Abstract
Under udviklingen, opstår hæmatopoietiske celler fra en specialiseret undergruppe af endotelceller, hemogenic endotel (HE). Modeling HE udvikling in vitro er afgørende for mekanistiske undersøgelser af endotel-hæmatopoietisk overgang og hæmatopoietisk specifikation. Her beskriver vi en fremgangsmåde til effektiv induktion af HE fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) ved overekspression af forskellige sæt af transkriptionsfaktorer. Kombinationen af ETV2 og GATA1 eller GATA2 TF'er anvendes til at inducere HE med pan-myeloid potentiale, mens en kombination af GATA2 og TAL1 transkriptionsfaktorer muliggør produktion af HE med erythroide og megakaryocytisk potentiale. Tilsætningen af LMO2 til GATA2 og TAL1 kombination væsentlige accelererer differentiering og øger erythroide og megakaryocytiske celler produktion. Denne metode giver en effektiv og hurtig hjælp af HE induktion fra hPSCs og giver mulighed for observation af endotel-hematopoietic overgang i en kultur fad. Protokollen indeholder hPSCs transduktion procedurer og post-transduktion analyse af HE og blod stamceller.
Introduction
Den enestående evne af humane pluripotente stamceller (hPSCs) for at forny sig selv og til at differentiere til celler af de tre kimlag, herunder blod, gør dem til et værdifuldt redskab for de mekanistiske undersøgelser af hæmatopoietisk udvikling, modellering af blodsygdomme, lægemiddelscreening, toksicitetsundersøgelser og udvikling af cellulære behandlingsformer. Fordi blod dannelse i embryo provenuet fra hemogenic endotel (HE) gennem en endotel hæmatopoietisk overgang 1,2, vil genereringen af HE i kulturer være afgørende for at studere de molekylære mekanismer, der regulerer endotel til hæmatopoietisk overgang og hæmatopoietisk specifikation. Nuværende fremgangsmåder til studier af HE er baseret på induktionen af hematoendothelial differentiering i aggregater (EBS) med tilsætning af hæmatopoietiske cytokiner 3-5, og co-dyrkning af hPSCs med Hæmatopoietiske-støttende stromale celler 6,7 eller i todimensionale kulturer med ekstracellulære matricer og cytokines 8,9. Disse klassiske differentiering fremgangsmåder er baseret på indførelsen af eksterne signaler, der virker på celleoverfladen og initierende kaskader af molekylære veje, der til sidst fører til aktivering af transkriptionel program vejledende hematoendothelial udvikling. Således effektivitet hPSCs opdelinger i disse systemer er baseret på en effektiv induktion af disse signaler, signaltransduktion til cellekernen, og den resulterende aktivering af specifikke transkriptionelle regulatorer. Desuden studiet af HE i konventionelle differentiering kulturer kræver det yderligere trin til isolering af HE celler ved anvendelse af cellesortering. Her beskriver vi en enkel protokol til direkte induktion af HE og blod ved overekspression af hæmatopoietiske transkriptionsfaktorer. Denne fremgangsmåde giver mulighed for effektiv induktion af HE i en skål og direkte observation af endotel til hæmatopoietisk overgang uden behov for isolering af HE ved hjælp af en besværlig cellesortering procedure.
Dannelse af HE og blod fra humane pluripotente stamceller kan effektivt induceret af overekspression blot et par transkriptionsfaktorer (TFS). Den optimale kombination af TF'er stand til at inducere robust pan-myeloid hæmatopoiese fra hPSCs inkluderer ETV2 og GATA1 eller GATA2. I modsætning hertil kombination af GATA2 og TAL1 inducerer erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmering hPSCs gennem overekspression af disse faktorer adskiller hPSCs direkte til VE-cad + CD43 - CD73 - HE celler, der gradvist erhverve den hæmatopoietisk fænotype defineres ved ekspression af den tidlige hæmatopoietisk markør CD43 7. Denne lentiviral-metode til direkte programmering af menneskets pluripotente stamceller metode anvendes til generering af HE og blodceller for mekanistiske undersøgelser, undersøgelser af endotel til hæmatopoietisk overgangsproces og transkriptionel regulering af hæmatopoietisk udvikling og specifikation. Selvom CNUVÆRENDE protokol beskriver produktionen blod ved hjælp konstitutiv ekspression af transgenerne, kunne lignende resultater opnås ved hjælp af modificeret mRNA 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Virus Præparater og transkriptionsfaktor Kombinationer
- Forbered løsninger med pSIN-EF1α lentiviral ekspressionsplasmid indeholder protein-kodende DNA for ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 og LMO2 (tabel 1).
- Måle koncentrationen og renhed plasmidpræparater anvendes til lentiviral produktion ved at optage UV-absorption med et spektrofotometer ved 230 nm, 260 nm og 280 nm. Bemærk: DNA præparater demonstrerer A260 / 280 og A260 / 230 værdier større end 1,8 er generelt anses for god kvalitet. Lavere A260 / 280 værdier kan indikere protein kontaminering, mens lavere A260 / 230 værdier indikerer urenheder med salte eller nogle opløsningsmiddel, såsom phenol. Anbefalet plasmid koncentrationen er 1-3 pg / pl.
- Producere lentivira for transduktioner som beskrevet i tidligere offentliggjorte protokoller 11. Induktion af HE med pan-myeloid potentiale kræver co-ekspression af ETV2 og GATA1 eller ETV2 og GATA2.Induktion af HE med erythro- og megakaryocytisk potentiale kræver GATA2 og TAL1. Tilsætningen af LMO2 forbedrer udbyttet af erythro-megakaryocytisk celler fra hPSCs i nærvær af GATA2 og TAL1 10.
2. hPSCs Kultur-protokollen
- Grow pluripotente stamceller i stramme kolonier med skarpe kanter til 70-80% konfluens før videredyrkning. Mark og fjern spontant differentierede kolonier før passage celler.
- Fortynd kommercielle ekstracellulær matrix gel (se tabel 2) i overensstemmelse med producentens anvisninger og pels 6-brønds plader natten over ved 4 ° C eller i mindst en time ved 37 ° C før brug. Før passage celler, aspireres matricen, tilsættes 2 ml frisk kommerciel komplet culturemedium (se tabel 2) og holde pladerne ved 37 ° C, 5% CO2, indtil cellerne er klar til såning.
- Passage hPSCs
- Aspirate medium fra en sammenflydende brønd i en 6-brønds plade med hPSCs og tilsæt 1,5 ml forvarmet Dispase II-opløsning (2 mg / ml i DMEM / F12, steriliseret ved filtrering gennem 0,22 um filtre). Der inkuberes i 5-7 min ved 37 ° C, 5% CO2, indtil kanterne af kolonier begynder at løfte fra overfladen.
- Aspirer Dispase II-opløsning og omhyggeligt vaske kolonierne to gange ved tilsætning og derefter opsugning 2 ml frisk DMEM / F12-medium. Så ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette glas, dissociere hPSCs med 3 ml frisk kommerciel komplet dyrkningsmedium (se tabel 2) ved pipettering cellesuspension op og ned flere gange.
- Tilsæt 0,5 ml cellesuspension til hver brønd i en 6-brønds plade indeholdende 1,5 ml kommerciel komplet dyrkningsmedium (se tabel 2). Agitere plade frem og tilbage og til højre til venstre flere gange for at sikre en ensartet celle fordeling, når placere pladen i inkubatoren. At holde cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 for 18-24 timer.
- Den næste dag ændring medium til frisk kommerciel komplet dyrkningsmedium (se tabel 2) og undersøger hPSCs morfologi. Succesfulde overførselsteknikker resulterer i små, godt vedhæftede kolonier fastholde hPSC morfologi. hPSCs skal fodres med 2,5-3 ml freshmedium per brønd på en daglig basis og passeret hver 4-5 dage ved højst 70-80% konfluens.
BEMÆRK: Hvis hiPSCs blev holdt på muse embryonale fibroblaster (MEF'er), de har brug for at blive overført til fødefri betingelser og passeret 2-3 gange før transduktion at sikre en effektiv differentiering.
3. Induktion af Hematoendothelial Pprecursors fra hPSCs (dag 0, transduktion af hPSCs)
- Til fremstilling af reaktionsmediet kombinere 1,3 ml kommerciel komplet serumfrit medium (se tabel 2), virus, polybren og Y27632 ROCK inhibitor (tabel 1): på 1,3 pi 10 mM ROCK inhibitor til 1,3 ml medium til en endelig koncention på 10 uM, og polybren til en slutkoncentration 6 ug / ml.
- Tilsæt en passende mængde af viral koncentrat (r) i en endelig koncentration på 0,5-1,0 MOI (infektionsmultiplicitet) af hvert virus per celle. Hold reaktionsmediet på is eller ved 4 ° C, indtil enkelt cellesuspension er klar.
BEMÆRK: Den samme mængde MOI for hver virus i GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, og GATA2 / TAL1 / LMO2 reaktionsblandinger er optimal for induktion af differentiering. Men i ETV2 / GATA2 transducerede kulturer fordobling MOI for GATA2, i forhold til ETV2, forbedrer differentiering. Derfor, for disse kulturer, forhold 1: 2 for MOI på ETV2 og 1 MOI på GATA2 anbefales (fx hvis viral koncentrat anslås ca. 6,8 x 10 7 partikler / ml, tilsættes 10 pi ETV2 og 20 pi GATA2 virale koncentrater til 0,68 x 10 6 celler pr én ETV2 / GATA2 reaktion i en 35 mm brønd af en 6-brønds plade).
- Tilsæt en passende mængde af viral koncentrat (r) i en endelig koncentration på 0,5-1,0 MOI (infektionsmultiplicitet) af hvert virus per celle. Hold reaktionsmediet på is eller ved 4 ° C, indtil enkelt cellesuspension er klar.
- Forbered hPSCs i en enkelt celle suspension.
- Grow hPSCs i feeder-fri betingelser som beskrevet i afsnit 2. På dag 4 efter den sidste passage, observere celledensitet og morfologi under et omvendt mikroskop. hPSCs bør vokse i stramme kolonier med skarpe kanter uden spontan differentiering og nå ~ 60-70% konfluens på dagen for transduktion.
- Aspirer medium tilsættes 1,5-2 ml kommercielle celle dissociation reagens (tabel 1) pr brønd og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 5-7 min.
- Indsamle celler i lige store volumener af kommercielle komplet medium (se tabel 2) med 10 uM ROCK inhibitor, tælle cellerne og bestemme levedygtighed. Pellet cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter og derefter resuspender celler i kommercielle komplet medium med 10 uM ROCK inhibitor til en koncentration på 3.4-5 x 10 6 celler pr ml.
BEMÆRK: Cellelevedygtighed er kritisk for en vellykket viral transduktion og efterfølgende differentiering.Typisk skal cellelevedygtighed før transduktion overstige 90%.
- Tilsæt 200 pi af cellesuspensionen, indeholdende 0.68-1 x10 6 celler, i 1,3 ml af reaktionsmediet fremstillet i 3.1.
- Aspirer matrix løsning fra overnight overtrukne plade med 6 brønde fremstillet i 2.2., Overføres reaktionsblandingen til en brønd af en 6-brønds plade og distribuere celler jævnt. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer. Efter 24 timer ved mindst 80% af cellerne skal vedlægges matrixen.
4. Induktion af Hematoendothelial prækursorer fra hPSCs (dag 1-7)
- 24 timer efter transduktion, fjern virusholdige medium og vask vedhæftede celler med kommercielle ufuldstændige celledyrkningsmedium (se tabel 1) og derefter tilsættes 3 ml pr brønd af kommercielle ufuldstændige cellekulturmedium indeholdende hæmatopoietiske cytokiner: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (herefter benævnt 3F-medium).
- Erstat alt medium med frisk 3F-medium på dage 2, 3 og dag 4 for at fjerne døde celler og snavs. Efter dag 4, når flydende hæmatopoietiske celler dukker, udskifte halvdelen af 3F-medium hver anden dag, samtidig med at det samlede volumen på 4 ml.
BEMÆRK: pSIN-EF1α lentiviral ekspressionsplasmider optage puromycin resistensgenet hvilket muliggør positiv selektion af transducerede celler. 1 ug / ml puromycin kan tilsættes til mediet under de første 1-2 dage efter differentiering til at fjerne de eventuelle tilbageværende udifferentierede hPSCs. - Overhold cellemorfologi på dag 4 under et omvendt mikroskop: tætte klynger af celler med typisk endotel morfologi begynder at dukke (figur 2A, 3A). Runde blodlegemer fremgår dag 5 til dag 7 i differentiering, mens nogle områder kan bevare hPSCs morfologi. Analyser han og hæmatopoietisk differentiering som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Vellykket hematoendothelial anderledesiation resulterer i produktionen af blodceller, der vises som refraktile runde celler løst knyttet til underliggende flade endotelceller. Disse celler prolifererer aktivt danner små aggregater, og til sidst løsnes og svømmeren (figur 2A og 3A). Levende blodlegemer kan være visuelt skelnes fra de døde og døende celler baseret på deres evne til at reflektere lyset og udvide i dyrkningsbetingelser.
5. Analyse af Hemogenic Endothelium (HE) fase af differentiering.
- Detektere dannelsen af HE mellem dag 3 og 4 i differentiering ved mikroskopisk observation af celler med endotel morfologi. Der er ingen flydende blodlegemer i kulturen på dette stadium af differentiering. Tilstedeværelsen af HAN kan bekræftes ved immunfluorescensfarvning og flowcytometrianalyse hjælp VE-cadherin, CD73, CD226 og CD43 antistoffer.
- For at vurdere HE dannelse ved flowcytometrianalyse brug celler på dag 3og dag 4 fra et eksperiment. Indsamle celler ved inkubering af kulturerne med kommercielle celle dissociation reagens (se tabel 1) i 5-10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 og derefter bruge op til 1 x 10 5 celler pr farvningsreaktion (flowcytometri farvning beskrevet i 12).
BEMÆRK: VE-cadherin + HE celler erhverve udtryk for tidlig hæmatopoietisk markør CD226, men mangler udtryk for CD73 og CD43 6. I modsætning hertil ikke-HE-celler udtrykker CD73 (fig 2B, 3B).
- For at vurdere HE dannelse ved flowcytometrianalyse brug celler på dag 3og dag 4 fra et eksperiment. Indsamle celler ved inkubering af kulturerne med kommercielle celle dissociation reagens (se tabel 1) i 5-10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 og derefter bruge op til 1 x 10 5 celler pr farvningsreaktion (flowcytometri farvning beskrevet i 12).
- Immunfluorescensfarvning for hPSC-afledt HE.
- Vask vedlagte monolag af celler med phosphatpufret saltvand (PBS) og derefter lave celler i 4% paraformaldehyd fra 30 til 60 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne igen med PBS og derefter permeabiliserer anvendelse af 0,1% Triton X-100 i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne i PBS to til tre gange, og derefter inkuberes iblokerende buffer bestående af PBS med 10% føtalt bovint serum (FBS), i 30 til 120 min.
- Forbered farvningsopløsning, der indeholder både primære antistoffer (1: 1000 fortynding) muse-anti-humant CD43 og kanin-anti-humane VE-cadherin i PBS med 5% FBS (tabel 1).
- Aspirer blokeringsbufferen fra cellerne, og der tilsættes 1 ml pr brønd farvning buffer med de tilsatte primære antistoffer; inkuberes 3 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vask cellerne tre gange ved tilsætning af 2 ml PBS med 5% FBS.
- Der fremstilles en anden farvning buffer, indeholdende sekundære antistoffer ved 1: 500 fortynding i PBS med 5% FBS: æsel-anti-kanin konjugeret med grønt fluorescerende farvestof, og anti-muse konjugeret med rødt fluorescerende farvestof (tabel 1). Der tilsættes 1 ml pr brønd af sekundær farvning puffer og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask tre gange med PBS uden serum. Farv cellerne med 300 nM DAPI brugsopløsning i dH2 O i 10-15 min.
- Vask cellerne to gange med PBS, og der tilsættes 2-3 ml PBS i godt med farvede celler. Overhold fluorescens med grønne, røde og blå mikroskop filtre.
6. Analyse af induceret hæmatopoietiske prækursorer
- Bevar differentiering kulturer indtil flydende celler ekspandere betydeligt, op til 10-14 dage, skiftende halvdelen af 3F-mediet, som beskrevet i 3.1, hver to dage.
- Dissociere og indsamle differentiere monolag af celler ved behandling af celler med en kommerciel celle dissociation reagens (se tabel 1) i 5-10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Udfør flowcytometri under anvendelse af anti-VE-cadherin, CD43 og CD45-antistoffer til at evaluere hæmatopoese in kulturer 12. Bemærk, at en stor del af celler, op til 40% af ETV2 og GATA2 transducerede celler, co-udtrykker VE-cad og CD43. Følgende antistoffer kan anvendes til påvisning af specifikke cellelinier følgende eXpansion eller differentiering af inducerede blod forfædre: CD235a (erythroidceller), CD41a (megakaryocytisk), CD32 (alle typer af myeloide celler), CD66b (neutrofiler) og CD163 (makrofager).
- Udfør CFC-assay under anvendelse af et kommercielt klonogene medium (tabel 1) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Overfør 1-2 x 10 4 celler i 3 ml kommerciel klonogene medium (se tabel 3) for at vurdere antallet af kolonidannende celler og typer af hæmatopoietiske kolonier. Optimal udsåningstæthed muliggør identifikation og isolering af enkelte kolonier, der vokser adskilt fra hinanden og ikke overlapper hinanden. Udsåningstæthed kan variere mellem forsøg afhængigt af differentiering effektivitet, men bør ikke overstige 1 x 10 4 celler pr 1 ml kommerciel klonogene medium.
- Bland celler i kommercielt klonogen medium ved forsigtig vortex, og overføre 3 ml suspension til to 35 mm ultralave vedhæftede retterfor CFC assay 1,5 ml suspension til hver skål. Fordel medium jævnt og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 14 dage. Undgå at forstyrre retter; observere kolonidannelse på dag 7 og dag 10 i assay.
- Identificere og tælle bloddannende kolonier efter deres morfologier på dag 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det skematiske diagram af HE og blod induktion fra hPSCs ved overekspression af transkriptionsfaktorer er vist i figur 1. ETV2 med GATA1 eller GATA2 kombination inducerer pan-myeloid hæmatopoiese, mens en GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombination inducerer overvejende erythro-megakaryocytisk hæmatopoiese. Begge TF kombinationer direkte induceret HE celler, der efterfølgende omdannet til blod stamfædre med en tydelig spektrum af hæmatopoietisk differentiering. Differentiering af hPSCs fra pluripotente tilstand til blod producerer han tager i gennemsnit 4 dage. Runde blodlegemer først dukke op ved dag 5 i differentiering. Efterfølgende vises talrige flydende blodlegemer og udvide i kulturer. For at maksimere antallet af flydende blodlegemer, kan post-transduktion kulturer forlænges til 10-14 dage. Den ønskede afstamning af celler kan udvides i lethæftende betingelser med en egnet kombination af hæmatopoietiske cytokiner. Figur 2 DEMonstrates induktion af blod fra hPSCs hjælp ETV2 og GATA1 eller GATA2 TF'er. Efter transduktion med ETV2 og GATA2, celler erhverve en typisk endotel morfologi ved dag 4 af differentiering, og i sidste ende forvandle runde blodlegemer (dag 6-8 differentiering (figur 2A). Celler opsamlet på dag 3-4 differentiering viser en typisk VE-cadherin + CD226 + CD73 -. HE fænotype (figur 2B, 3B) på dag 7 af differentiering mere end 50% af VE-cadherin + celler erhverver den hæmatopoietiske CD43 + fænotype (figur 2C) CFC-analyser af GATA2 / ETV2. -inducerede celler afslører, at kolonier består af høj proliferativ potentiale (HPP) CFC, erythroid (E) CFC, makrofager (M) CFC og granulocytter (G) CFC (Figur 2E). Den hematoendothelial differentiering i hPSCs efter overekspression af GATA2 og TAL1 alene eller sammen medLMO2 er vist i figur 3. HE fase er bedst identificeret i kulturer med GATA2 og TAL1. Tilføjelsen af LMO2 accelererer differentiering og kontrakter HAN markant scene. Den GATA2 og TAL1 kombination alene eller sammen med LMO2 viser differentiering og modning af blod progenitorer til overvejende erythroide og megakaryocytiske celler Figur 3D og 3E. Figur 4 viser optimering af transduktionseffektivitet i H1 hESCs hjælp GFP lentivirus (A) og celledød og differentiering effektivitet kulturer transduceret med GATA2 / TAL1 / LMO2 ved høj og lav MOI.
Figur 1:. Skematisk diagram af protokol for induktion af hemogenic endotel og blodceller via den tvungne udtryk for TF'er Cartoon skitserer vigtige eksperimentelle trin og tidslinjer. Efter fremstilling af enkelt cellesuspension, er hPSCs transduceret med TFs og podet på matrixen i fuldstændig kommercielle serumfrit medium. Næste dag erstattes mediet med vækstfaktor frie kommercielle medium suppleret med bFGF, TPO og SCF (3F Medium). Efter 3-4 dages kultur, han er dannet. Efterfølgende HE undergår endotel til hæmatopoietisk overgang med dannelsen af flere blodlegemer.
Figur 2:. ETV2 / GATA2-induceret differentiering af hPSCs (A) Fase kontrast billeder af ETV2 / GATA2-induceret differentiering i 1. halvår hESCs på dag 2, 4, 6 og 8 efter transduktion; Scale bar, 100 pm. (B) Flowcytometrisk analyse af ETV2 / GATA2-inducerede celler undergår endotel til hæmatopoietisk overgang på dag 3 af differentiering: VE-cadherin + HE celler udtrykker CD226 og mangler udtryk for CD73. En lille procentdel af endotelceller udtrykker CD73 (ikke-HE). (C) flowcytometrisk enNALYSE af ETV2 / GATA1- og ETV2 / GATA2-induceret H1 hPSCs på dag 7 efter transduktion. (D) Flow cytometrisk analyse af ETV2 / GATA2-induceret hæmatopoietiske celler ekspanderet i medium suppleret med FBS og SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF og EPO i 14 dage. (E) Typer af hæmatopoietiske kolonier dannet ud fra ETV2 / GATA2 transducerede celler i CFC-assay og tilsvarende Wright-farvede cytospiner repræsenterer erythroid (E), makrofager (M), Granulocytter (Gr) og High proliferative potentielle kolonier (HPPs). Scale stænger til CFC-assay, 250 um, for cytospins, 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. GATA2 / TAL1 og GATA2 / TAL1 / LMO2-induceret differentiering af hPSCs (A) Fase kontrast billeder af GATA2 / TAL1 / LMO2induceret differentiering i H1 hESCs på dag 2, 4, 6 og 8; Scale bar, 100 pm. (B) Flowcytometrisk analyse af GATA2 / TAL1-inducerede celler undergår endotel til hæmatopoietisk overgang på dag 3 af differentiering: VE-cadherin + celler erhverve udtryk for HE markør CD226. En lille procentdel af endotelceller udtrykker CD73 (ikke-HE). (C) immunfluorescensfarvning af GATA2 / TAL1-induceret differentiering i H1 embryonale, dag 5; VE-cadherin + celler (grøn) erhverve ekspression af hæmatopoietisk markør CD43 (rød). (D) Flowcytometrisk analyse af GATA2 / TAL1 / LMO2-induceret hæmatopoietiske kulturer i suspension på dag 14 post-transduktion følgende ekspansion i serumfrit medium suppleret med SCF, TPO, EPO og bFGF; (E) Typer af hæmatopoietiske kolonier dannet i CFC-assay ved GATA2 / TAL1 / LMO2 differentieret cellsand tilsvarende Wright-farvede cytospins repræsenterer erythroid (E), makrofager (M), og Megakaryocytes (MK). Scale stænger til CFC-assay, 250 um, for cytospins, 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Optimering af lentiviral transduktion procedure (A) transduktion af H1 hESCs med forskellige MOI af GFP lentivirus.. (B) Cellelevedygtighed og differentiering effektivitet i kulturer transduceret med GATA2 / TAL1 / LMO2 ved lav (1 for hver virus) og høj (2 for hver virus) MOI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til hæmatopoietisk differentiering af hPSCs ved overekspression af TF'er, repræsenterer en hurtig og effektiv metode til generering af HE og myeloide og erytho-magakaryocytic progenitorer fra hESCs og iPSCs, således at produktionen af op til 30 millioner blodlegemer fra en million pluripotente stamceller 10. Denne metode udstillet konsekvent differentiering i flere hESC og iPSCs linjerne 10. Under differentiering ved ETV2 og GATA2, GATA1 faktorer samt GATA2 og TAL1 faktorer, celler danner blod producerer endotel, HE og gennemgå en endotel til hæmatopoietisk overgang. Dannelse af HE sædvanligvis observeret mellem dag 3 og 4 i differentiering. Tilsætning af LMO2, en transkriptionel co-faktor på TAL1 til GATA2 og TAL1 kombination, steg markant robusthed differentiering, mens HE scenen blev markant kontrakt.
Succesen med rettet differentieringtion af hPSCs af transkriptionsfaktorer afhænger hovedsageligt af (i) en effektiv administration af nukleinsyrer ind i celler, (ii) cellelevedygtighed følgende genetiske manipulationer, og (iii) en effektiv translation af exogene transkripter inde i cellen.
Et af de vigtigste trin i den beskrevne metode er produktion af effektive lentivirale enheder, som afhænger af en nøjagtig pH for HEK 293T celletransfektion, og fraværet af endotoksinkontaminanter på alle trin af virusproduktion og transduktionseksperimenter. Integriteten af alle konstruktioner, inklusive emballage og envelope plasmider, skal verificeres, hvis nogen tegn på viral produktion i HEK 293T-celler observeres 13.
Differentieringen protokol design ved hjælp af kombinationer af transkriptionsfaktorer bør overveje flere variable. Høj effektivitet af viral transduktion er vigtig for en vellykket differentiering. Da transduktionseffektiviteten afhænger af den anvendte metode til virusproduktion og oprensning optimere hPSC transduktion under anvendelse af en GFP-lentivirusvektor anbefales (figur 4A). Viral integration efter transduktion bør kontrolleres ved hjælp af genomisk PCR med transgene-specifikke primere (tabel 3). Differentiering optimering bør også omfatte justering af lentiviral koncentration i reaktionsblandingen. En relativt lille mængde virus, MOI på 0,5-1, er i stand til at inducere differentiering hPSC. Mens et højere MOI øger effektiviteten af differentiering, men også øger celledød (figur 4B). Yderligere optimering trin kan omfatte MOI forhold justering for hvert virus i reaktionsblandingen. I GATA2 / ETV2 transducerede kulturer, fordoble MOI for GATA2, i forhold til ETV2, øger effekten af differentiering. For GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 og GATA2 / TAL1 / LMO2 lige MOI for hver virus er optimal.
Efter transduktion med TF'er, et stort flertal af celler undertøjent angiohematopoietic differentiering, mens kun en meget få celler beholdt en udifferentieret morfologi. Da pSIN-EF1α lentivirusvektorer optage antibiotikaresistens, kan behandling af kulturer med puromycin anvendes til at eliminere resterende udifferentierede celler.
Dannelsen af celler med karakteristiske endotel morfologier, og efterfølgende runde blodlegemer, indikerer en succesfuld differentiering. I gennemsnit på GATA2 / ETV2 kombination producerer 40-50% af CD43 + VE-cadherin +/- blodlegemer ved dag 9-10 af differentiering med op til 30% celler resterende VE-cadherin + CD43 -. GATA1 / ETV2 kombination inducerer CD43-ekspression hurtigere og frembringer et større antal CD43 + celler i forhold til GATA2 / ETV2 kombination. I disse kulturer, de fleste CD43 + celler co-udtrykke VE-cadherin. I kulturer transduceret med GATA2 / TAL1, antallet af CD43 + -celler når sædvanligvis 40-50%. Tilføjelsen af LMO2 til GATA2 / TAL1 væsentligt accelererer og øger produktionen blod, og kontrakter markant endotel fase af udviklingen.
Kolonidannende assays skal anvendes til at bestemme hyppigheden og arten af inducerede hæmatopoietiske stamceller. Arten af kolonidannende celler kan bekræftes ved fremstilling af Wright-farvede cytospiner fra individuelle kolonier. hPSCs transduceret med ETV2 og GATA2 producerer det meste store (større end 0,5 mm i diameter) høje proliferative potentielle (HPP) myeloide kolonier sammensat af umodne granulocytisk og monocytiske celler, med nogle modne myeloide celler og lejlighedsvis erythroide og megakaryocytiske celler. I gennemsnit mere end 80% af CFC i GATA2 / ETV2 transducerede kulturer er myeloide HPPs. Desuden har disse kulturer generere erythroide og makrofagkolonier (figur 2E), som normalt omfatter mindre end 20% af den samlede CFC. hPSC transduktion med ETV2 og GATA1 øger the andel af CFC-E til op til 50%. TAL1 og GATA2 transducerede kulturer producerer det meste erythroid (mere end 80% af den samlede CFC) og megakaryocytiske kolonier (mere end 10% af den samlede CFC) med meget få makrofagkolonier (mindre end 5% af den samlede CFC). Tilsætningen af LMO2 til TAL1 og GATA2 kombination øger frekvensen af kolonidannende celler med erythro-megakaryocytisk potentiale 10. Mønsteret af CFC-aktivitet efter transduktion med de beskrevne kombinationer af transkriptionsfaktorer er konsistent mellem forskellige embryonale og hiPSC linier 10.
Sammenfattende lentiviral-medieret overekspression i hPSCs er en forholdsvis hurtig og effektiv værktøj til induktion af HE og blod under anvendelse af TF'er. Dette system kan også bruges til at vurdere differentiering kapacitet andre TF'er og identificere dem, der er nødvendige for endotel og hæmatopoietisk specifikation. Men den nuværende protokol har en begrænset anvendelighed til studier af extracellular signalering involveret i induktionen af HE, som det anvender TF'er at omgå overfladen receptor-medieret signalering. Selv om den nuværende protokol beskriver produktionen blod ved hjælp af konstitutiv ekspression af et transgen, kunne lignende resultater opnås ved hjælp af modificerede mRNA 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IS er en stiftende aktionær og konsulent for Cynata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
|||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
|||
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
|||
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
