une expérience donnée en utilisant du sulfate de cuivre. Depuis le sulfate de cuivre va pleinement dans la solution en utilisant ce protocole, la solution apparaît moins sombre que la solution de synthèse en utilisant CNPs. Document, la taille et l'étendue des composites de sulfate de cuivre en comparant les flacons avec différentes conditions de synthèse tel que le temps de synthèse avant la fin.
      Remarque: composites synthétisé avec succès montreront une gamme de longueurs différentes. Éviter d'effectuer la synthèse pendant trop longtemps d'une période de temps avant la fin, comme cela se traduira par des agrégats hautement branchés de composites, dont certaines seront "oursin-like" dans la structure, et qui sont difficiles à disperser dans des structures individuelles une fois formés .
  2. Pour concentrer biocomposites post-synthèse, solutions centrifugeuses de composites dans un tube de centrifugeuse. Ajouter 6 ml de chacune des structures CNP-structures dérivées ou dérivées de sulfate de cuivre dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger pendant 10 minà 500 x g à la température ambiante pour former une pastille. Pour les plus petits volumes, ajouter 500 pi de structures dans une solution à 0,6 ml tubes de taille. Centrifuger à 2000 xg à température ambiante pendant au moins 10 min pour former une pastille.
    1. Après centrifugation pendant une durée suffisante (au moins 10 min pour microfuges), à l'exception du culot observable au fond du tube, où les structures sont concentrés en éliminant soigneusement le liquide surnageant au-dessus de la pastille. structures biocomposites issus de sulfate de cuivre apparaissent en bleu dans la couleur et des structures dérivées de CNPs sont plus sombres (gris au noir).
    2. Ajouter plus de composites à ce tube et répéter le processus dans le même tube de se concentrer structures si désiré. Pour disperser les pastilles concentrées, ajouter le volume désiré de solution dans le tube, et pour 10 à 30 vortex sec.
  3. Structures Soniquer fois formés, pour déplacer la taille moyenne de la population (de longueurs) des structures à des valeurs inférieures. La place des structures dans l'eau déminéralisée stérile et soniquer au least 10 min. Grâce à ce procédé, au fil du temps, les structures deviennent fragmentées et de plus petite longueur moyenne (voir Figure 6 du texte). Les modifications des documents dans les tailles composites avec différents temps de sonication en utilisant un microscope à lumière blanche inversé et appareil photo numérique.

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Representative Results

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La figure 1 montre un organigramme schématique des étapes de synthèse pour former les biocomposites linéaires décrits dans cet ouvrage. CNPs ou sulfate de cuivre comme matières de départ sont combinés avec de l'eau stérile pour former une / ml, solution 2 mg, cette solution est mélangé et traité par ultrasons pour fournir un mélange homogène, et cette solution de cuivre est ensuite mélangé dans le rapport suivant de synthèse: 949 parties stérile l'eau: 50 parties de mélange de cuivre: solution cystine stock 1 partiel. Les volumes réels peuvent être augmenté ou diminué en fonction de ces ratios pour intensifier ou de réduire le rendement de synthèse final. Après incubation pendant au moins 2 heures, comme indiqué, les structures de biocomposites linéaires qui sont formés au cours du temps peut être observée au microscope à lumière blanche normale ou à l'oeil que les changements de solution liquide d'aspect.

La figure 2 montre un résultat représentatif de la découverte initiale de ces structures linéaires dans toutes les cultures de cellules médias oVer une période de 82 h. Notre laboratoire effectuait l'évaluation de la toxicité potentielle des différents nanomatériaux, y compris les PNC sur les cellules et les cellules cancéreuses normale, et les cellules de la figure 2 sont une ligne à croissance rapide cellule de tumeur de cerveau de l'ATCC (CRL-2020). Un supplément clé pour les médias complète utilisée pour ces cellules est la cystine, qui se révéla être la composante essentielle à la découverte de pourquoi ces structures linéaires se formaient dans les cultures (voir ci-dessous et la section de discussion). De même une dispersion initiale de CNPs rapidement agrégat dans lequel les microstructures (figures 2A et 2B), au fil du temps les particules plus petites et plus grandes sont effacés agrégats sont formés (figures 2C et 2D). Enfin, les grands agrégats d'une amende, structures linéaires apparaissent dans les mêmes puits (figures 2E-H), la formation des structures de type «oursins» précédemment rapportés dans la littérature à l'aide non-biolméthodes ogical 6. La comparaison des deux derniers points dans le temps, à 69 et 82 h (figures 2G et 2H, respectivement), montre que le développement des grandes structures de type oursin reste assez stable, comme indiqué par l'imagerie du même champ exact.

Pour expliquer pourquoi ces structures d'oursins comme dans ces conditions dans les cultures de cellules ont été observées, nous avons commencé à éliminer les composantes médias afin de déterminer si les éléments essentiels ont pu être isolés. Nous avons découvert qu'un élément clé et un supplément aux milieux de culture cellulaire était cystine, qui, par le processus d'élimination a finalement été identifié comme un élément essentiel pour le processus d'auto-assemblage. En simplifiant les composants de synthèse (voir Figure 1), nous pourrions finalement former rapport haute aspect (linéaire) des structures en liquide, qui pourrait être montré au fil du temps pour transformer de la forme de nanoparticules de forme linéaire, sans avoir besoin de cellules, ou l'une de l'autre cellulecomposants de culture (figures 3A-C).

La figure 4 montre la caractérisation des nouvelles structures découvertes à l'aide de la microscopie électronique, y compris une image de microscopie électronique à transmission (TEM) la capture des nanoparticules produit de départ et la formation des nanostructures linéaires (figure 4A). Micrographie électronique à balayage représentatif (SEM) des images sont présentées pour CNPs matière de départ, des structures linéaires formés à partir des IP et des structures linéaires formés à partir de sulfate de cuivre à partir de matière (figures 4B-F, respectivement).

Pour vérifier que les contenus biocomposites cystine ou de matériau dérivé de la cystine en tant que composant biologique essentielle des matériaux composites, les structures formées ont été analysés par microscopie MEB avec EDX. Représentant des captures d'écran à partir de matériaux analysés sont présentés dans la figure 5. Il est important, lorsque l'on compare CNPs et biocomposites à partir de la CNPS, un éminentpic de soufre apparaît (Figure 5B), qui est absente dans la CNP matière de départ (figure 5A). Pour les biocomposites en utilisant du sulfate de cuivre en tant que matériau (figure 5C), les pics de carbone et d'azote apparaissent (figure 5D), ce qui est cohérent avec la présence de la cystine à partir de ce biocomposite.

A ce moment, un procédé pour commander la longueur et la taille des matériaux composites lors de la synthèse n'a pas été identifié. Cependant, pour étudier si la taille moyenne des structures peut être contrôlée après synthèse, biocomposites linéaires ont été soniquées pendant différentes périodes de temps, comme illustré sur la figure 6. Avec l'augmentation du temps de sonication, on a montré que la taille moyenne des biocomposites linéaires diminué, comme montré par microscopie en champ clair (figures 6A-D). En tant que procédé pour concentrer et séparer les composites formés, la centrifugation peut être utilisé, et comme représenté sur les figures 6E-G, Un culot visible peut être développé en fonction des volumes et des forces de centrifugation utilisés.

Figure 1
Figure 1. organigramme représentant de la conception de synthèse Cu NP des nanoparticules de cuivre =.; Cys = cystine. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. La formation représentant des structures de biocomposites de cuivre dans des cultures de cellules de la tumeur du cerveau avec complète de milieux de culture de cellules. Une expérience représentative suivis sur un total de 82 h est indiquée en culture cellulaire contenant des cellules tumorales du cerveau et PNC (50 pg / ml). Panneaux A et B montrentles puits de culture au temps 0, après CNPs sont installés au fond du puits. CH panneaux montrent des points de temps ultérieurs à 17, 24, 36, 49, 69, et 82 h, respectivement. Panneaux G et H représentent le même domaine à 69 et 82 h. Toutes les images ont été obtenues en utilisant la microscopie en fond clair pour améliorer le contraste d'un matériau de cuivre. Les barres d'échelle = 100 microns pour A + B, 50 microns pour CE, et 25 microns pour F + G. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Transformation de CNPs de biocomposites linéaires. CNPs ont été combinés avec la cystine et de l'eau comme indiqué sur la figure 1 et en coupe d'un protocole à un volume total de 7 ml. Le panneau A montre le navire de synthèse au temps 0, panneau B montre 3 h, et le panneau C shux 6 h. Les images ont été obtenues en utilisant la microscopie à fond clair avec barre d'échelle indiquée (50 microns). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. La microscopie électronique caractérisation des biocomposites synthétisés Panel (A):. TEM de CNP matériau de départ (rond) avec les composites linéaires formant. Panneaux (B) et (C) montrent la caractérisation de la CNPS de départ en utilisant SEM. Panneau (C) est une image agrandie de (B). Panneau (D) montre SEM des composites formés à partir de PNC et la cystine. Panneaux (E) et (F) montrent SEM des biocomposites de sulfate de cuivre. Panneau (F) est un zoomed de l'image (E). Barres d'échelle sont indiquées dans toutes les images et = 200 nm (A), 1 micron dans (B), 500 nm à (C), 5 microns (D), deux microns (E) et 1 micron (F ). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. EDX (SEM) l'analyse des matières premières et des matériaux composites linéaires synthétisés. Instantanés d'écran de SEM échantillons analysés en utilisant une analyse EDX pour le contenu élémentaire. Panneau (A) = départ CNPs; Panneau (B) = biocomposites de PNC et la cystine; Panneau (C) = matériau de sulfate de cuivre de départ, et le panneau (D) = composites from sulfate de cuivre et la cystine. Pour l'étiquetage de pointe, C = carbone, O = oxygène, Cu = cuivre, S = soufre et N = azote. Grandes étiquettes d'identité élémentaire ont été placés au-dessus des pics clés pour faciliter la visualisation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
La figure 6. La modification de la taille de composite et la synthèse concentration linéaire de poste. Structures linéaires synthétisés à partir de sulfate de cuivre ont été soniqué pendant 0, 15, 30 ou 60 min, respectivement, comme représenté sur les panneaux (AD). Les images ont été obtenues en utilisant la microscopie à fond clair avec barre d'échelle de 200 microns indiqués dans toutes les images. Panneaux (EG), la concentration des biocomposites utilisant la centrifugation: 6 ml de structures linéaires dérivés de PNC (<strong> E, à gauche) et le sulfate de cuivre (E, droite) sont présentées de décantation par gravité après 10 min. Avec 10 min de centrifugation à 500 xg, une pastille compactée est formé (panneau F). Un plus petit volume (500 pi) de la même matière a été concentré comme indiqué dans (panel G) (structures CNP-dérivés sont présentés dans les tubes de cuivre et structures de sulfate dérivé de gauche dans le tube de droite). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

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Discussion

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Alors que l'évaluation des effets toxiques potentiels des nanomatériaux dont CNPS, il a été observé que sur le long terme, PNC ont été transformés à partir d'une distribution de particules initialement plus dispersée à une forme agrégée plus grande (Figure 2). Dans certains cas, ces formations très agrégés qui ont été produites dans le plat de culture cellulaire, dans des conditions biologiques, formés projections très linéaires de l'agrégat central, rappelant cuivre décrit précédemment contenant des "gamins" 6. Il convient de souligner que dans les conditions indiquées ici, la concentration du CNPS ajouté aux cellules était sous-maximale, donc pas tuer toutes les cellules en culture (voir la figure 2). A partir de ces observations initiales, des expériences ont ensuite été poursuivies en éliminant successivement plusieurs composants des conditions de culture cellulaire (y compris, finalement, les cellules elles-mêmes) pour trouver des éléments clés restants nécessaires pour la synthèse of biocomposites de cuivre linéaires.

Nous avons découvert que la cystine, un composant complété des cultures cellulaires d'origine, lorsqu'il est combiné avec CNPs dans les conditions biologiques correctes, pourrait entraîner la transformation de la forme nanoparticulaire dans un biocomposite très linéaire qui contenait à la fois des composants biochimiques métal et comme indiqué par l'analyse EDX par microscopie électronique à balayage des échantillons préparés (figure 5). Ainsi, le soufre, qui ne sont pas présents dans le matériau de départ CNP, montre un pic important dans les biocomposites synthétisés, ce qui indique que le cuivre et les composants du matériau de cystine biochimique sont essentiels pour les structures linéaires formées.

Il a également été démontré que, en utilisant des conditions de synthèse analogues, mais en remplaçant CNPs avec du sulfate de cuivre, biocomposites hautement linéaires peuvent aussi être formés. En fait, la synthèse en utilisant du sulfate de cuivre et de cystine a tendance à donner plus "propre" end de produits, en ce qu 'aucun CNPs qui n'a pas réagi étaient toujours présents, car le sulfate de cuivre est complètement soluble dans l'eau, qui a été utilisé comme solvant dans l'ensemble des synthèses présentées ici. En outre, les biocomposites cuivre-sulfate se sont distingués à partir de composites CNP-dérivés à conserver une couleur bleue qui était évident lors de la centrifugation de la matière.

D'autres groupes ont déjà étudié les complexes cuivre-cystine et défini certaines propriétés chimiques clés. Par exemple, Kahler et coll. A montré la formation de complexes cuivre-cystine sous la forme de fibres fines, qui étaient évidents lors du séchage mais instable en solution 13. Dans d'autres exemples, des études de complexation avec la L-cystine et de différents cations métalliques confirme la formation du complexe de cuivre et de la cystine dans un milieu aqueux 14 et les complexes formés peuvent être mononucléaires ou polynucléaires, avec le soufre à partir de la cystine en contribuant à la formation du complexe 15. Un certain nombre d'études ont rapportinteractions entre ed cystine et de cuivre dans les systèmes biologiques. Par exemple, à un pH physiologique, le cuivre (II) en coordination avec des ions de l'histidine et de la cystine dans le plasma pour former des complexes simulé 16, ainsi que du soufre contenant des acides aminés a montré un effet protecteur contre la toxicité de cuivre dans 17 poussins. Ces résultats confirment donc le rôle essentiel de cystine dans complexer avec le cuivre matériau de départ dans nos méthodes de synthèse pour former biocomposites linéaires.

A ce moment, une stratégie de synthèse n'a pas encore été identifié qui peut directement contrôler la longueur de biocomposites linéaires individuels présentés ici. Toutefois, les étapes critiques identifiées dans la synthèse décrit comprennent: 1) une bonne dispersion par ultrasons des matériaux de départ dans le cas de la synthèse incorporant CNPs; 2) utiliser des PNC fraîchement préparé, le sulfate de cuivre, et la cystine pour la synthèse efficace de composites; 3) permettant la synthèse dans le ballon de rester tranquille dans le Incubatou pendant au moins 6 heures; et 4) en évitant les conditions «sur-réaction» dans lequel ramifiés type "oursin", composites agrégées forme.

Après la synthèse est terminée, il a été démontré que les structures de sonication peut être utilisée efficacement pour réduire la taille moyenne (longueur) des structures. Sonication à faire des structures plus petites peuvent aider dans des applications telles que l'absorption cellulaire ou d'autres interactions biocomposites-cellulaire. Comme il a été indiqué précédemment, charger la stabilisation de la PNC au cours de cette synthèse en combinant avec la cystine altéré le potentiel zêta mesuré à partir de positif à un (négatif) forme moins chargée 9. Ce changement en charge peut aider à expliquer pourquoi les composites formés montrent très peu de l'agrégation sous forme séchée ou liquides, ce qui rend la manipulation des structures beaucoup plus pratique.

Étant donné que la synthèse de ces structures rapportées de sulfate de cuivre dérivé CNP-dérivés et est réalisée out en milieux liquides, il est prévu que le processus peut être hautement évolutive, ce qui signifie qu'avec le rapport correct des composants et des conditions de synthèse, la recette de synthèse millilitre utilisée ici pourrait être agrandie ou réduite d'inclure plusieurs centaines de millilitres ou plus, et serait ainsi prévu pour donner un produit plus définitive, aussi bien. En raison de la composante métal (cuivre) de ces biocomposites, il est assez simple de se concentrer produit synthétisé par centrifugation (figure 6). Biocomposites formées à partir de matériau de départ CNP conservent une couleur plus foncée une fois concentrée en une pastille, probablement due à des nanoparticules d'oxyde de cuivre ayant pas réagi (figure 6). En comparaison, les biocomposites de sulfate de cuivre lorsqu'il est concentré en une pastille ont une couleur bleue, conforme aux propriétés de sulfate de cuivre avec différents niveaux d'hydratation 18.

La synthèse selon l'invention présentée ici est également extensible dans le sens où l'auto-assemblé linstructures de l'oreille de l'échelle nanométrique à l'échelle microscopique, comme indiqué par microscopie électronique (figure 4) et la microscopie classique en lumière blanche (figures 3 et 6). Il est intéressant de noter que des microfibres de protéines bispiralés récemment, d'ingénierie ont été signalés qui pourraient incorporer la curcumine qui a permis pour les fibres formées à respecter en vertu de la fluorescence illumination 19. Des stratégies similaires peuvent être possible d'incorporer des entretoises ou agents de marquage dans les composites linéaires signalés ici pour assurer une production de plus grandes structures et / ou des améliorations pour l'imagerie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mini Vortexer VWR (https://us.vwr.com) 58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2 VWR (https://us.vwr.com) Contact vendor Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) Labnet (http://labnetinternational.com/) C2500-R Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K Labnet (http://labnetinternational.com/) Contact vendor Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner) Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) 1510R-MTH
Balance Sartorius (http://dataweigh.com) Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope Olympus (http://olympusamerica.com TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Scanning Electron Microscope Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) model S-4800
Transmission Electron Microscope Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench Envirco (http://envirco-hvac.com) model PNG62675 Used for sterile cell culture technique

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References

  1. Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
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Génération des solutions évolutives de métal de très haute-Aspect Ratio nanocomposites dans un milieu liquide biologique
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Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).More

Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).

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