Abstract
Durante lo sviluppo, cellule ematopoietiche derivano da un sottoinsieme specializzato di cellule endoteliali, endotelio hemogenic (HE). Modellazione sviluppo HE in vitro è essenziale per gli studi meccanicistici della transizione endoteliale-ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Qui, si descrive un metodo per l'induzione efficiente di SE da cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs) mediante sovraespressione di diverse serie di fattori di trascrizione. La combinazione di ETV2 e GATA1 o GATA2 TF viene usato per indurre HE con potenziale pan-mieloide, mentre una combinazione di fattori di trascrizione e GATA2 TAL1 consente la produzione di HE con eritroide e potenziale megacariocitica. L'aggiunta di LMO2 a GATA2 e la combinazione TAL1 accelera notevolmente il differenziamento eritroide e aumenta e le cellule megacariociti produzione. Questo metodo fornisce un mezzo efficace e rapido di induzione HE da hPSCs e permette l'osservazione del endoteliale-hematopoietic transizione in un piatto di coltura. Il protocollo comprende le procedure hPSCs trasduzione e analisi post-trasduzione di SE e progenitori sangue.
Introduction
La capacità unica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre foglietti embrionali, compreso il sangue, li rendono uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici di sviluppo ematopoietiche, la modellazione di malattie del sangue, lo screening di stupefacenti, studi di tossicità, e lo sviluppo di terapie cellulari. Perché la formazione del sangue nei proventi embrioni da endotelio hemogenic (HE) attraverso una transizione ematopoietiche endoteliale 1,2, la generazione di SE nelle culture sarebbe essenziale per studiare i meccanismi molecolari che regolano la endoteliale transizione ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Metodi attuali per studi di HE si basano sull'induzione di differenziazione hematoendothelial in aggregati (EBS) con l'aggiunta di citochine ematopoietiche 3-5, e di co-coltura con cellule stromali hPSCs Emopoiesi-solidale 6,7 o nelle culture bidimensionali con extracellulare matrici e cytokines 8,9. Questi metodi di differenziazione classici si basano sull'introduzione di segnali esterni che agiscono sulla superficie cellulare e avvio cascate di percorsi molecolari che conducono alla attivazione del programma trascrizionale guidare lo sviluppo hematoendothelial. Quindi, l'efficienza di hPSCs differenziazioni in questi sistemi si basa su una induzione effettivo di questi segnali, la trasduzione del segnale al nucleo, e l'attivazione di specifiche risultante regolatori trascrizionali. Inoltre, lo studio di HE in colture di differenziazione convenzionali richiede l'ulteriore fase di isolare HE cellule usando separazione delle cellule. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'induzione diretta di SE e sangue sovraespressione di fattori di trascrizione ematopoietiche. Questo metodo consente l'induzione efficiente HE in un piatto e osservazione diretta della endoteliale transizione ematopoietiche senza la necessità di isolamento di HE utilizzando una procedura di ordinamento cellule ingombrante.
Formazione di SE e del sangue da cellule staminali umane pluripotenti possono essere efficacemente indotti da iperespressione pochi fattori di trascrizione (TFS). La combinazione ottimale di TF in grado di indurre robusto emopoiesi pan-mieloide da hPSCs include ETV2 e GATA1 o GATA2. Al contrario, la combinazione di GATA2 e TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmazione hPSCs attraverso la sovraespressione di questi fattori differenzia hPSCs direttamente al VE-cad + CD43 - CD73 - HE cellule che acquisiscono gradualmente il fenotipo ematopoietiche definito mediante l'espressione dei primi ematopoietiche marcatore CD43 7. Questo metodo basato lentivirali-per la programmazione diretta del metodo di cellule staminali pluripotenti umane è applicabile per la generazione di HE e cellule del sangue per studi meccanicistici, studi di endoteliale di transizione ematopoietiche e regolazione trascrizionale di sviluppo ematopoietiche e le specifiche. Sebbene la cprotocollo orrente descrive la produzione di sangue usando l'espressione costitutiva dei transgeni, risultati simili possono essere ottenuti utilizzando modificato mRNA 10.
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Protocol
1. Preparativi Virus e fattore di trascrizione combinazioni
- Preparare soluzioni con PSIN-EF1α lentivirale plasmide di espressione contenente proteine DNA codificante per ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 e LMO2 (Tabella 1).
- Misurare la concentrazione e la purezza dei preparati plasmide usato per la produzione lentivirale registrando assorbimento UV con uno spettrofotometro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: Preparati DNA dimostrano A260 / 280 e A260 / 230 valori superiori a 1.8 sono generalmente considerati di buona qualità. Lower A260 / 280 valori possono indicare contaminazione di proteine, mentre bassi valori A260 / 230 indicano le impurità con sali o qualche solvente quale il fenolo. Concentrazione plasmide consigliato è di 1-3 mg / mL.
- Produrre lentivirus per trasduzioni come descritto in protocolli precedentemente pubblicati 11. Induzione di SE con un potenziale pan-mieloide richiede un co-espressione di ETV2 e GATA1, o ETV2 e GATA2.Induzione di SE con un potenziale erythro- e megacariocitica richiede GATA2 e TAL1. L'aggiunta di LMO2 migliora significativamente la resa di cellule eritro-megacariocitica dal hPSCs in presenza di GATA2 e TAL1 10.
2. hPSCs Cultura protocollo
- Crescere cellule staminali pluripotenti in colonie stretti con bordi taglienti al 70-80% di confluenza prima subcoltura. Mark e rimuovere spontaneamente differenziati colonie prima passaging cellule.
- Diluire commerciale gel matrice extracellulare (vedi Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore e piastre coat 6 pozzetti notte a 4 ° C, o per almeno un'ora a 37 ° C prima dell'uso. Prima passaging cellule, aspirare la matrice, aggiungere 2 ml di fresco culturemedium completo commerciale (vedi Tabella 2) e tenere le piastre a 37 ° C, 5% CO 2 finché le cellule sono pronte per la semina.
- HPSCs Passage
- Aspirate mezzo da un pozzetto confluenti di una piastra da 6 pozzetti con hPSCs e aggiungere 1,5 ml di soluzione di pre-riscaldato dispasi II (2 mg / ml in DMEM / F12, sterilizzata mediante filtrazione attraverso filtri 0,22 micron). Incubare per 5-7 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 finché i bordi di colonie cominciano a sollevare dalla superficie.
- Aspirare soluzione dispasi II e lavare accuratamente le colonie due volte con l'aggiunta e poi aspirando 2 ml di fresco medio DMEM / F12. Quindi, utilizzando un 5 ml sierologica pipetta di vetro, dissociare hPSCs con 3 ml di terreno di coltura fresco commerciale completa (vedi Tabella 2) pipettando sospensione cellulare su e giù diverse volte.
- Aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo di coltura completo commerciale (vedi Tabella 2). Agitare piatto avanti e indietro e da destra a sinistra diverse volte per garantire una distribuzione uniforme delle cellule quando collocare la piastra nell'incubatore. Mantenere cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 18-24 ore.
- Il prossimo cambiamento giorno medio e fresco commerciale terreno di coltura completo (vedi Tabella 2) ed esaminare hPSCs morfologia. Risultati passaging successo in piccole colonie, ben attaccati, di sostegno HPSC morfologia. hPSCs devono essere alimentati con 2,5-3 ml freshmedium per bene su una base quotidiana e diversi passaggi ogni 4-5 giorni a non più del 70-80% di confluenza.
NOTA: Se hiPSCs sono stati mantenuti su fibroblasti embrionali di topo (MEF), hanno bisogno di essere trasferiti in condizioni prive di alimentazione e diversi passaggi 2-3 volte prima di trasduzione per garantire la differenziazione efficiente.
3. Induzione di Hematoendothelial Pprecursors da hPSCs (giorno 0, trasduzione di hPSCs)
- Per preparare mezzo di reazione si combinano 1,3 ml di terreno completo commerciale privo di siero (vedi Tabella 2), virus, polibrene, e Y27632 inibitore ROCK (Tabella 1): aggiungere 1,3 ml di inibitore ROCK 10 mm a 1,3 ml di mezzo ad una concentrazione finalezione di 10 pM, e polibrene una concentrazione finale 6 mg / ml.
- Aggiungere una quantità appropriata di concentrato virale (s) ad una concentrazione finale di 0,5-1,0 MOI (molteplicità di infezione) di ogni virus per cellula. Mantenere mezzo di reazione in ghiaccio oa 4 ° C fino a quando la sospensione di cellule singole è pronto.
NOTA: La stessa quantità di MOI per ogni virus nel GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, e miscele GATA2 / TAL1 / reazione LMO2 è ottimale per l'induzione della differenziazione. Culture Tuttavia, in ETV2 / GATA2 trasdotte raddoppio MOI per GATA2, relativi a ETV2, migliora la differenziazione. Pertanto, per queste culture, rapporto 1: 2 per MOI di ETV2 e 1 MOI di GATA2 è raccomandato (ad esempio, se concentrato virale è stimato a circa 6,8 x 10 7 particelle / ml, aggiungere 10 ml di ETV2 e 20 ml di concentrati virali GATA2 a 0,68 x 10 6 cellule per una reazione ETV2 / GATA2 in un pozzo 35 millimetri di un 6-pozzetti).
- Aggiungere una quantità appropriata di concentrato virale (s) ad una concentrazione finale di 0,5-1,0 MOI (molteplicità di infezione) di ogni virus per cellula. Mantenere mezzo di reazione in ghiaccio oa 4 ° C fino a quando la sospensione di cellule singole è pronto.
- Preparare hPSCs in una singola cella di sospensione.
- Crescere hPSCs in condizioni di assenza di alimentazione, come descritto nella sezione 2. Il giorno 4 dopo l'ultimo passaggio, osservare densità cellulare e la morfologia sotto un microscopio invertito. hPSCs dovrebbero crescere in colonie stretti con spigoli vivi senza differenziazione spontanea e raggiungere ~ 60-70% di confluenza il giorno della trasduzione.
- Aspirare il terreno, aggiungere 1,5-2 ml di reagente commerciale dissociazione delle cellule (Tabella 1) per pozzetto e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 5-7 minuti.
- Raccogliere le cellule in volumi uguali di terreno completo commerciale (vedi tabella 2) con 10 micron di inibitore ROCK, contare le cellule e determinare la vitalità. Cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti e poi risospendere le cellule in terreno completo commerciale con 10 pM di inibitore ROCK ad una concentrazione di 3.4-5 x 10 6 cellule per ml.
NOTA: La vitalità cellulare è fondamentale per la trasduzione virale di successo e la successiva differenziazione.Tipicamente, la vitalità cellulare prima trasduzione deve superare il 90%.
- Aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare, contenenti 0.68-1 x10 6 cellule in 1,3 ml di mezzo di reazione preparata in 3.1.
- Aspirare la soluzione matrice dal rivestita 6 pozzetti durante la notte preparato in 2.2., Trasferire la miscela di reazione ad un pozzetto di un 6-pozzetti e distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore. Dopo 24 ore almeno l'80% delle cellule deve essere collegato alla matrice.
4. Induzione Hematoendothelial precursori da hPSCs (giorno 1-7)
- 24 ore dopo la trasduzione, rimuovere medio virus contenente e lavare le cellule attaccate con commerciale terreno di coltura cellulare incompleto (vedi Tabella 1) e poi aggiungere 3 ml per pozzetto di commerciale terreno di coltura cellulare incompleto contenente citochine ematopoietiche: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (di seguito denominati 3F-medium).
- Sostituire medio totale con fresco 3F-media nei giorni 2, 3 e 4 giorno per rimuovere le cellule morte e detriti. Dopo 4 giorni, quando le cellule ematopoietiche galleggianti stanno emergendo, sostituire la metà del 3F-medio ogni altro giorno, mantenendo il volume totale a 4 ml.
NOTA: PSIN-EF1α plasmidi di espressione lentivirali incorporano puromicina gene di resistenza consentendo così la selezione positiva di cellule trasdotte. Il 1 ug / ml di puromicina può essere aggiunto a un terreno durante i primi 1-2 giorni di differenziazione per eliminare gli eventuali residui hPSCs indifferenziate. - Osservare morfologia cellulare il giorno 4 sotto un microscopio invertito: gruppi ristretti di cellule con morfologia tipica endoteliali iniziano a comparire (figure 2A, 3A). Globuli rotondi appare dal giorno 5 al 7 ° giorno di differenziazione, mentre alcune aree possono mantenere hPSCs morfologia. Analizzare HE e differenziazione ematopoietiche come descritto di seguito.
NOTA: Riuscito diverso hematoendothelialiation provoca la produzione di globuli che appaiono cellule rotonde come rifrangenti vagamente attaccato alle cellule endoteliali piatte sottostanti. Queste cellule proliferano attivamente formando piccoli aggregati, ed eventualmente staccare e galleggiante (Figure 2A e 3A). Cellule del sangue dal vivo possono essere visivamente distinta dalle cellule morte e morenti in base alla loro capacità di riflettere la luce ed espandere in condizioni di coltura.
5. Analisi di Hemogenic endotelio (HE) Fase di differenziazione.
- Rilevare la formazione di HE tra i giorni 3 e 4 di differenziazione mediante osservazione microscopica delle cellule con morfologia endoteliale. Non ci sono globuli galleggianti in coltura in questa fase di differenziazione. La presenza di SE può essere confermata mediante colorazione immunofluorescenza e citometria a flusso di analisi utilizzando anticorpi VE-caderina, CD73, CD43 e CD226.
- Per valutare la formazione di HE by cellule utilizzare l'analisi di citometria a flusso il giorno 3e il giorno 4 da un esperimento. Raccogliere le cellule incubando di culture con reagente commerciale dissociazione delle cellule (vedi Tabella 1) per 5-10 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 e quindi utilizzare fino a 1 x 10 5 cellule per reazione di colorazione (citometria a flusso procedura di colorazione descritta 12).
NOTA: VE-caderina + HE cellule acquisiscono espressione della precoce ematopoietiche marcatore CD226, ma manca l'espressione di CD73 e CD43 6. Al contrario, le cellule non esprimono CD73 HE (figure 2B, 3B).
- Per valutare la formazione di HE by cellule utilizzare l'analisi di citometria a flusso il giorno 3e il giorno 4 da un esperimento. Raccogliere le cellule incubando di culture con reagente commerciale dissociazione delle cellule (vedi Tabella 1) per 5-10 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 e quindi utilizzare fino a 1 x 10 5 cellule per reazione di colorazione (citometria a flusso procedura di colorazione descritta 12).
- Immunofluorescenza per HPSC di derivazione HE.
- Lavare il monostrato di cellule allegata con tampone fosfato (PBS) e quindi fissare le cellule in 4% paraformaldeide da 30 a 60 min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule nuovamente con PBS e quindi permeabilize usando 0,1% Triton X-100 in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule in PBS due a tre volte e poi incubaretampone di bloccaggio costituito da PBS con siero fetale bovino 10% (FBS), per 30 a 120 min.
- Preparare la soluzione di colorazione, contenente entrambi gli anticorpi primari (1: 1.000 diluizione) topo CD43 anti-umana e di coniglio anti-umane VE-caderina in PBS con 5% FBS, (Tabella 1).
- Aspirare il tampone di bloccaggio dalle cellule e aggiungere 1 ml per pozzetto di tampone colorazione con gli anticorpi primari aggiunti; incubare 3 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C.
- Lavare le cellule tre volte con l'aggiunta di 2 ml di PBS con 5% FBS.
- Preparare un secondo buffer di colorazione, contenente anticorpi secondari a diluizione 1: 500 in PBS con 5% FBS: asino anti-coniglio coniugato con colorante fluorescente verde, e anti-topo coniugato con colorante fluorescente rosso (Tabella 1). Aggiungere 1 ml per pozzetto di tampone colorazione secondaria e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Lavare tre volte con PBS senza siero. Cellule macchia con 300 Nm DAPI soluzione di lavoro in dH2 O per 10-15 minuti.
- Lavare le cellule con PBS due volte e aggiungere 2-3 ml di PBS in bene con cellule colorate. Osservare fluorescenza con filtri microscopio verde, rosso e blu.
6. Analisi della indotte ematopoietiche precursori
- Mantenere colture differenziazione fino cellule galleggianti espandono significativamente, fino a 10-14 giorni, cambiando la metà del 3F-mezzo, come descritto in 3.1, ogni due giorni.
- Dissociano raccogli differenziando monostrati di cellule trattando le cellule con un reagente di dissociazione cellulare commerciale (vedi Tabella 1) per 5-10 min a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Eseguire la citometria a flusso utilizzando anti-VE-caderina, anticorpi CD43 e CD45 per valutare emopoiesi nelle culture 12. Si noti che una grande frazione di cellule, fino al 40% delle cellule ETV2 e GATA2 trasdotte, co-esprime VE-cad e CD43. Gli anticorpi seguenti possono essere utilizzati per individuare linee cellulari specifiche e seguentiXpansion o differenziazione dei progenitori indotte sangue: CD235a (cellule eritroidi), CD41a (megacariocitica), CD32 (tutti i tipi di cellule mieloidi), CD66b (neutrofili) e CD163 (macrofagi).
- Eseguire CFC-dosaggio con un mezzo clonogenico commerciale (Tabella 1) secondo le istruzioni del produttore.
- Trasferire 1-2 x 10 4 cellule in 3 ml di terreno clonogenica commerciale (vedi Tabella 3) per valutare il numero di cellule che formano colonie e tipi di colonie ematopoietiche. Ottimale densità di semina consente l'identificazione e l'isolamento di singole colonie che crescono separatamente gli uni dagli altri e non si sovrappongono. Densità di semina può variare tra esperimenti in base all'efficienza differenziazione, ma non dovrebbe superare 1 x 10 4 cellule per 1 ml di terreno clonogenica commerciale.
- Mescolare cellule in terreno clonogenica commerciale vortexando gentilmente, e trasferire 3 ml di sospensione per due 35 millimetri piatti ultra-basso di attaccoper CFC test, 1,5 ml di sospensione di ogni piatto. Distribuire uniformemente media e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 14 giorni. Evitare di disturbare i piatti; osservare la formazione di colonie il giorno 7 e il giorno 10 del test.
- Identificare e contare le colonie ematopoietiche, secondo le loro morfologie il giorno 14.
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Representative Results
Lo schema di SE e induzione sangue da hPSCs di sovraespressione di fattori di trascrizione è mostrato in Figura 1. ETV2 con combinazione GATA1 o GATA2 induce emopoiesi pan-mieloide, mentre un GATA2, TAL1 +/- combinazione LMO2 induce emopoiesi prevalentemente eritro-megacariocitica. Entrambe le combinazioni TF direttamente indotto cellule HE che in seguito trasformati in progenitori di sangue con una gamma diversa di differenziazione ematopoietiche. Differenziazione delle hPSCs dallo stato pluripotente di sangue produrre HE richiede in media 4 giorni. Globuli rotondi primo emergono dal giorno 5 di differenziazione. Successivamente, numerose cellule del sangue galleggianti appaiono e si espandono nelle culture. Per massimizzare il numero di galleggiare cellule del sangue, le culture post-trasduzione possono essere prorogati per 10-14 giorni. La stirpe di celle desiderato può essere ampliato in condizioni di scarsa aderenti con la combinazione appropriata di citochine ematopoietiche. Figura 2 demonstrates l'induzione di sangue da hPSCs utilizzando ETV2 e GATA1 o GATA2 TF. Dopo trasduzione con ETV2 e GATA2, cellule acquisiscono una tipica morfologia endoteliale di giorno 4 di differenziazione, e alla fine si trasformano in globuli rotonde (giorno 6-8 di differenziazione (Figura 2A). Le cellule raccolte nei giorni 3-4 di differenziazione mostrano una tipica VE-caderina + CD226 + CD73 -. HE fenotipo (Figura 2B, 3B) Di giorno 7 di differenziazione più del 50% di CFC-test di GATA2 / ETV2 VE-caderina cellule + acquisire il CD43 ematopoietiche + fenotipo (Figura 2C). cellule -indotta rivelano che le colonie sono costituiti da alto potenziale proliferativo (HPP) CFC, eritroide (E) CFC, macrofagi (M) CFC e granulociti (G) CFC (Figura 2E). La differenziazione hematoendothelial in hPSCs seguito sovraespressione di GATA2 e da solo o con TAL1LMO2 è mostrata in fase Figura 3. Egli è meglio identificato nelle culture con GATA2 e TAL1. L'aggiunta di LMO2 accelera differenziazione e contratti marcatamente HE palco. La combinazione GATA2 e TAL1 solo o con LMO2 dimostra differenziazione e maturazione dei progenitori di sangue per lo più cellule eritroidi e megacariociti Figura 3D e 3E. La Figura 4 mostra l'ottimizzazione di efficienza di trasduzione in H1 hESC usando GFP lentivirus (A) e la morte cellulare ed efficienza differenziazione culture trasdotte con GATA2 / TAL1 / LMO2 ad alto e basso MOI.
Figura 1:. Schema di protocollo per l'induzione delle cellule endoteliali e del sangue hemogenic tramite l'espressione forzata di TF del fumetto delinea i principali passaggi sperimentali e scadenze. Dopo la preparazione di sospensione di cellule singole, hPSCs sono trasdotte con TFs e seminati su matrice in mezzo completo privo di siero commerciale. Il giorno dopo, di media viene sostituito con il fattore di crescita medio commerciale gratuito integrato con bFGF, TPO e SCF (3F media). A seguito di 3-4 giorni di coltura, SE è formato. Successivamente, egli subisce endoteliali di transizione ematopoietiche con formazione di più cellule del sangue.
Figura 2:. ETV2 / differenziazione GATA2 indotta hPSCs (A) immagini fase di contrasto ETV2 / differenziazione GATA2 indotte H1 hESC a giorni 2, 4, 6 e 8 dopo trasduzione; Barra della scala, 100 micron. (B) analisi citofluorimetrica di ETV2 / cellule GATA2 indotta sottoposti endoteliale di transizione ematopoietiche al giorno 3 di differenziazione: VE-caderina + HE cellule esprimono CD226 e mancanza di espressione di CD73. Una piccola percentuale di cellule endoteliali esprimono CD73 (non-HE). (C) una citometria a flussonalisi di ETV2 / GATA1- e ETV2 / GATA2 indotta H1 hPSCs il giorno 7 post-trasduzione. (D) analisi citofluorimetrica di ETV2 / cellule ematopoietiche GATA2 indotta espanse in mezzo supplementato con FBS e SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF e EPO per 14 giorni. (E) Tipi di colonie ematopoietiche formate da ETV2 / GATA2 cellule trasdotte in CFC-test e la corrispondente cytospins Wright-colorate che rappresentano eritroide (E), macrofagi (M), Granulociti (Gr) e High proliferativa colonie potenziali (centrali è). Barre di scala per CFC-test, 250 micron, per cytospins, 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. GATA2 / TAL1 e GATA2 / TAL1 / differenziazione LMO2 indotta hPSCs (A) immagini fase di contrasto GATA2 / TAL1 / LMO2differenziazione indotta in hESC H1 a giorni 2, 4, 6 e 8; Barra della scala, 100 micron. (B) analisi citofluorimetrica di GATA2 / cellule TAL1 indotte sottoposti endoteliale di transizione ematopoietiche il giorno 3 di differenziazione: VE-caderina cellule + acquisiscono espressione di SE marcatore CD226. Una piccola percentuale di cellule endoteliali esprimono CD73 (non-HE). (C) colorazione immunofluorescente di GATA2 / differenziazione TAL1 indotta in H1 hESC, giorno 5; VE-caderina + cellule (verdi) acquisiscono espressione di ematopoietiche CD43 indicatore (rosso). (D) analisi citofluorimetrica di GATA2 / TAL1 / LMO2-indotta culture ematopoietiche in sospensione il giorno 14 post-trasduzione seguenti espansione in mezzo privo di siero integrato con SCF, TPO, EPO e bFGF; (E) Tipi di colonie ematopoietiche formate in CFC-test da GATA2 / TAL1 / LMO2 cellsand differenziata corrispondente cytospins Wright-colorate che rappresentano eritroide (E), macrofagi (M), e Megakaryocytes (Mc). Barre di scala per CFC-test, 250 micron, per cytospins, 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Ottimizzazione della procedura lentivirali trasduzione (A) trasduzione di H1 hESC con differenti MOI di GFP lentivirus.. (B) La vitalità cellulare e l'efficienza differenziazione culture trasdotte con GATA2 / TAL1 / LMO2 a bassa (1 per ciascun virus) e alto (2 per ogni virus) MOI.
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Discussion
Il metodo sopra descritto per ematopoietiche differenziazione hPSCs di sovraespressione di TF, rappresenta un metodo veloce ed efficace per la generazione di HE e mieloidi e erytho-magakaryocytic progenitori da hESC e iPSCs, consentendo in tal modo la produzione di fino a 30 milioni di cellule del sangue dal un milione di cellule staminali pluripotenti 10. Questo metodo esposto differenziazione consistente in più di hESC e iPSCs linee 10. Durante differenziazione per ETV2 e GATA2, fattori GATA1 nonché i fattori GATA2 e TAL1, cellule formano il sangue producendo endotelio, HE e sottoposti a un endotelio di transizione ematopoietiche. La formazione di SE si osserva di solito tra i giorni 3 e 4 di differenziazione. L'aggiunta di LMO2, un co-fattore trascrizionale di TAL1, al GATA2 e la combinazione TAL1, ha aumentato significativamente la robustezza della differenziazione, mentre lo stadio è diventato notevolmente contratta.
Il successo di differenziazione direttazione di hPSCs di fattori di trascrizione dipende principalmente (i) una efficace erogazione di acidi nucleici nelle cellule, (ii) vitalità cellulare dopo manipolazioni genetiche, e (iii) un dizionario efficace di trascritti esogeni all'interno della cellula.
Una delle fasi principali del metodo descritto è la produzione di unità lentivirali efficaci, che dipende da una precisa pH buffer per la trasfezione delle cellule HEK 293T, e l'assenza di contaminanti endotossina in tutte le fasi di produzione e di trasduzione esperimenti virali. L'integrità di tutti i costrutti, compreso l'imballaggio e buste plasmidi, deve essere verificata se segni di produzione virale in cellule 293T HEK si osserva 13.
Il design protocollo di differenziazione utilizzando combinazioni di fattori di trascrizione dovrebbe prendere in considerazione diverse variabili. Alta efficienza di trasduzione virale è importante per la differenziazione di successo. Poiché l'efficienza di trasduzione dipende dal metodo usato per il virusproduzione e purificazione, ottimizzare HPSC trasduzione utilizzando un vettore lentivirale-GFP è raccomandata (figura 4A). Viral integrazione seguente trasduzione vanno verificate mediante genomica PCR con primer specifici transgene (Tabella 3). Ottimizzazione differenziazione dovrebbe comprendere anche la regolazione della concentrazione lentivirale nella miscela di reazione. Un relativamente bassa quantità di virus, MOI di 0,5-1, è in grado di indurre il differenziamento HPSC. Mentre un più alto MOI aumenta l'efficienza della differenziazione, aumenta anche la morte cellulare (Figura 4B). Ulteriori fase di ottimizzazione può includere regolazione del rapporto MOI per ciascun virus nella miscela di reazione. In GATA2 / ETV2 trasdotta culture, raddoppiando il MOI per GATA2, rispetto al ETV2, aumenta l'efficacia della differenziazione. Per GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 e GATA2 / TAL1 / LMO2 pari MOI per ogni virus è ottimale.
A seguito di trasduzione con TF, una vasta maggioranza di cellule UNDERWent differenziazione angiohematopoietic mentre pochissime cellule mantenute una morfologia indifferenziata. Poiché PSIN-EF1α vettori lentivirali incorporano la resistenza agli antibiotici, trattamento delle colture con puromicina può essere utilizzata per eliminare le cellule indifferenziate residue.
La formazione di cellule con caratteristiche morfologie endoteliali, e successive globuli rotonde, indicano una differenziazione di successo. In media, la combinazione GATA2 / ETV2 produce 40-50% di CD43 + VE-caderina cellule +/- del sangue di giorno 9-10 di differenziazione con un massimo di 30% di cellule rimanenti VE-caderina + CD43 -. GATA1 combinazione / ETV2 induce l'espressione CD43 più rapidamente e genera un maggior numero di cellule CD43 + rispetto alla combinazione GATA2 / ETV2. In queste culture, la maggior parte delle cellule CD43 + coesprimere VE-caderina. Nelle culture trasdotte con GATA2 / TAL1, il numero di cellule CD43 + solito raggiunge 40-50%. L'aggiunta di LMO2 a GATA2 / TAL1 accelera notevolmente e aumenta la produzione di sangue, e contrae notevolmente la fase endoteliale dello sviluppo.
Saggi che formano colonie dovrebbero essere utilizzati per determinare la frequenza e il tipo di progenitori emopoietici indotte. La natura delle cellule che formano colonie può essere confermata attraverso la preparazione cytospins Wright-macchiati dalle singole colonie. hPSCs trasdotte con ETV2 e GATA2 producono per lo più di grandi dimensioni (superiori a 0,5 mm di diametro) ad alto potenziale (HPP) colonie mieloidi proliferative composte di granulociti immaturi e cellule monocitiche, con alcune cellule mieloidi mature e eritroide occasionali e cellule megacariociti. In media oltre l'80% dei CFC in GATA2 / culture ETV2 trasdotte sono centrali è mieloidi. Inoltre, queste culture generano eritroidi e macrofagi colonie (Figura 2E), che di solito comprendono meno del 20% dei CFC totale. HPSC trasduzione con ETV2 e GATA1 aumenta significativamente °e percentuale di CFC-E fino al 50%. Culture trasdotte TAL1 e GATA2 producono principalmente eritroide (oltre l'80% del totale CFC) e le colonie megacariociti (oltre il 10% del totale CFC), con pochissime colonie di macrofagi (meno del 5% del totale CFC). L'aggiunta di LMO2 al TAL1 e la combinazione GATA2 aumenta notevolmente la frequenza di cellule che formano colonie con eritro-megacariocitica potenziale 10. Il modello di attività CFC dopo trasduzione con le combinazioni descritte di fattori di trascrizione è coerente tra le diverse linee di hESC e hiPSC 10.
In sintesi, la sovraespressione lentiviral-mediata hPSCs è uno strumento relativamente rapido ed efficiente per l'induzione di HE e sangue utilizzando TF. Questo sistema può essere utilizzato anche per valutare la capacità di differenziazione altre TF e identificare quelli che sono necessari per endoteliale e specifica ematopoietiche. Tuttavia, l'attuale protocollo ha un'utilità limitata per gli studi di exintracellulare segnalazione coinvolti nell'induzione di SE, in quanto utilizza TF per aggirare la segnalazione mediata da recettori di superficie. Anche se l'attuale protocollo descrive la produzione di sangue con l'espressione costitutiva di un transgene, risultati simili potrebbero essere ottenuti utilizzando mRNA modificati 10.
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Disclosures
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
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| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
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| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
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| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
