Direkte Induksjon av Hemogenic endotelet og Blood av Overekspresjon av transkripsjonsfaktorer i Human Pluripotent stamceller

Abstract

Under utviklingen hematopoetiske celler oppstå fra en spesiell undergruppe av endotelceller, hemogenic endotel (HE). Modellering HE utvikling in vitro er vesentlig for mekanistiske undersøkelser av endotelial-hematopoetiske overgang og hematopoetisk spesifikasjon. Her beskriver vi en fremgangsmåte for effektiv induksjon av HE fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) ved hjelp av overekspresjon av forskjellige sett av transkripsjonsfaktorer. Kombinasjonen av ETV2 og GATA1 eller GATA2 TFS blir brukt til å indusere HE med pan-myeloid potensiale, mens en kombinasjon av GATA2 og TAL1 transkripsjonsfaktorer gjør det mulig for produksjon av HE med erytroid og megakaryocytic potensial. Tilsetting av LMO2 til GATA2 og TAL1 kombinasjon vesentlig akselererer differensiering og øker erytroid og megakaryocytic celler produksjon. Denne metoden gir en effektiv og rask måte å HE induksjon fra hPSCs og tillater observasjon av endotelial-hematopoietic overgang i en kultur tallerken. Protokollen inkluderer hPSCs transduksjon prosedyrer og post-transduksjon analyse av HE og blodstamfedre.

Introduction

Den unike evnen av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) å fornye seg selv og til å differensiere i celler av de tre bakterie lag, inkludert blod, gjøre dem et verdifullt verktøy for mekanistiske studier av blodkreft utvikling, modellering av blodsykdommer, narkotika screening, toksisitetsstudier, samt utvikling av mobilnettet terapier. Fordi bloddannelse i embryo inntektene fra hemogenic endotel (HE) gjennom en endothelial hematopoietisk overgang ^1,2, vil genereringen av HE i kulturer være avgjørende for å studere de molekylære mekanismene som regulerer endotelial til hematopoetiske overgang og hematopoetisk spesifikasjon. Aktuelle fremgangsmåter for studier av HE er basert på induksjon av differensiering i hematoendothelial aggregater (EBS) med tillegg av hematopoetiske cytokiner ^3-5, og coculture av hPSCs med hematopoiesis støttende stromaceller ^6,7 eller i to-dimensjonale kulturer med ekstracellulære matriser og cytokines ^8,9. Disse klassiske differensierings metoder er basert på innføring av eksterne signaler som virker på celleoverflaten og initiere kaskader av molekylære reaksjonsveier som til slutt fører til aktivering av transkripsjonen program førings hematoendothelial utvikling. Således effektiviteten av hPSCs differensiering i disse systemene er avhengig av en effektiv induksjon av disse signalene, signaltransduksjon til kjernen, og den resulterende aktivering av spesifikke transkripsjons regulatorer. I tillegg har studier av HE i konvensjonelle differensierings kulturer krever ytterligere trinn for isolering HE celler ved hjelp av cellesortering. Her beskriver vi en enkel protokoll for direkte induksjon av HE og blod ved overekspresjon av blodkreft transkripsjonsfaktorer. Denne metoden gjør det mulig for effektiv induksjon av HE i en skål og direkte observasjon av endotelial til hematopoetiske overgang uten behov for isolering av HE ved hjelp av en cellesortering tungvint prosedyre.

Dannelse av HE og blod fra menneskelige pluripotente stamceller kan effektivt indusert av overekspresjon bare noen transkripsjonsfaktorer (TFS). Den optimale kombinasjonen av TFS som kan indusere robust pan-myeloid hematopoiesen fra hPSCs inkluderer ETV2 og GATA1 eller GATA2. I kontrast, kombinasjon av GATA2 og TAL1 induserer erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmering hPSCs gjennom overekspresjon av disse faktorene skiller hPSCs direkte til VE-cad ⁺ CD43 ^- CD73 ^{- han} celler som gradvis erverve blodkreft fenotype definert av uttrykk for tidlig blodkreft markør CD43 ^7. Dette lentiviral basert metode for direkte programmering av human flerpotent stamceller Metoden er anvendelig for generering av HE og blodceller for mekanistiske undersøkelser, studier av endotelial til hematopoetiske overgang, og transkripsjonsregulering av hematopoetiske utvikling og spesifikasjon. Selv om cjeldende protokollen beskriver blod produksjon ved hjelp konstituerende uttrykk for transgener, lignende resultater kan oppnås ved hjelp av endret mRNA ^10.

Protocol

1. Virus Forberedelser og transkripsjonsfaktor Kombinasjoner

1. Forbered løsninger med pSIN-EF1α lentiviral uttrykk plasmid som inneholder protein-kodende DNA for ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 og LMO2 (tabell 1).
2. Måle konsentrasjonen og renheten av plasmid preparater som brukes for lentiviral produksjon ved å registrere UV-absorpsjon med et spektrofotometer ved 230 nm, 260 nm og 280 nm. Merk: DNA-preparater som viser A260 / 280 og A260 / 230-verdier større enn 1,8 er generelt ansett god kvalitet. Lavere A260 / 280-verdier kan indikere protein forurensning, mens lavere A260 / 230 verdier indikerer forurensninger med salter eller noe oppløsningsmiddel, så som fenol. Anbefalt plasmid-konsentrasjonen er 1-3 ug / ul.
3. Produsere lentiviruses for transductions som beskrevet i tidligere publiserte protokoller ^11. Induksjon av HE med pan-myeloid potensialet krever co-uttrykk for ETV2 og GATA1, eller ETV2 og GATA2.Induksjon av HE med erytro- og megakaryocytic potensial krever GATA2 og TAL1. Tilsetningen av LMO2 forbedrer utbyttet av erytro-megakaryocytic celler fra hPSCs i nærvær av GATA2 og TAL1 ^10.

2. hPSCs Kultur Protocol

1. Grow pluripotente stamceller i trange kolonier med skarpe kanter til 70-80% konfluens før subdyrking. Mark og fjerne spontant differensiert kolonier før aging celler.
2. Fortynn kommersiell ekstracellulære matriks-gel (se tabell 2) i henhold til produsentens instruksjoner og belegge seks-brønns plater over natten ved 4 ° C, eller i minst en time ved 37 ° C før bruk. Før aging celler, Aspirer matrisen, tilsett 2 ml frisk kommersiell fullstendig culturemedium (se tabell 2) og holde platene ved 37 ° C, _5% CO2 inntil cellene er klare for såing.
3. Passage hPSCs
   1. Aspirate medium fra en sammenflytende brønn av en 6-brønns plate med hPSCs og tilsett 1,5 ml forvarmet Dispase II-løsning (2 mg / ml i DMEM / F12, sterilisert ved filtrering gjennom 0,22 um filter). Inkuber i 5-7 minutter ved 37 ° C, _5% CO2 inntil kantene av koloniene begynner å løfte seg fra flaten.
   2. Sug av Dispase II-løsning, og grundig vaske koloniene to ganger ved å tilsette og deretter aspirering av 2 ml friskt DMEM / F12-medium. Deretter, ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette glass, dissosiere hPSCs med 3 ml frisk kommersiell komplett kulturmedium (se tabell 2) ved å pipettere cellesuspensjon opp og ned flere ganger.
   3. Tilsett 0,5 ml av cellesuspensjon til hver brønn i en 6-brønners plate inneholdende 1,5 ml av kommersielt komplett kulturmedium (se tabell 2). Agitere plate frem og tilbake og høyre til venstre flere ganger for å sikre en ensartet cellefordeling når plassere platen inn i inkubatoren. Holde-celler ved 37 ° C, _5% CO2 i 18-24 timer.
   4. Den neste dag endringen medium til frisk kommersiell fullstendig kulturmedium (se tabell 2) og undersøke hPSCs morfologi. Vellykket aging resultater i små, godt festet kolonier feste hPSC morfologi. hPSCs må mates med 2,5-3 ml freshmedium per brønn på en daglig basis og passaged hver 4-5 dager uten mer enn 70-80% samløpet.
      MERK: Hvis hiPSCs ble opprettholdt på mus embryonale fibroblaster (MEFs), de trenger å bli overført til mater-frie forhold og passert 2-3 ganger før transduksjon å sikre effektiv differensiering.

3. Induksjon av Hematoendothelial Pprecursors fra hPSCs (dag 0, Transduction av hPSCs)

1. For å fremstille reaksjonsmediet kombinere 1,3 ml av kommersiell fullstendig serumfritt medium (se tabell 2), virus, polybren, og Y27632 ROCK inhibitor (tabell 1): Tilsett 1,3 mL av 10 mM ROCK inhibitor til 1,3 ml medium til en final-konsentrasjonersjon på 10 pM, og polybren til en sluttkonsentrasjon 6 pg / ml.
   1. Tilsett en passende mengde av viruskonsentrat (e) ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-1,0 MOI (multiplisitet av infeksjon) av hvert virus pr celle. Holde reaksjonsmedium på is eller ved 4 ° C inntil enkeltcellesuspensjonen er ferdig.
      MERK: Den samme mengde MOI for hvert virus i GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, og GATA2 / TAL1 / LMO2 Reaksjonsblandingene er optimal for induksjon av differensiering. Men i ETV2 / GATA2 transduserte kulturer dobling MOI for GATA2, i forhold til ETV2, forbedrer differensiering. Derfor, for disse kulturene, forholdet 1: 2 for MOI av ETV2 og en MOI av GATA2 anbefales (for eksempel hvis viral konsentrat er anslått ca 6,8 x 10 ⁷ partikler / ml, tilsett 10 mL av ETV2 og 20 pl GATA2 virus kraftfôr til 0,68 x 10 ⁶ celler per én ETV2 / GATA2 reaksjon i en 35 mm godt av en seks-brønns plate).
2. Forbered hPSCs i en enkelt celle suspdimensjonerte.
   1. Grow hPSCs i mater frie forhold som beskrevet i kapittel 2. På dag 4 etter siste passering, observere celletetthet og morfologi under en invertert mikroskop. hPSCs skal vokse i tette kolonier med skarpe kanter uten spontan differensiering og nå ~ 60-70% konfluens på dagen for transduksjon.
   2. Aspirer medium, tilsett 1,5 til 2 ml av kommersielt celledissosiasjon reagens (tabell 1) per brønn og inkuber ved 37 ° C med _5% CO2 i 5-7 min.
   3. Samle celler i like store volumer av kommersiell komplett medium (se tabell 2) med 10 pM av ROCK-inhibitor, telle cellene og bestemme levedyktigheten. Pellet cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter og deretter resuspender cellene i det kommersielle komplett medium med 10 pM av ROCK inhibitor til en konsentrasjon på 3.4-5 x 10 ⁶ celler pr ml.
      MERK: Celleviabilitet er avgjørende for vellykket viral transduksjon og påfølgende differensiering.Vanligvis bør cellenes levedyktighet før transduksjon overstige 90%.
3. Tilsett 200 ul av cellesuspensjonen, som inneholder 0.68-1 ^{X10-6-celler,} i 1,3 ml av reaksjonsmediet fremstilles i 3,1.
4. Aspirer matriseoppløsningen fra over natten belagte 6-brønns plate fremstilt i 2.2., Overføres reaksjonsblandingen til en brønn i en 6-brønns plate og fordele cellene jevnt. Inkuber ved 37 ° C med _5% CO2 i 24 timer. Etter 24 timer ved minst 80% av cellene skal være festet til matrisen.

4. Induksjon av Hematoendothelial Forstadier fra hPSCs (dag 1-7)

1. 24 timer etter transduksjon, fjerne virus-inneholdende medium og vask festede celler med kommersiell ufullstendig cellekulturmediet (se tabell 1), og deretter legge til 3 ml per brønn av kommersiell ufullstendig cellekulturmedium inneholdende hematopoetiske cytokiner: SCF 100 ng / ml TPO 50 ng / ml bFGF, 20 ng / ml (heretter referert til som 3F-medium).
2. Erstatt total medium med fersk 3F-medium på dager 2, 3 og dag 4 for å fjerne døde hudceller og rusk. Etter dag 4, når flytende hematopoetiske celler dukker opp, erstatte halvparten av 3F-medium annenhver dag og samtidig opprettholde det totale volumet på 4 ml.
   MERK: pSIN-EF1α lentiviral ekspresjonsplasmider innlemme puromycin motstand genet og dermed åpner for positiv utvelgelse av transduserte celler. 1 ug / ml puromycin kan tilsettes til mediet i løpet av de første 1-2 dagene av differensiering for å eliminere eventuelle resterende udifferensierte hPSCs.
3. Observere cellemorfologi på dag fire under en invertert mikroskop: tette klynger av celler med typiske endothelial morfologi begynner å vises (figur 2A, 3A). Runde blodceller vises fra dag 5 til dag 7 av differensiering, mens enkelte områder kan beholde hPSCs morfologi. Analyser HE og hematopoietiske differensiering slik det er beskrevet nedenfor.
   MERK: Vellykket hematoendothelial annerledesiation resulterer i produksjon av blodceller som fremkommer som refraktile runde celler løst festet til underliggende flate endotelceller. Disse cellene aktivt spre danner små aggregater, og til slutt løsne og flyte (figur 2A og 3A). Levende blodceller skiller seg visuelt fra de døde og døende celler basert på deres evne til å reflektere lys og ekspandere i dyrkningsforhold.

5. Analyse av Hemogenic endotelet (HE) Stage av differensiering.

1. Detektere dannelsen av HE mellom dag 3 og 4 av differensiering ved mikroskopisk observasjon av celler med endotelial morfologi. Det er ingen flytende blod celler i kultur på dette stadiet av differensiering. Tilstedeværelsen av HE kan bekreftes ved immunofluorescent farging og flowcytometrisk analyse ved hjelp av VE-cadherin, CD73, CD226 og CD43 antistoffer.
   1. For å vurdere HE dannelse av strømningscytometriske analyser anvender celler på dag 3og dag 4 fra ett eksperiment. Samle cellene ved inkubering av kulturer med kommersiell celledissosiasjon reagens (se tabell 1) i 5-10 minutter ved 37 ° C, _5% CO2, og deretter bruke opp til 1 x 10 ⁵ celler per fargereaksjon (flowcytometri fargeprosedyre som er beskrevet i ^12).
      MERK: VE-cadherin ⁺ HE-celler skaffe uttrykk for tidlig blodkreft markør CD226, men mangler uttrykk for CD73 og CD43 ^6. I kontrast, ikke-HE-celler uttrykker CD73 (Tall 2B, 3B).
2. Immunfluorescens farging for hPSC-avledet HE.
   1. Vask den vedlagte monolag av celler med fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter feste cellene i 4% paraformaldehyd 30-60 minutter ved romtemperatur.
   2. Vask cellene en gang med PBS og deretter permeabilize ved anvendelse av 0,1% Triton X-100 i PBS i 20 min ved romtemperatur.
   3. Vask cellene i PBS to til tre ganger og deretter inkuberes iblokkeringsbuffer bestående av PBS med 10% føtalt bovint serum (FBS), i 30 til 120 min.
   4. Forbered fargeløsning, inneholdende både primære antistoff (1: 1000 fortynning) muse-anti-human CD43 og kanin-anti-human-VE cadherin i PBS med 5% FBS, (tabell 1).
   5. Aspirer blokkering buffer fra cellene og tilsett 1 ml per brønn av flekker buffer med den ekstra primære antistoffer; inkuber 3 timer ved romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C.
   6. Vask cellene tre ganger ved tilsetning av 2 ml PBS med 5% FBS.
   7. Fremstille en andre farging buffer, inneholdende sekundære antistoffer ved 1: 500 fortynning i PBS med 5% FBS: esel anti-kanin-konjugert med grønt fluorescerende fargestoff, og anti-muse-konjugert med rødt fluorescerende fargestoff (tabell 1). Tilsett 1 ml pr brønn av sekundære flekker buffer og inkuber ved værelsestemperatur i 1 time.
   8. Vask tre ganger med PBS uten serum. Flekke celler med 300 nM DAPI arbeidsløsning i dH2 O i 10-15 min.
   9. Vask celler med PBS to ganger og tilsett 2-3 ml PBS inn godt med fargede celler. Observere fluorescens med grønne, røde og blå mikroskop filtre.

6. Analyse av indusert Hematopoetiske Forstadier

1. Oppretthold differensierings kulturer inntil flytelegemer utvider seg betydelig, opptil 10-14 dager, endre halvparten av 3F-medium, som beskrevet i 3.1, annenhver dag.
2. Dissosiere og samle differensiere monolag av celler ved å behandle cellene med en kommersiell celle dissosiasjon reagens (se tabell 1) i 5-10 minutter ved 37 ° C, 5% CO _2.
3. Utfør flowcytometri ved hjelp av anti-VE-cadherin, CD43 og CD45 antistoffer for å evaluere hematopoiesis i kulturer ^12. Legg merke til at en stor andel av celler, opp til 40% av ETV2 og GATA2 transduserte celler, co-uttrykker VE-cad og CD43. Disse antistoffene kan anvendes for å påvise spesifikke celle linjer følgende expansion eller differensiering av indusert blodstamfedre: CD235a (erytroidcellene), CD41a (megakaryocytic), CD32 (alle typer myeloide celler), CD66b (nøytrofile) og CD163 (makrofager).
4. Utfør CFC-analyse ved hjelp av en kommersiell klonogene medium (tabell 1) i henhold til produsentens instruksjoner.
   1. Overfør 1-2 x 10 ⁴ celler i 3 ml av kommersiell klonogene medium (se tabell 3) for å bedømme antallet av kolonidannende celler og typer av hematopoietiske kolonier. Optimal seeding tetthet gjør det mulig for identifisering og isolering av enkeltkolonier som vokser atskilt fra hverandre og ikke overlapper hverandre. Seeding tetthet kan variere mellom eksperimenter avhengig av differensiering effektivitet, men bør ikke overstige 1 x 10 ⁴ celler pr 1 ml kommersiell klonogene medium.
   2. Bland cellene i det kommersielle klonogene medium ved forsiktig virvling, og overføre 3 ml suspensjon til to 35 mm ultra-lave feste retterfor CFC analysen, 1,5 ml suspensjon til hver rett. Fordel jevnt medium og inkuber ved 37 ° C, _5% CO2 i 14 dager. Unngå å forstyrre retter; observere kolonidannelse på dag 7 og dag 10 av forsøket.
   3. Identifisere og telle blodkreft kolonier i henhold til deres morfologi på dag 14.

Representative Results

Skjemaet på HE og blod induksjon fra hPSCs av overekspresjon av transkripsjonsfaktorer er vist i figur 1. ETV2 med GATA1 eller GATA2 kombinasjon induserer pan-myeloid hematopoiesen, mens en GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombinasjon induserer hovedsakelig erythro-megakaryocytic hematopoiesen. Begge TF kombinasjoner direkte indusert HE celler som deretter forvandlet til blodstamfedre med en tydelig spekter av blodkreft differensiering. Differensiering av hPSCs fra pluripotent tilstand til blodproduserende HE tar i gjennomsnitt 4 dager. Runde blodceller først dukke opp etter dag 5 av differensiering. Deretter mange flytende blodceller vises og utvide i kulturer. For å maksimere antall flytende blodceller, kan post-transduksjon kulturer forlenges til 10-14 dager. Den ønskede linjen av celler kan ekspanderes i lav-adherente betingelser med den passende kombinasjon av hematopoetiske cytokiner. Figur 2 DEMonstrates induksjon av blod fra hPSCs bruker ETV2 og GATA1 eller GATA2 TFS. Etter transduksjon med ETV2 og GATA2, celler skaffe en typisk endothelial morfologi etter dag fire av differensiering, og til slutt forvandle seg til runde blodceller (dag 6-8 av differensiering (Figur 2A). Cells samlet på dagene 3-4 av differensiering viser en typisk VE-cadherin ⁺ CD226 ⁺ CD73 ^-. HE fenotype (figur 2B, 3B) Dag 7 av differensiering mer enn 50% av VE-cadherin ^{+ celler} erverve blodkreft CD43 ⁺ fenotype (figur 2C) KFK-analyser av GATA2 / ETV2. -indusert celler viser at kolonier består av høye proliferative potensial (HPP) KFK, erytroid (E) KFK, makrofager (M) KFK, og granulocytter (G) KFK (figur 2E). Den hematoendothelial differensiering i hPSCs følgende overekspresjon av GATA2 og TAL1 alene eller sammen medLMO2 er vist i figur 3. HE trinnet er best identifisert i kulturer med GATA2 og TAL1. Tilsetningen av LMO2 akselererer differensiering og markert kontrakter HE stadium. Den GATA2 og TAL1 kombinasjonen alene eller med LMO2 demonstrerer differensiering og modning av blod forløpere for det meste erytroide og megakaryocytic celler Figur 3D og 3E. Figur 4 viser optimalisering av transduksjon effektivitet i H1 hESCs ved hjelp av GFP lentivirus (A) og celledød og differensiering effektivitet i kulturer transdusert med GATA2 / TAL1 / LMO2 på høy og lav MOI.

Figur 1:. Skjematisk fremstilling av protokoll for induksjon av hemogenic endotel og blodceller via tvunget uttrykk for TFS Cartoon skisserer store eksperimentelle trinn og tidslinjer. Etter utarbeidelse av enkelt celle suspensjon, er hPSCs transduced med TFs og utsådd på matrisen i fullstendig kommersiell serumfritt medium. Neste dag, medium erstattet med vekstfaktor gratis kommersielt medium supplert med bFGF, TPO og SCF (3F Medium). Etter 3-4 dager med kultur, han er dannet. Deretter gjennomgår HE endotele til hematopoetisk overgang med dannelsen av flere blodceller.

Figur 2:. ETV2 / GATA2-indusert differensiering av hPSCs (A) bilder fase kontrast av ETV2 / GATA2-indusert differensiering i H1 hESCs på dag 2, 4, 6 og 8 etter transduksjon; Scale bar, 100 mikrometer. (B) Strømningscytometrisk analyse av ETV2 / GATA2-indusert celler gjennomgår endothelial til blodkreft overgang på dag 3 av differensiering: VE-cadherin ⁺ HE-celler uttrykker CD226 og mangler uttrykk for CD73. En liten andel av endoteliale celler uttrykker CD73 (non-HE). (C) strømningscytometriske ennalysis av ETV2 / GATA1- og ETV2 / GATA2-indusert H1 hPSCs på dag 7 etter transduksjon. (D) Strømningscytometrisk analyse av ETV2 / GATA2-indusert hematopoetiske celler ekspandert i medium supplert med FBS og SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF og EPO i 14 dager. (E) Typer av hematopoietiske kolonier dannet fra ETV2 / GATA2 transduserte celler i CFC-analysen og tilhørende Wright-farget cytospins representerer erytroid (E), makrofager (M), granulocytter (Gr) og High Proliferative Potensielle kolonier (Huskatter). Skala barer for CFC-analysen, 250 mikrometer, for cytospins, 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3:. GATA2 / TAL1 og GATA2 / TAL1 / LMO2-indusert differensiering av hPSCs (A) bilder Phase kontrast av GATA2 / TAL1 / LMO2-indusert differensiering i H1 hESCs på dager 2, 4, 6 og 8; Scale bar, 100 mikrometer. (B) Strømningscytometrisk analyse av GATA2 / TAL1-induserte celler gjennomgår endothelial til blodkreft overgang på dag tre av differensiering: VE-cadherin ⁺ celler skaffe uttrykk for HE markør CD226. En liten andel av endoteliale celler uttrykker CD73 (non-HE). (C) Immunofluorescent farging av GATA2 / TAL1-indusert differensiering i H1 hESC, dag 5; VE-cadherin + celler (grønn) erverve uttrykk for blodkreft markør CD43 (rød). (D) Strømningscytometrisk analyse av GATA2 / TAL1 / LMO2-indusert hematopoetiske kulturer i suspensjon på dag 14 etter transduksjon følgende ekspansjon i serumfritt medium supplert med SCF, TPO, EPO og bFGF; (E) Typer av hematopoietiske kolonier dannet i CFC-analyse av GATA2 / TAL1 / LMO2 differensiert cellsand tilsvar Wright-farget cytospins representerer erytroid (E), makrofager (M), og Megakaryocytes (MK). Skala barer for CFC-analysen, 250 mikrometer, for cytospins, 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Optimalisering av lentiviral transduksjon prosedyre (A) transduksjon av H1 hESCs med forskjellig MOI av GFP lentivirus.. (B) Cellenes levedyktighet og differensiering effektivitet i kulturer transdusert med GATA2 / TAL1 / LMO2 ved lav (en for hvert virus) og høy (to for hver virus) MOI.

Discussion

Den ovenfor beskrevne metode for hematopoietisk differensiering av hPSCs ved overekspresjon av TFS, representerer en hurtig og effektiv metode for generering av HE og myeloide og erytho-magakaryocytic progenitorceller fra hESCs og iPSCs, for derved å tillate produksjon av opp til 30 millioner blodceller fra én million pluripotente stamceller ^10. Denne metoden viste konsekvent differensiering i flere hESC og iPSCs linjer ^10. Under differensiering av ETV2 og GATA2, GATA1 faktorer samt GATA2 og TAL1 faktorer, cellene danner blodproduserende endotelet, HE og gjennomgå en endotelet til blodkreft overgang. Dannelse av HE er vanligvis observert mellom dag 3 og 4 av differensiering. Tilsetting av LMO2, en transkripsjons co-faktor på TAL1, til GATA2 og TAL1 kombinasjon, betydelig økt robusthet av differensiering, mens HE scenen ble markert kontrakt.

Suksessen til rettet differentiasjon av hPSCs av transkripsjonsfaktorer avhenger i hovedsak av (i) en effektiv levering av nukleinsyrer inn i celler, (ii) cellelevedyktighet følgende genetiske manipulasjoner, og (iii) en effektiv translasjon av eksogene transkripter inne i cellen.

En av de viktige trinnene i den beskrevne fremgangsmåten er fremstilling av effektive lentivirale heter, som er avhengig av en nøyaktig buffer pH for HEK 293T celle transfeksjon, og fraværet av endotoksinforurensninger ved alle trinn av viral produksjon og transduksjon eksperimenter. Integriteten til alle konstruksjoner, inkludert emballasje og konvolutt plasmider, må verifiseres hvis ingen tegn på viral produksjon i HEK 293T celler observeres ^13.

Differensieringen protokollen design ved hjelp av kombinasjoner av transkripsjonsfaktorer bør vurdere flere variabler. Høy virkningsgrad av viral transduksjon er viktig for vellykket differensiering. Etter transduksjon effektivitet er avhengig av hvilken metode som brukes for virusproduksjon og rensing optimalisere hPSC transduksjon bruker en GFP-lentiviral vektor anbefales (Figur 4A). Viral integrering følgende transduksjon bør verifiseres ved hjelp av genomisk PCR med transgene spesifikke primere (Tabell 3). Differensiering optimalisering bør også omfatte justering av lentiviral konsentrasjon i reaksjonsblandingen. En forholdsvis lav mengde virus, MOI på 0,5-1, er i stand til å indusere differensiering hPSC. Mens en høyere MOI øker effektiviteten av differensiering, det øker også celledød (figur 4B). Ytterligere optimalisering trinn kan innbefatte MOI forholdet justering for hver virus i reaksjonsblandingen. I GATA2 / ETV2 transdusert kulturer, doble MOI for GATA2, i forhold til ETV2, øker effekten av differensiering. For GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 og GATA2 / TAL1 / LMO2 lik MOI for hvert virus er optimal.

Etter transduksjon med TFS, et stort flertall av celler underwent angiohematopoietic differensiering mens bare en svært få celler beholdt en udifferensiert morfologi. Siden pSIN-EF1α lentivirale vektorer innlemme antibiotisk resistens, kan behandling av kulturer med puromycin brukes til å fjerne rester av udifferensierte celler.

Dannelsen av celler med karakteristiske morfologi endotelceller, og etterfølgende runde blodceller, indikerer en vellykket differensiering. I gjennomsnitt, produserer GATA2 / ETV2 kombinasjon 40-50% av CD43 ⁺ VE-cadherin ^+/- blodceller etter 9-10 dagers av differensiering med opp til 30% celler som var tilbake VE cadherin-CD43 ^{+ -.} GATA1 / ETV2 kombinasjon CD43 ekspresjon induserer raskere og frembringer et større antall CD43 ⁺ celler sammenlignet med den GATA2 / ETV2 kombinasjon. I disse kulturene, de fleste av CD43 ^{+ -celler} coexpress VE-cadherin. I kulturer transdusert med GATA2 / TAL1, antall CD43 ^{+ celler} når vanligvis 40-50%. Tilsetting av LMO2 til GATA2 / TAL1 vesentlig akselererer og forbedrer blodproduksjon, og markert kontrakter endothelial utviklingstrinn.

Kolonidannende analyser bør benyttes for å bestemme frekvensen, og typen av induserte hematopoetiske stamceller. Arten av kolonidannende celler kan bekreftes ved fremstilling av Wright-fargede cytospins fra individuelle kolonier. hPSCs transdusert med ETV2 og GATA2 produsere det meste store (større enn 0,5 mm i diameter) høye proliferative potensial (HPP) myeloide kolonier bestående av umodne granulocytisk og monocyttiske celler, med noen modne myeloide celler og erytroide og sporadisk megakaryocytic celler. I gjennomsnitt mer enn 80% av KFK i GATA2 / ETV2 transduserte kulturer er myeloide Huskatter. I tillegg er disse kulturene generere erytroide og makrofag kolonier (figur 2E), som vanligvis utgjør mindre enn 20% av totale KFK. hPSC transduksjon med ETV2 og GATA1 øker the andel av KFK-E til opp til 50%. TAL1 og GATA2 transduserte kulturer produserer det meste erytroid (mer enn 80% av total KFK) og megakaryocytic kolonier (mer enn 10% av total KFK) med svært få makro kolonier (mindre enn 5% av total KFK). Tilsetningen av LMO2 til TAL1 og GATA2 kombinasjon signifikant øker hyppigheten av kolonidannende celler med erytro-megakaryocytic potensial ^10. Mønsteret av CFC aktivitet etter transduksjon med de beskrevne kombinasjoner av transkripsjonsfaktorer er konsekvent blant annet hESC og hiPSC linjer ^10.

I sammendraget, lentiviral-mediert overekspresjon i hPSCs er en relativt rask og effektivt verktøy for induksjon av HE og blod ved hjelp TFS. Dette systemet kan også anvendes for å vurdere den evne differensiering fra andre TFS og identifisere de som er nødvendige for endotelial og hematopoetisk spesifikasjon. Imidlertid har den nåværende protokollen et begrenset verktøy for studier av extracellular signalering er involvert i induksjon av HE, som den bruker TFS å omgå overflate reseptor-mediert signalisering. Selv om den nåværende protokoll beskriver blod produksjon ved hjelp av den konstitutive ekspresjon av et transgen, kan tilsvarende resultater oppnås ved bruk av modifiserte ¹⁰ mRNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region