Abstract
Während der Entwicklung von einer Fachuntergruppe von Endothelzellen entstehen hämatopoetischen Zellen, hemogenic Endothel (HE). Modellierung HE Entwicklung in vitro ist für mechanistische Studien der endothelialen-hämatopoetischen Übergangs und blutbildenden Spezifikation. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die effiziente Induktion von HE aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) durch Überexpression von verschiedenen Sätzen von Transkriptionsfaktoren. Die Kombination von ETV2 und GATA1 oder GATA2 TFs wird verwendet, um die er mit pan-myeloischer Potential zu induzieren, während eine Kombination von GATA2 und TAL1 Transkriptionsfaktoren können zur Herstellung von SE mit erythroiden und megakaryozytischen Potential. Die Zugabe von LMO2 zu GATA2 und TAL1 Kombination wesentlich beschleunigt Differenzierung und erhöht erythroiden und Megakaryozyten-Zellen-Produktion. Dieses Verfahren stellt eine effiziente und schnelle Möglichkeit HE Induktion aus hPSCs und ermöglicht die Beobachtung des Endothel-hematopoietic Übergang in der Kulturschale. Das Protokoll enthält hPSCs Übertragungsverfahren und nach der Transduktion Analyse von HE und Blutvorläuferzellen.
Introduction
Die einzigartige Fähigkeit des menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sich selbst zu erneuern und sich in Zellen der drei Keimblätter, einschließlich Blut zu unterscheiden, machen sie ein wertvolles Werkzeug für die mechanistische Studien von hämatopoetischen Entwicklung, Modellierung von Blutkrankheiten, Wirkstoff-Screening, Toxizitätsstudien und die Entwicklung von Zelltherapien. Da die Blutbildung im Embryo Erlöse aus hemogenic Endothel (HE) durch eine endotheliale hämatopoetischen Gangs 1,2, die Erzeugung von HE in Kulturen wäre sehr wichtig, um die molekularen Mechanismen, die zur Regelung der Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergangs und hämatopoetischen Spezifikation zu studieren. Derzeitigen Methoden für die Untersuchung der ER auf der Induktion von Differenzierung in hematoendothelial Aggregate (EVG) mit dem Zusatz von hämatopoetischen Cytokinen 3-5 und Cokultur hPSCs mit Hämatopoese-stützende Stromazellen 6,7 oder zweidimensionalen Kulturen mit extrazellulären basierend Matrizen und cytokines 8,9. Diese klassischen Differenzierung Methoden basieren auf der Einführung von Schauspiel an der Zelloberfläche und die Einleitung Kaskaden von molekularen Signalwege, die schließlich zur Aktivierung von Transkriptionsprogramm Führungs hematoendothelial Entwicklung führen externe Signale. Somit stützt sich der Wirkungsgrad hPSCs Differenzierungen in diesen Systemen auf einem effektiven Induktion von jenen Signalen, die Signaltransduktion in den Zellkern und die resultierende Aktivierung spezifischer Transkriptionsregulatoren. Darüber hinaus ist die Untersuchung von HE in herkömmlichen Differenzierungskulturen erfordert den zusätzlichen Schritt der Isolierung von HE-Zellen unter Verwendung der Zellsortierung. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die direkte Induktion von HE und Blut durch die Überexpression von hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren. Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Induktion HE in eine Schale und eine direkte Beobachtung der endothelialen hämatopoetische Übergang ohne die Notwendigkeit zur Isolierung von HE mit einem umständlichen Zellsortierungsverfahren.
Bildung HE und Blut von menschlichen pluripotenten Stammzellen können effizient durch Überexpression nur wenige Transkriptionsfaktoren (TFs) induziert werden. Die optimale Kombination von Transkriptionsfaktoren, die zur Induktion robust pan-myeloischer Blutbildung aus hPSCs umfasst ETV2 und GATA1 oder GATA2. Im Gegensatz dazu Kombination GATA2 und TAL1 induziert erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmieren hPSCs durch Überexpression dieser Faktoren unterscheidet hPSCs direkt an das VE-cad + CD43 - CD73 - HE Zellen, die stufenweise den hämatopoetischen Phänotyp durch Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD43 7 definiert erhalten. Diese lentiviralen basierendes Verfahren für die direkte Programmierung der menschlichen pluripotenten Stammzellen Verfahren ist anwendbar zur Erzeugung von HE und Blutzellen für mechanistische Studien, Studien endothelialer hämatopoetische Übergang und transkriptionale Regulation der hämatopoetischen Entwicklung und Spezifikation. Obwohl der current Protokoll beschreibt die Blutbildung mit konstitutiver Expression der Transgene, könnten ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von modifizierten mRNA 10 erhalten werden.
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Protocol
1. Viruspräparate und Transcription Factor Kombinationen
- Die Lösungen mit pSIN-EF1 lentiviralen Expressionsplasmid, das Protein-kodierende DNA für ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 und LMO2 (Tabelle 1).
- Messung der Konzentration und Reinheit von Plasmid-Präparationen durch die Aufzeichnung der UV-Absorption mit einem Spektrophotometer bei 230 nm, 260 nm und 280 nm für lentivirale Produktion verwendet. Hinweis: zeigen DNA-Präparationen A260 / 280 und A260 / 230-Werte größer als 1,8 werden im Allgemeinen als guter Qualität. Unter A260 / 280-Werte können Protein-Kontamination anzuzeigen, während niedrigere A260 / 230-Werte zeigen Verunreinigungen mit Salzen oder einem Lösungsmittel, wie Phenol. Empfehlens Plasmidkonzentration 1-3 ug / ul.
- Erzeugen Lentiviren für Transduktionen wie in zuvor veröffentlichten Protokollen 11 beschrieben. Induktion von ER mit pan-myeloischer Wirkung bedarf Co-Expression von ETV2 und GATA1 oder ETV2 und GATA2.Induktion von ER mit erythro- und Megakaryozyten Potential erfordert GATA2 und TAL1. Die Zugabe LMO2 die Ausbeute an erythro-Megakaryozyten-Zellen aus hPSCs in Gegenwart GATA2 und TAL1 10 deutlich verbessert.
2. hPSCs Kultur Protocol
- Wachsen pluripotente Stammzellen in engen Kolonien mit scharfen Kanten zu 70-80% Konfluenz vor Subkultivierung. Mark und entfernen sich spontan vor Passagieren Zellen differenziert Kolonien.
- Verdünnter kommerziellen extrazellulären Matrix-Gel (siehe Tabelle 2) gemß den Anweisungen des Herstellers und Mantel 6-Well-Platten über Nacht bei 4 ° C oder für mindestens eine Stunde bei 37 ° C vor der Verwendung. Vor der Passage-Zellen, saugen Sie den Matrix 2 ml frischem kommerziellen kompletten Kulturmediums (siehe Tabelle 2) und halten Platten bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen bereit für die Aussaat.
- Passage hPSCs
- Aspirate Medium aus einem konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte mit hPSCs und fügen Sie 1,5 ml vorgewärmten Dispase II-Lösung (2 mg / ml in DMEM / F12, durch Filtration durch 0,22 um Filter sterilisiert). Inkubation für 5-7 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Ränder der Kolonien beginnen, von der Oberfläche zu heben.
- Saugen Sie Dispase II Lösung und vorsichtig waschen die Kolonien zweimal durch Zugabe und Absaugen von 2 ml frischem DMEM / F12-Medium. Dann, mit einem 5 ml serologische Glaspipette, distanzieren hPSCs mit 3 ml frisches kommerziellen komplettem Kulturmedium (siehe Tabelle 2) durch Pipettieren Zellsuspension nach oben und unten mehrere Male.
- 0,5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, die 1,5 ml handelsüblicher vollständigen Kulturmedium (siehe Tabelle 2). Agitieren Platte hin und her, und von rechts nach links mehrmals, um eine gleichmäßige Zellverteilung gewährleisten, wenn situieren die Platte in den Inkubator. Halten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 18-24 Std.
- Am nächsten Tag Änderungsmedium an die frische kommerziellen komplettem Kulturmedium (siehe Tabelle 2) und untersuchen hPSCs Morphologie. Erfolgreiche Passagieren Ergebnisse in kleinen, gut befestigt Kolonien Halte HPSC Morphologie. hPSCs müssen 2,5-3 ml freshmedium pro Well täglich gefüttert und alle 4-5 Tage passagiert bei nicht mehr als 70-80% Konfluenz.
HINWEIS: Wenn hiPSCs wurden auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) erhalten, müssen sie, um Feeder-freien Bedingungen übertragen und 2-3 mal passagiert, bevor eine effiziente Transduktion Differenzierung gewährleisten.
3. Induktion von Hematoendothelial Pprecursors von hPSCs (Tag 0, Transduktion hPSCs)
- Zur Herstellung von Reaktionsmedium kombiniert 1,3 ml kommerziellen komplette Serum-freiem Medium (siehe Tabelle 2), Viren, Polybren und Y27632 ROCK-Inhibitor (Tabelle 1): in 1,3 ul 10 mM ROCK-Hemmer zu 1,3 ml Medium zu einer endgültigen Konzentrationention von 10 uM und Polybren bis zu einer Endkonzentration 6 ug / ml.
- Hinzufügen einer geeigneten Menge an Viruskonzentrat (e) in einer Endkonzentration von 0,5-1,0 MOI (multiplicity of infection) von jedem Virus pro Zelle. Halten Reaktionsmedium auf Eis oder bei 4 ° C, bis die Einzelzellsuspension bereit ist.
HINWEIS: Die gleiche Menge des MOI für jeden Virus im GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 und GATA2 / TAL1 / LMO2 Reaktionsmischungen ist optimal für die Induktion der Differenzierung. Doch in ETV2 / GATA2 transduzierten Kulturen verdoppelt MOI für GATA2, bezogen auf ETV2 verbessert Differenzierung. Daher ist für diesen Kulturen im Verhältnis 1: 2 zur MOI von ETV2 und 1 MOI von GATA2 empfohlen (zB wenn Viruskonzentrat etwa 6,8 x 10 7 Partikel / ml geschätzt, mit 10 ul ETV2 und 20 ul GATA2 viralen Konzentrate 0,68 x 10 6 Zellen pro ETV2 / GATA2 Reaktion in einem 35-mm-Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen).
- Hinzufügen einer geeigneten Menge an Viruskonzentrat (e) in einer Endkonzentration von 0,5-1,0 MOI (multiplicity of infection) von jedem Virus pro Zelle. Halten Reaktionsmedium auf Eis oder bei 4 ° C, bis die Einzelzellsuspension bereit ist.
- Bereiten hPSCs in einer einzelnen Zelle suspension.
- Wachsen hPSCs in Feeder-freien Bedingungen, wie in Kapitel 2 beschrieben Am Tag 4 nach der letzten Durchgang, beachten Zelldichte und Morphologie unter einem inversen Mikroskop. hPSCs sollte in engen Kolonien mit scharfen Kanten ohne spontane Differenzierung am Tag der Transduktion wachsen und ~ 60-70% Konfluenz.
- Absaugen Medium, fügen Sie 1,5 bis 2 ml kommerziellen Zelldissoziation Reagenz (Tabelle 1) pro Vertiefung und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 5-7 min.
- Sammeln Zellen in gleichen Volumina von kommerziellen Vollmedium (siehe Tabelle 2) mit 10 & mgr; M von ROCK-Hemmer, zählen Sie die Zellen und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min und anschließend hat ein Resuspendieren Zellen in kommerziellen Komplettmedium mit 10 & mgr; M von ROCK-Inhibitor in einer Konzentration von 3.4-5 x 10 6 Zellen pro ml.
BEACHTEN SIE: Die Zelllebensfähigkeit ist entscheidend für eine erfolgreiche virale Transduktion und nachfolgende Differenzierung.In der Regel sollte die Lebensfähigkeit der Zellen vor der Transduktion 90% überschreiten.
- Fügen Sie 200 ul der Zellsuspension, enthaltend 0,68 bis 1 x10 6 Zellen, in 1,3 ml der nach 3.1 hergestellten Reaktionsmedium.
- Saugen Sie das Matrix-Lösung aus der Nacht beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen in 2.2 vorbereitet. Transfer der Reaktionsmischung auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und zu verteilen Zellen gleichmäßig. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Std. Nach 24 Stunden mindestens 80% der Zellen sollte die Matrix gebunden werden.
4. Die Induktion von Hematoendothelial Vorstufen aus hPSCs (Tag 1-7)
- 24 Stunden nach der Transduktion, entfernen virushaltige Medium und waschen anhaftenden Zellen mit kommerziellen unvollständige Zellkulturmedium (siehe Tabelle 1) und fügen Sie dann 3 ml pro Vertiefung der Handels unvollständige Zellkulturmedium, das hämatopoetische Zytokine: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml bFGF 20 ng / ml (im folgenden als 3F-Medium bezeichnet).
- Ersetzen Gesamt Medium durch frisches 3F-Medium an den Tagen 2, 3 und 4. Tag, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Tag 4, als schwimmende blutbildenden Zellen entstehen, ersetzen Sie die Hälfte der 3F-Medium jeden zweiten Tag, während das Gesamtvolumen bei 4 ml.
HINWEIS: pSIN-EF1 & agr; lentiviralen Expressionsplasmiden beinhalten Puromycinresistenzgen wodurch eine positive Selektion von transduzierten Zellen. Die 1 ug / ml Puromycin kann während der ersten 1-2 Tage der Differenzierung zu Medium zugegeben werden, um die zurückbleibende undifferenzierte hPSCs eliminieren. - Beachten Zellmorphologie am Tag 4 unter einem inversen Mikroskop: tight Cluster von Zellen mit typischen endotheliale Morphologie beginnen zu erscheinen (2A, 3A). Runde Blutkörperchen scheint von Tag 5 bis Tag 7 der Differenzierung, während einige Bereiche können hPSCs Morphologie beibehalten. Analyse HE und hämatopoetische Differenzierung wie unten beschrieben.
ANMERKUNG: Erfolgreiche hematoendothelial verschiedeneniation führt zu der Produktion von Blutzellen, die lose auf die zugrunde liegenden flachen Endothelzellen gebunden als lichtbrechenden Rundzellen angezeigt. Diese Zellen aktiv vermehren Bildung kleiner Aggregate und schließlich lösen und Schwimmer (2A und 3A). Live Blutkörperchen kann visuell von den toten und sterbenden Zellen auf ihre Fähigkeit, das Licht zu reflektieren und in Kulturbedingungen zu erweitern.
5. Analyse der Hemogenic Endothel (HE) Stadium der Differenzierung.
- Detektieren die Bildung von HE zwischen den Tagen 3 und 4 der Differenzierung durch mikroskopische Beobachtung der Zellen mit endothelialen Morphologie. Es gibt keine schwimmBlutZellen in der Kultur in diesem Stadium der Differenzierung. Die Anwesenheit von HE kann durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt und durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung von VE-Cadherin, CD73, CD226 und CD43 Antikörper.
- Um HE Bildung durch Durchflusszytometrieanalyse Verwendung Zellen an Tag 3 zu bewertenTag und 4 von einem Experiment. Sammeln Zellen durch Inkubation der Kulturen mit kommerziellen Zelldissoziation Reagenz (siehe Tabelle 1) für 5-10 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und dann mit bis zu 1 x 10 5 Zellen pro Farbreaktion (Durchflusszytometrie beschrieben Färbeverfahren 12).
HINWEIS: VE-Cadherin + HE-Zellen die Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD226 zu erwerben, aber nicht über die Expression von CD73 und CD43 6. Im Gegensatz dazu nicht-HE-Zellen exprimieren CD73 (2B, 3B).
- Um HE Bildung durch Durchflusszytometrieanalyse Verwendung Zellen an Tag 3 zu bewertenTag und 4 von einem Experiment. Sammeln Zellen durch Inkubation der Kulturen mit kommerziellen Zelldissoziation Reagenz (siehe Tabelle 1) für 5-10 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und dann mit bis zu 1 x 10 5 Zellen pro Farbreaktion (Durchflusszytometrie beschrieben Färbeverfahren 12).
- Immunfluoreszenzfärbung für HPSC stamm er.
- Wäscht den beigefügten Monoschicht von Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dann zu fixieren Zellen in 4% Paraformaldehyd bei 30 bis 60 min bei Raumtemperatur.
- Wasche die Zellen einmal mit PBS und dann permeabilisiert mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen in PBS zwei bis drei Mal und dann in inkubierenBlockierungspuffer, bestehend aus PBS mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), für 30 bis 120 min.
- Vorbereitung Färbelösung, enthaltend sowohl primären Antikörper (1: 1000 Verdünnung) Maus-Anti-Human-CD43 und Kaninchen-Anti-Human-VE-Cadherin in PBS mit 5% FBS, (Tabelle 1).
- Saugt den Blockierungspuffer von den Zellen und mit 1 ml pro Vertiefung Färbepuffer mit den zugesetzten primären Antikörper; inkubieren 3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Durch Zugabe von 2 ml PBS mit 5% FBS wasche die Zellen dreimal.
- Vorbereitung einer zweiten Färbepuffer mit sekundären Antikörper bei einer 1: 500 Verdünnung in PBS mit 5% FBS: Esel-Anti-Kaninchen mit grün fluoreszierenden Farbstoff und Anti-Maus mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff (Tabelle 1) konjugiert. 1 ml pro Vertiefung Sekundär Färbepuffer und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- Dreimal mit PBS ohne Serum zu waschen. Stain-Zellen mit 300 nM DAPI-Arbeitslösung in dH2 O für 10-15 min.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie 2-3 ml PBS in gut mit gefärbten Zellen. Beachten Fluoreszenz mit grünen, roten und blauen Mikroskop Filter.
6. Analyse von induzierten hämatopoetischen Präkursoren
- Pflegen Differenzierungskulturen bis zum schwimmenden Zellen deutlich zu erweitern, bis zu 10-14 Tage, wechselnde Hälfte des 3F-Medium, wie in 3.1 beschrieben, alle zwei Tage.
- Dissoziieren und sammeln Differenmonoschichten von Zellen, die durch Behandlung von Zellen mit einem kommerziellen Zelldissoziation Reagens (siehe Tabelle 1) für 5-10 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Führen Durchflusszytometrie unter Verwendung anti-VE-Cadherin, CD43 und CD45 Antikörper gegen die Blutbildung in Kulturen 12 zu bewerten. Beachten Sie, dass ein großer Anteil der Zellen, bis zu 40% der ETV2 und GATA2 transduzierten Zellen koexprimiert VE-cad und CD43. Die folgenden Antikörper können verwendet werden, um spezifische Zelllinien folgende E erfassenxpansion oder Differenzierung von induzierten Blutvorläuferzellen: CD235a (Erythrozyten), CD41a (Megakaryozyten), CD32 (alle Arten von Knochenmarkzellen), CD66b (Neutrophile) und CD163 (Makrophagen).
- Zuführen CFC-Assay unter Verwendung eines kommerziellen klonogenen Medium (Tabelle 1) nach den Anweisungen des Herstellers.
- Transfer 1-2 × 10 4 Zellen in 3 ml handelsüblicher klonogenen Medium (siehe Tabelle 3), um die Anzahl der koloniebildenden Zellen und Arten von hämatopoetischen Kolonien zu bewerten. Optimale Aussaatdichte ermöglicht die Identifizierung und Isolierung von einzelnen Kolonien, die getrennt voneinander wachsen und sich nicht überlappen. Aussaatdichte kann zwischen den Experimenten abhängig von Differenzierung Effizienz variieren, aber sollte 1 x 10 4 Zellen pro 1 ml kommerziellen klonogenen Mediums nicht übersteigt.
- Mischen Sie Zellen in kommerziellen klonogenen Medium durch sanftes Vortexen, und übertragen 3 ml Suspension zu zwei 35 mm Ultra-Low-Befestigungs Gerichtefür CFC-Assay wurden 1,5 ml der Suspension in jede Schale. Medium gleichmäßig verteilen und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 14 Tage. Vermeiden Sie das Geschirr zu stören; beobachten, Koloniebildung am Tag 7 und Tag 10 des Tests.
- Zu identifizieren und zu zählen hämatopoetischen Kolonien nach ihrer Morphologie am Tag 14.
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Representative Results
Die schematische Darstellung des HE und Blut Induktion aus hPSCs durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren ist in Abbildung 1 ETV2 mit GATA1 oder GATA2 Kombination gezeigt, induziert pan-myeloischer Blutbildung, während ein GATA2, TAL1 +/- LMO2 Kombination induziert vorwiegend erythro-megakaryozytären Hämatopoese. Beide TF-Kombinationen direkt induzierte HE-Zellen, die anschließend in Blutvorläuferzellen mit einem ausgeprägten Spektrums von hämatopoetischen Differenzierung verwandelt. Differenzierung von hPSCs vom pluripotenten Zustand, um den Blut produziert er auf durchschnittlich 4 Tage. Runde Blutkörperchen ersten hervor für Tag 5 der Differenzierung. Anschließend erscheint zahlreichen schwimmenden Blutzellen und in den Kulturen zu erweitern. Um die Anzahl der schwimmenden Blutzellen zu maximieren, können nach der Transduktion Kulturen 10-14 Tage verlängert werden. Die gewünschte Linie von Zellen können in Niedrighaftbedingungen mit der entsprechenden Kombination von hämatopoetischen Zytokine erweitert werden. Abbildung 2 DMonstrates die Induktion von Blut aus hPSCs Verwendung ETV2 und GATA1 oder GATA2 TFs. Nach einer Transduktion mit ETV2 und GATA2 Zellen erwerben eine typische endotheliale Morphologie am Tag 4 der Differenzierung, und schließlich in runde Blutzellen (Tag 6-8 der Differenzierung (2A) zu transformieren. Die Zellen an den Tagen gesammelt 3-4 der Differenzierung zeigen eine typische VE-Cadherin + CD226 + CD73 -. HE Phänotyp (2B, 3B) von Tag 7 der Differenzierung mehr als 50% der VE-Cadherin + Zellen erwerben die hämatopoetischen CD43 + Phänotyp (2C) FCKW-Assays GATA2 / ETV2. induzierte Zellen zeigen, dass Kolonien von hoher Proliferationspotential (HPP) FCKW enthalten, Erythroid (E) FCKW, Makrophagen (M) FCKW und Granulozyten (G) FCKW (2E). Die hematoendothelial Differenzierung hPSCs folgenden Überexpression von GATA2 und allein oder mit TAL1LMO2 ist in Abbildung 3 HE Bühne gezeigt wird am besten in Kulturen mit GATA2 und TAL1 identifiziert. Die Zugabe von LMO2 beschleunigt Differenzierung und deutlich Verträge HE Bühne. Die GATA2 und TAL1 Kombination allein oder mit LMO2 zeigt Differenzierung und Reifung von Blutvorläuferzellen zu meist erythroiden und megakaryozytischen Zellen Figur 3D und 3E. 4 zeigt die Optimierung der Transduktionseffizienz in H1 hESCs mit GFP Lentivirus (A) und Zelltod und Differenzierung Effizienz in Kulturen mit GATA2 / TAL1 / LMO2 bei hohen und niedrigen MOI transduziert.
Abb. 1: Schematische Darstellung der Protokoll für die Induktion von hemogenic Endothel und Blutzellen über die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren Cartoon skizziert wichtigsten experimentellen Schritte und Fristen. Nach der Herstellung der Einzelzellsuspension werden hPSCs mit TF transduziertens und gesät auf Matrix in komplette kommerzielle Serum-freiem Medium. Am nächsten Tag wird das Medium mit Wachstumsfaktor-freien kommerziellen Medium mit bFGF, TPO und SCF (3F Medium) ergänzt ersetzt. Nach 3-4 Tagen Kultur, er ist gebildet. Anschließend durchläuft HE endotheliale hämatopoetische Übergang unter Bildung von mehrfachen Blutzellen.
Abbildung 2:. ETV2 / GATA2-induzierte Differenzierung von hPSCs (A) Phasenkontrastbilder von ETV2 / GATA2-induzierte Differenzierung in H1 hESCs an den Tagen 2, 4, 6 und 8 nach Transduktion; Maßstabsbalken, 100 um. (B) Durchflusszytometrische Analyse ETV2 / GATA2-induzierte endotheliale Zellen, die eine hämatopoetische Übergang an Tag 3 der Differenzierung: VE-Cadherin + HE-Zellen exprimieren CD226 und es fehlt ihnen die Expression von CD73. Ein kleiner Prozentsatz der CD73 exprimieren Endothelzellen (Nicht-HE). (C) Durchflusszytometrische einnalyse von ETV2 / GATA1- und ETV2 / GATA2 induzierten H1 hPSCs am 7. Tag nach der Transduktion. (D) Durchflusszytometrische Analyse ETV2 / GATA2-induzierten hämatopoetischen Zellen in Medium mit FBS und SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF und EPO ergänzt für 14 Tage erweitert. (E) Art des hämatopoetischen Kolonien aus ETV2 / GATA2 transduzierten Zellen in CFC-Assay und entsprechende Wright-gefärbten Cytospins darstellt Erythroid (E), Makrophagen (M), Granulozyten (Gr) und eine hohe Teilungsfähigkeit Kolonien (Wasserkraftwerke) gebildet ist. Maßstabsbalken für CFC-Assay, 250 & mgr; m, für Cytospins, 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 3: GATA2 / TAL1 und GATA2 / TAL1 / LMO2-induzierte Differenzierung von hPSCs (A) Phasenkontrastbilder von GATA2 / TAL1 / LMO2induzierte Differenzierung in H1 hESCs an den Tagen 2, 4, 6 und 8; Maßstabsbalken, 100 um. (B) Durchflusszytometrische Analyse GATA2 / TAL1-induzierte endotheliale Zellen, die eine hämatopoetische Übergang an Tag 3 der Differenzierung: VE-Cadherin + Zellen die Expression von ER Marker CD226 zu erwerben. Ein kleiner Prozentsatz der CD73 exprimieren Endothelzellen (Nicht-HE). (C) Immunfluoreszenzfärbung von GATA2 / TAL1-induzierte Differenzierung in H1 hESC, Tag 5; VE-Cadherin + Zellen (grün) zu erwerben Ausdruck von hämatopoetischen Marker CD43 (rot). (D) Durchflusszytometrische Analyse GATA2 / TAL1 / LMO2-induzierte hämatopoetischen Kulturen in Suspension am Tag 14 nach der Transduktion folgenden Expansion in serumfreien Medium mit SCF, TPO, EPO und bFGF supplementiert; (E) Art des hämatopoietischen Kolonien in CFC-Assay durch GATA2 / TAL1 / LMO2 differenziert cellsand entsprechenden Wright-gefärbten Cytospins darstellt Erythroid (E), Makrophagen (M), und M gebildetegakaryocytes (Mk). Maßstabsbalken für CFC-Assay, 250 & mgr; m, für Cytospins, 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Optimierung von lentiviralen Transduktion Verfahren (A) Transduktion von H1 hESCs mit unterschiedlichen MOI von GFP Lentivirus.. (B) Zelllebensfähigkeit und Differenzierungseffizienz in Kulturen mit GATA2 / TAL1 / LMO2 transduzierten bei niedrigen (1 für jedes Virus) und hoher (2 für jedes Virus) MOI.
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Discussion
Das oben beschriebene Verfahren zur hämatopoetischen Differenzierung hPSCs durch Überexpression von TFs, stellt ein schnelles und effizientes Konzept für die Erzeugung von HE und myeloiden und erytho-magakaryocytic Progenitoren aus HES und iPSCs, wodurch die Produktion von bis zu 30 Millionen Blutzellen aus Million pluripotenten Stammzellen 10. Diese Methode zeigte konsequente Differenzierung in mehreren hESC und iPSCs Leitungen 10. Während der Differenzierung von ETV2 und GATA2, GATA1 Faktoren sowie GATA2 und TAL1 Faktoren, Zellen bilden Blut Herstellung Endothel, HE und eine Endothel, um hämatopoetische Übergang zu unterziehen. Bildung von meist ist er zwischen den Tagen 3 und 4 der Differenzierung beobachtet. Zugabe LMO2, eine transkription Cofaktor TAL1, zum GATA2 und TAL1 Kombination deutlich erhöht die Robustheit der Differenzierung, während die HE Stufe wurde deutlich kontrahiert.
Der Erfolg gerichtet differentiation von hPSCs durch Transkriptionsfaktoren, hängt im wesentlichen von (i) einem wirksamen Transport von Nukleinsäuren in Zellen, (ii) die Zelllebensfähigkeit folgenden genetischen Manipulationen, und (iii) einer wirksamen Übersetzung exogener Transkripte innerhalb der Zelle.
Einer der wichtigsten Schritte des beschriebenen Verfahrens ist die Herstellung von wirksamen lentiviralen Einheiten, die auf einem genauen pH für HEK 293T Zelltransfektion abhängt, und die Abwesenheit von Endotoxinverunreinigungen auf allen Stufen der Virusproduktion und Transduktionsexperimente. Die Integrität aller Konstrukte, einschließlich Verpackung und Umhüllung Plasmide, muss überprüft werden, wenn keine Anzeichen für die virale Produktion in HEK 293T-Zellen beobachtet wird 13.
Die Differenzierung Protokoll-Design unter Verwendung von Kombinationen von Transkriptionsfaktoren sollte mehrere Variablen zu berücksichtigen. Hohe Effizienz der Virusübertragung ist wichtig für eine erfolgreiche Differenzierung. Da Transduktionseffizienz hängt von dem Verfahren zur Virus verwendetHerstellung und Reinigung optimieren HPSC Transduktion unter Verwendung eines GFP-lentiviralen Vektor empfohlen (4A). Virale Integration nach Transduktion sollte Verwendung genomischer PCR mit Transgen spezifischen Primern (Tabelle 3) bestätigt werden. Differenzierung Optimierung sollte auch Anpassung lentiviralen Konzentration in der Reaktionsmischung. Eine relativ geringe Menge an Virus, MOI von 0,5-1, induzieren kann HPSC Differenzierung. Während ein höheres Trägheitsmoment erhöht die Effizienz der Differenzierung, sondern erhöht auch den Zelltod (Figur 4B). Zusätzliche Optimierungsschritt MOI Verhältniseinstellung für jedes Virus in der Reaktionsmischung enthalten. In GATA2 / ETV2 transduzierten Kulturen, die Verdoppelung der MOI für GATA2, bezogen auf ETV2, erhöht die Wirksamkeit der Differenzierung. Für GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 und GATA2 / TAL1 / LMO2 gleich MOI für jedes Virus ist optimal.
Nach einer Transduktion mit TFs, die große Mehrheit von Zellen Underwent angiohematopoietic Differenzierung, während nur sehr wenige Zellen zurückgehalten eine undifferenzierte Morphologie. Da pSIN-EF1 lentiviralen Vektoren integrieren Antibiotikaresistenz, kann die Behandlung von Kulturen, die mit Puromycin verwendet, um Rest undifferenzierten Zellen zu eliminieren.
Die Bildung von Zellen mit charakteristischer endothelialen Morphologien, und anschließende Rund Blutkörperchen, weisen auf eine erfolgreiche Differenzierung. Im Durchschnitt, produziert das GATA2 / ETV2 Kombination 40-50% der CD43 + VE-Cadherin +/- Blutzellen am Tage 9-10 der Differenzierung mit bis zu 30% der Zellen verbleibende VE-Cadherin + CD43 -. GATA1 / ETV2 Kombination induziert CD43-Expression schneller und erzeugt eine größere Anzahl von CD43 + -Zellen im Vergleich zu dem GATA2 / ETV2 Kombination. In diesen Kulturen, die Mehrheit der CD43 + Zellen koexprimiert VE-Cadherin. In Kulturen mit GATA2 / TAL1, die Zahl der CD43 + -Zellen in der Regel erreicht transduziert 40-50%. Die Zugabe von LMO2 zu GATA2 / TAL1 erheblich beschleunigt und verbessert die Blutbildung und stark zusammenzieht die endotheliale Entwicklungsstadium.
Koloniebildenden Assays verwendet, um die Häufigkeit und die Art der induzierten hämatopoetischen Vorläuferzellen zu bestimmen. Die Art der Kolonie-bildenden Zellen können durch Herstellen Wright-gefärbten Cytospins von einzelnen Kolonien bestätigt. hPSCs mit ETV2 und GATA2 transduzierten produzieren meist groß (größer als 0,5 mm im Durchmesser) Hoch proliferative Potential (HPP) myeloischen Kolonien von unreifen Granulozyten und Monozyten-Zellen zusammengesetzt, mit einigen reifen myeloischen Zellen und gelegentliche erythroiden und Megakaryozyten-Zellen. Im Durchschnitt mehr als 80% der FCKW in GATA2 / ETV2 transduzierten Kulturen myeloischen Wasserkraftwerke. Darüber hinaus sind diese Kulturen erzeugen erythroiden und Makrophagenkolonien (2E), die üblicherweise weniger als 20% der gesamten CFC. HPSC Transduktion mit ETV2 und GATA1 deutlich erhöht the Verhältnis von CFC-E bis zu 50%. TAL1 und GATA2 transduzierten Kulturen produzieren vorwiegend erythroide (mehr als 80% der gesamten CFC) und Megakaryozyten-Kolonien (mehr als 10% der gesamten CFC) mit sehr wenigen Makrophagenkolonien (weniger als 5% der gesamten CFC). Die Zugabe LMO2 zum TAL1 und GATA2 Kombination erhöht die Frequenz der koloniebildenden Zellen mit erythro-Megakaryozyten-Potential 10. Das Muster der CFC-Aktivität nach Transduktion mit den beschriebenen Kombinationen von Transkriptionsfaktoren ist konsistent zwischen verschiedenen hESC und hiPSC Leitungen 10.
Zusammenfassend lentiviralen-vermittelte Überexpression in hPSCs ist ein relativ schnelles und effizientes Tool für die Induktion von ER und Blut mit TFs. Dieses System kann auch für die Beurteilung der Differenzierungsfähigkeit anderer TFs verwendet werden, und diejenigen auszuwählen, die für Endothel- und blutbildenden Spezifikation erforderlich sind. Allerdings hat die aktuelle Protokoll ein begrenztem Nutzen für die Untersuchung der exzellulären Signalisierung bei der Induktion von HE beteiligt, da es verwendet TFs, die Oberflächenrezeptor-vermittelten Signal umgehen. Obwohl die aktuelle Protokoll beschreibt die Blutbildung mit Hilfe der konstitutiven Expression eines Transgens, könnten ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von modifizierten mRNAs 10 erhalten werden.
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Disclosures
IS ist Gründungsaktionär und Berater für Cynata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
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| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
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| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
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| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
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