Abstract
Gelişimi sırasında, hematopoietik hücreler endotel hücrelerinin özel bir alt grubundan elde edilen ortaya çıkan hemogenic endotel (HE). In vitro Modelleme HE geliştirme endotel-hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartname mekanik çalışmalar için gereklidir. Burada, transkripsiyon faktörlerinin farklı setleri aşırı ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için HE etkin indüksiyonu için bir yöntem tarif eder. GATA2 ve TAL1 transkripsiyon faktörlerinin bir arada eritroid ve megakaryositik potansiyeli olan HE üretimine olanak sağlar ise ETV2 ve gata1 ya GATA2 TFs kombinasyonu, pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüklemek için kullanılır. GATA2 ve TAL1 kombinasyonu LMO2 ilavesinin farklılaşmasını hızlandırır ve eritroid ve megakaryositik hücre üretimini arttırır. Bu yöntem, hPSCs gelen HE endüksiyon etkili ve hızlı bir yol sağlar ve endotelial-hematopoieti gözlem sağlarbir kültür kabı c geçişi. Protokol hPSCs transdüksiyon usul ve HE sonrası transdüksiyon analizi ve kan atalarıdır içerir.
Introduction
Kendini yenilemek ve kanda olmak üzere üç germ, hücre içine ayırt etmek, hematopoetik gelişim mekanik çalışmalar için onlara değerli bir araç yapmak, kan hastalıkları modellenmesi, ilaç taraması insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) benzersiz yeteneği, toksisite çalışmaları ve hücresel tedavilerin geliştirilmesi. Endotel hematopoetik geçiş 1,2 ile (HE) hemogenic endotel embriyo hasılatı kan oluşumu, kültürlerde HE nesil hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartnameye endotelyal düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için gerekli olacaktır çünkü. HE çalışmaları için geçerli yöntem hematopoez destekleyici stromal hücreler 6,7 ya da hücre dışı olan iki boyutlu kültürlerde hPSCs hematopoietik sitokinlerin 3-5 ilavesi ile agrega (EBS) 'de hematoendothelial farklılaşmanın başlaması ve birlikte-kültür dayanmaktadır matrisler ve c8,9 ytokines. Bu, klasik yöntemler farklılaşma, hücre yüzeyinde hareket eden ve en sonunda hematoendothelial gelişimi yol transkripsiyonel program aktivasyonuna yol molekül yolların kaskadlar başlatılması harici sinyaller giriş dayanmaktadır. Bu nedenle, bu sistemlerde hPSCs farklılaşmalar etkinliği bu sinyallere etkili bir indüksiyonu, çekirdeğe sinyal iletimi, spesifik kopyalama düzenleyicilerinden oluşan elde edilen aktive edilmesine dayanır. Buna ek olarak, geleneksel bir farklılaşma kültürlerde HE çalışma hücre sıralama kullanarak HE hücrelerin izole edilmesi ek aşamasını gerektirmektedir. Burada, hematopoetik transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile HE ve kanın doğrudan indüksiyon için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, bir hantal hücre sıralama işlemi kullanılarak HE ayırmaya gerek olmadan, bir çanak ve hematopoietik geçiş endotelyal doğrudan gözlem HE etkin aşılanmasını da olanaklı kılar.
Insan pluripotent kök hücrelerden HE oluşumu ve kan verimli bir kaç transkripsiyon faktörlerini (TF) aşırı eksprese eden indüklenebilir. HPSCs gelen sağlam pan-miyeloid hematopoeze indükleyebilen TFs optimal kombinasyonu ETV2 ve gata1 veya GATA2 içerir. Bunun aksine, GATA2 ve TAL1 kombinasyonu erythromegakaryocytopoiesis 10 neden olur. CD73 - - yavaş yavaş, erken hematopoietik markör CD43 7 ekspresyonu ile tanımlanan hematopoietik fenotipi edinebilir HE hücreleri bu faktörlerin aşırı ekspresyonu yoluyla hPSCs Programlama şirketinden The için hPSCs VE-cad + CD43 ayırır. İnsan pluripotent kök hücreleri, bir yöntem doğrudan programlanması için bu lentiviral bazlı yöntem mekanik çalışmalar, hematopoietik geçiş endotelyal çalışmaları ve hematopoietik gelişimi ve tarifnamenin transkripsiyonel düzenleme için olan HE ve kan hücrelerinin üretimi için de geçerlidir. C rağmeneçerli protokolü benzer sonuçlar modifiye mRNA 10 kullanılarak elde edilebilir transgenlerin bünyesel anlatımı ile, kan üretimini açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Virüs Hazırlıklar ve Transkripsiyon Faktör Birleşmeleri
- PSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidi ETV2, gata1, GATA2, TAL1 ve LMO2 (Tablo 1) için protein kodlayıcı DNA'yı içeren çözelti hazırlayın.
- 230 nm, 260 nm ve 280 nm'de bir spektrofotometre UV absorpsiyonu kaydederek lentiviral üretimi için kullanılan plazmid preparasyonlarının konsantrasyon ve saflık ölçün. Not: 1.8 daha fazla DNA preparatları gösteren A260 / 280 ve A260 / 230 değerleri genellikle kaliteli olarak kabul edilir. Alt A260 / 230 değerleri tuzları ya da bazı çözücü gibi fenol ile kirleri işaret ederken alt A260 / 280 değerleri protein kontaminasyonu gösterebilir. Önerilen plazmid konsantrasyonu 1-3 mg / ml olduğunu.
- Daha önce yayınlanmış protokollere 11'de tarif edildiği gibi transdüksiyon için lentivirüsler üretir. Pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüksiyonu ETV2 ve gata1 veya ETV2 ve GATA2 ko-ifadesini gerektirir.Eritro- ve megakaryositik potansiyeli olan HE indüksiyonu GATA2 ve TAL1 gerektirir. LMO2 ilavesi, GATA2 ve TAL1 10 mevcudiyetinde hPSCs gelen eritro-megakaryositik hücrelerin verimini geliştirir.
2. hPSCs Kültür Protokolü
- Alt kültüre önce% 70-80 confluency keskin kenarlı dar kolonilerde pluripotent kök hücreleri büyütün. Mark ve kaldırmak kendiliğinden hücrelerin Pasajlanması önce koloniler farklılaşmış.
- Gece boyunca 4 ° C 'de, üreticinin talimatlarına ve kılıf 6-çukurlu plakalara göre, ticari hücre dışı matris jel (bakınız Tablo 2) ile seyreltilir, veya kullanımdan önce 37 ° C' de en az bir saat karıştırıldı. Hücreleri Pasajlanması önce, matris aspire taze ticari komple culturemedium 2 ml ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 37 plakaları tutmak ° C, hücreler kadar% 5 CO 2 tohumlama için hazırız.
- Passage hPSCs
- Aspira(0.22 um filtre içinden süzme ile sterilize edilmiş DMEM / F12 içinde 2 mg / ml), bir konfluent hPSCs ile 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu ve önceden ısıtılmış Dispase II çözeltisi 1.5 mi ilave gelen te ortamı. Kolonilerin kenarları yüzeyinden kaldırılması için başlayana kadar 37 ° C'de,% 5 CO2 5-7 dakika süreyle inkübe edin.
- Aspire Dispase II çözümü ve dikkatle ekleme ve sonra taze DMEM / F12 orta 2 ml aspire kez koloniler yıkayın. Daha sonra, 5 ml'lik serolojik cam pipet ile, taze ticari tam kültür ortamı içinde 3 ml hPSCs ayrıştırmaları yukarı ve aşağı birkaç kez hücre süspansiyonu pipetleme (bakınız Tablo 2).
- Her bir oyuğa, ticari tam kültür ortamı içinde 1.5 ml ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka hücre süspansiyonu 0,5 ml ilave edilir (bakınız Tablo 2). Kuvöz içine plaka situating zaman homojen hücre dağılımını sağlamak için ileri ve geri ve sağa sola birkaç kez plaka çalkalayın. 37 ° C'de,% 5 CO2 1 için hücreleri tutun8-24 saat.
- Taze ticari komple kültür ortamına ertesi gün değişim ortamı (bakınız Tablo 2) ve hPSCs morfoloji inceleyin. HPSC morfoloji istinat küçük, iyi-ekli kolonilerde Başarılı Pasajlanması sonuçları. hPSCs de günlük olarak 2.5-3 ml freshmedium başı ile beslenen ve 70-80% konfluansa fazla olmayacak şekilde, her 4-5 gün geçişli olması gerekir.
Not: hiPSCs fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) muhafaza edildi, bunlar besleyici içermeyen koşullar aktarılır ve etkin farklılaşmasını sağlamak için transdüksiyon önce 2-3 kez geçirilmiştir gerekmektedir.
HPSCs (gün 0, hPSCs transdüksiyonu) için Hematoendothelial Pprecursors 3. İndüksiyon
- Reaksiyon ortamı, ticari komple serumsuz ortam içinde 1.3 ml kombine hazırlamak için, virüs, polybrene ve Y27632 ROCK inhibitörü (Tablo 1) (bakınız Tablo 2): nihai konsantrasyonları 1.3 ml ortama 10 mM ROCK inhibitörü 1,3 ula bir nihai konsantrasyonu 6 ng / ml, 10 uM tion ve polibren.
- Hücre başına her virüsün 0,5-1,0 MOI değerinde bir nihai konsantrasyona (enfeksiyon çokluğu), viral bir konsantre (ler), uygun bir miktarda ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C 'de, reaksiyon ortamı tutun.
Not: gata1 / ETV2, GATA2 / TAL1 bölgesindeki her bir virüs için MOI aynı miktarda ve GATA2 / TAL1 / LMO2 reaksiyon karışımları farklılaşmasının indüksiyonu için en uygunudur. ETV2 göre GATA2 için MOI katlama Ancak ETV2 in / GATA2 transduse kültürler, türev geliştirir. Bu nedenle, bu kültürlerin, oran 1: ETV2 MOI'de ve GATA2 1 MOI 2 önerilir (viral konsantre, yaklaşık 6.8 x 10 7 parçacık / ml olduğu tahmin edilmektedir, eğer, ETV2 10 ul ve GATA2 viral konsantreleri 20 ul ekle örn Bir 6-plaka, 35 mm oyuk bir ETV2 / GATA2 reaksiyon başına 0,68 x 10 6 hücre).
- Hücre başına her virüsün 0,5-1,0 MOI değerinde bir nihai konsantrasyona (enfeksiyon çokluğu), viral bir konsantre (ler), uygun bir miktarda ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C 'de, reaksiyon ortamı tutun.
- Tek bir hücre asmalar içinde hPSCs hazırlayınension.
- 4. günde bölüm 2'de tarif edildiği gibi, en son geçiş aşağıdaki besleyici içermeyen koşullarda hPSCs büyümeye tersine bir mikroskop altında hücre yoğunluğu ve şekil görmekteyiz. hPSCs iletimi gününde ~% 60-70 confluency hiç kendiliğinden farklılaşma ile keskin kenarlı sıkı koloniler halinde büyür ve ulaştırılması gerekmektedir.
- Kültür ortamı basınçla, oyuk başına ticari hücre ayırma reaktifi (Tablo 1) 1,5-2 ml ekleyin ve 5-7 dakika için% 5 CO2 37 ° C'de inkübe edin.
- Ticari tam orta eşit hacimlerde içine hücreleri toplamak hücrelerin sayısı ve canlılığı belirler, ROCK inhibitörünün 10 uM (bakınız Tablo 2). Santrifüj Pelet hücreleri 5 dakika 200 x g'de ve daha sonra, ml başına 3,4-5 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ROCK inhibitörünün 10 uM ticari tam bir ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
NOT: Hücre canlılığı, başarılı bir viral transdüksiyon ve daha sonra farklılaşması için çok önemlidir.Tipik haliyle, transdüksiyon önce hücre yaşayabilirliği% 90 fazla olmalıdır.
- 3.1 hazırlanan reaksiyon ortamının 1.3 mi içine 0,68-1 x10 6 hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 200 ul ilave edin.
- 2.2 hazırlanan gece boyunca kaplanmış 6-çukurlu plaka matrisi çözeltisi aspire., 6-çukurlu bir levhanın bir oyuğuna, reaksiyon karışımı transferi ve hücreler eşit dağıtırlar. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir. 24 saat sonra hücreler en az 80% matrisine bağlı olmalıdır.
HPSCs gelen Hematoendothelial Öncülerinin 4. indüksiyonu (Gün 1-7)
- SCF 100 ng / ml, TPO: 24 saat sonra transdüksiyonu, virüs ihtiva eden orta kaldırmak ve ticari tam olmayan hücre kültür ortamı ile bağlanmış yıkama hücreleri, hematopötik sitokinler (Tablo 1 e bakınız) ve daha sonra ticari bir tam olmayan hücre kültür ortamında oyuk ihtiva başına 3 ml ilave 50 ng / ml bFGF (bundan sonra 3F-ortam olarak adlandırılır), 20 ng / ml.
- Ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için günde 2, 3 ve 4. günde taze 3F-orta toplam orta yerine. Yüzen hematopoietik hücreler ortaya çıkıyor zaman 4 ml toplam hacim korurken 4 gün sonra, her gün 3F-orta yarısı değiştirin.
Not: pSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidleri, böylece kalıt aktarımlı hücrelerin pozitif seçimi için izin puromisin direnç geni içermektedir. Puromycin 1 ug / ml herhangi bir kalıntı farklılaşmamış hPSCs ortadan kaldırmak için farklılaşma ilk 1-2 gün boyunca ortama ilave edilebilir. - Tersine bir mikroskop altında, 4. günde hücre morfolojisi dikkate alınmalıdır: tipik bir endotel morfolojisi olan hücrelerin yoğun kümeleri ortaya çıkmaya başlar (Şekil 2A, 3A). Bazı alanlarda hPSCs morfoloji tutabilir ise Yuvarlak kan hücreleri, farklılaşma günde 7 günden 5 anlaşılmaktadır. Aşağıda tarif edildiği gibi HE ve hematopoetik farklılaşma analiz edin.
NOT: Başarılı hematoendothelial farklıiation gevşek yatan düz bir endotel hücrelerine bağlı olarak refraktil Yuvarlak hücreleri görünür kan hücrelerinin üretimi ile sonuçlanır. Bu hücreler, aktif ayırmak ve şamandıra (Şekil 2A ve 3A) sonunda küçük agregalar oluşturan çoğalırlar ve. Canlı kan hücreleri ışığı yansıtır ve kültür koşullarında genişletmek için kendi yeteneklerine göre ölü ve ölmekte olan hücrelerden görsel ayırt edilebilir.
5. Farklılaşma Hemogenic Endotel (HE) Sahne Analizi.
- Endotel morfolojisi hücrelerin mikroskobik gözlem yoluyla günde 3 ve farklılaşma 4 arasında HE oluşumunu algılar. Farklılaşma, bu aşamada kültürde yüzen kan hücreleri bulunmaktadır. HE varlığı immunofluorescent boyama ile doğrulandı ve VE-kaderin, CD73, CD226 ve CD43 antikorları kullanarak flow sitometri yöntemi olabilir.
- 3. günde akım sitometri analizi kullanımı hücreleri tarafından HE oluşumunu değerlendirmek içintek deneyden ve gün 4. Ticari hücre ayrışma reaktifi ile kültürlerin inkübe hücreleri toplamak, 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle (Tablo 1 e bakınız), daha sonra% 5 CO2 ve boyama reaksiyon başına 1 x 10 5 hücre kullanabilir (anlatılan boyama işlemi akış sitometrisi 12).
NOT:-kaderin VE + HE hücrelerin erken hematopoetik işaretleyici CD226 ifadesini elde, ama CD73 ve CD43 6 ifadesini yoksundur. Tersine, HE-hücreleri CD73 (Şekil 2B, 3B) ifade etmektedir.
- 3. günde akım sitometri analizi kullanımı hücreleri tarafından HE oluşumunu değerlendirmek içintek deneyden ve gün 4. Ticari hücre ayrışma reaktifi ile kültürlerin inkübe hücreleri toplamak, 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle (Tablo 1 e bakınız), daha sonra% 5 CO2 ve boyama reaksiyon başına 1 x 10 5 hücre kullanabilir (anlatılan boyama işlemi akış sitometrisi 12).
- HPSC türetilmiş HE için immünofloresan boyama.
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücrelerin bağlanmış tek tabaka yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika ila 60 den% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit.
- Yıkama Hücreler tekrar PBS ile ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 kullanarak Permeabilize.
- Üç kez PBS, iki hücrelerin yıkayın ve daha sonra inkübe30 ila 120 dakika süre ile,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile PBS oluşan blokaj tamponu.
- Birincil antikorlar hem de içeren, boyama çözeltisi hazırlayın (1: 1000 seyrelti) fare anti-insan CD43 ve tavşan anti-insan% 5 FBS içeren PBS içinde (Tablo 1)-kaderin. A.Ş.
- Hücrelerinden engelleme tampon aspire ve ilave primer antikorlar ile lekeleme tampon maddesi içinde oyuk başına 1 ml ekleyin; Oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca 4 ° C enkübe edilir.
- % 5 FBS içeren PBS içinde 2 ml ekleyerek hücreler üç kez yıkayın.
- 1 de sekonder antikorlar ihtiva eden, ikinci bir boyama tamponu hazırlayın: 5% FBS içeren PBS içinde 500 seyreltme: eşek, yeşil floresan boya ve kırmızı bir floresan boya (Tablo 1) ile konjuge edilmiş anti-fare ile konjüge edilmiş anti-tavşan. İkincil lekeleme tampon maddesi, oyuk başına 1 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Serum olmaksızın PBS ile üç kez yıkanır. 300 nM DAPI dH çözüm çalışma ile Leke hücreleri10-15 dakika süreyle 2 O.
- PBS ile hücreler iki kez yıkayın ve içine de lekeli hücreleri ile PBS 2-3 ml ekleyin. Yeşil, kırmızı ve mavi mikroskop filtreleri ile floresan gözlemleyin.
Kaynaklı Hematopoetik Öncülerinin 6. Analizi
- 3.1 açıklandığı gibi yüzen hücreleri 3F-orta yarısını değiştirerek, 10-14 güne kadar, önemli ölçüde genişletmek kadar her iki günde bir, farklılaşma kültürleri korumak.
- Ayrıştırmaları ticari bir hücre ayrışma reaktifi ile muamele etmek suretiyle hücrelerin hücrelerin tek tabakalarını ayırt toplamak 37 ° 5-10 dakika için (Tablo 1 e bakınız) ° C,% 5 CO2.
- Kültürler 12 hematopoezisi değerlendirmek için anti-VE-kaderin, CD43 ve CD45 antikorları kullanarak flow sitometri gerçekleştirin. Kadar ETV2 ve GATA2 kalıt aktarımlı hücrelerin% 40 hücrelerinin büyük bir kısmı, eş-ifade eder VE-cad olduğu ve CD43 edin. Aşağıdaki antikorlar e, aşağıdaki spesifik hücre soyları tespit etmek için kullanılabilirXpansion veya indüklenmiş kan progenitörlerinin farklılaşması: CD235a (eritroid hücreleri), CD41a (megakaryositik), CD32 (miyeloid hücrelerin her türlü), CD66b (nötrofiller) ve CD163 (makrofajlar) vardır.
- Üreticinin talimatlarına göre bir ticari klonojenik ortamı (Tablo 1) kullanarak CFC tahlil gerçekleştirin.
- Ticari klonojenik ortamının 3 ml 2/1 x 10 4 hücreleri aktarın koloni oluşturan hücreler ve hematopoietik koloni tiplerinin sayısını belirlemek için (bakınız Tablo 3). Optimal tohum yoğunluğu birbirinden ayrı büyür ve üst üste gelmez tek koloniler tanımlanması ve izole edilmesi için izin verir. Tohum yoğunluğu farklılaşma verimliliğine bağlı olarak deneyler arasında değişebilir, ancak ticari klonojenik ortamının 1 ml'si başına 1 x 10 4 hücrelerini geçmemelidir.
- Yumuşak bir girdaplamadan ticari klonojenik hücrelerin ortam içinde karıştırın ve iki adet 35 mm'lik çok düşük bağlanma yemekler süspansiyonun 3 ml aktarmakCFC tahlilinde, her bir çanak süspansiyonun 1.5 ml için. Eşit orta dağıtın ve 14 gün süreyle 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir. Yemekler rahatsız etmemek; Gün 7 ve analiz gününe 10 koloni oluşumunu görmekteyiz.
- 14. günde kendi morfolojilerine göre hematopoetik koloniler tespit ve sayım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombinasyonu esas olarak eritro-megakaryositik hematopoez indükler HE ve transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile hPSCs kan indüksiyon şematik diyagramıdır, pan-miyeloid hematopoez indükler gata1 ya GATA2 kombinasyonu ile Şekil 1 ETV2 gösterilmiştir. Hem TF kombinasyonları doğrudan sonradan hematopoetik farklılaşma farklı bir spektrumu ile kan atalarıdır dönüştürülmüştür HE hücrelerini kaynaklı. Kana pluripotent devletten hPSCs Farklılaşma HE ortalama 4 gün alır üreten. Yuvarlak kan hücreleri ilk farklılaşma 5 gün kadar ortaya çıkmaktadır. Daha sonra, çok sayıda yüzen kan hücreleri görünür ve kültürlerde genişletin. Kan hücrelerinin yüzen sayısını maksimize etmek için, post-transdüksiyon kültürleri 10-14 gün uzatılabilir. Hücrelerin istenen soyu hematopötik sitokinler uygun kombinasyonu ile, düşük yapışkan koşullarda genişletilebilir. 2 dem Şekilonstrates ETV2 kullanarak hPSCs ve gata1 ya GATA2 TFs kan indüksiyonu. ETV2 ve GATA2 transdüksiyon sonra hücreler farklılaşma günde 4 tarafından tipik bir endotel morfolojisi elde ve sonunda yuvarlak kan hücreleri (gün 6-8 farklılaşma (Şekil 2A) dönüşmektedir. Günde toplanan hücre farklılaşmasının 3-4 tipik göstermektedir + CD226 + CD73-kaderin VE -. O (Şekil 2B, 3B) fenotipe farklılaşma 7. günde fazla% 50 VE-cadherin + hücreleri, hematopoetik CD43 + fenotipi (Şekil 2C) elde GATA2 / ETV2 CFC-tahliller. indüklenen hücre kolonileri yüksek proliferatif potansiyel (HES) CFC oluşmaktadır olduğunu göstermektedir, eritroid (E) CFC, makrofajlar (M) CFC ve granülositler (G) CFC (Şekil 2E). hPSCs içinde hematoendothelial farklılaşma GATA2 aşın takip ve TAL1 tek başına veyaLMO2 Şekil 3. HE aşamasında gösterilmektedir iyi GATA2 ve TAL1 ile kültürler içinde tanımlanır. LMO2 eklenmesi farklılaşmasını hızlandırır ve belirgin HE sahne sözleşmeleri. GATA2 ve TAL1 kombinasyonu, tek başına ya da LMO2 çoğunlukla eritroid ve megakaryositik hücreler Şekil 3D ve 3E. GFP lentivirüs (A) kullanarak H1 hESC transdüksiyon verimliliği ve hücre ölümü ve farklılaşma verimliliği 4 gösterileri optimizasyonu Şekil farklılaşma ve kan atalarıdır olgunlaşmasını gösteriyor kültürler, yüksek ve düşük MOI'da GATA2 / TAL1 / LMO2 ile transdük.
Şekil 1:. TFs Karikatür zorla ifadesi yoluyla hemogenic endotel ve kan hücrelerinin uyarılması için protokol şeması belli başlı deneysel adımlar ve zaman çizelgeleri özetliyor. Tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması sonra, hPSCs TF transdüksiyona tâbi tutuldus ve tam bir ticari serumsuz ortam içinde matris üzerinde tohumlandı. Bir sonraki gün, ortam bFGF, TPO ve SCF (3F Medium) ile desteklenmiş büyüme faktörü ücretsiz ticari ortam ile değiştirilir. Kültür 3-4 gün sonra, HE oluşur. Daha sonra, HE çoklu kan hücrelerinin oluşumu ile hematopoietik geçiş endotelyal maruz kalır.
Şekil 2:. HPSCs arasında ETV2 / GATA2 kaynaklı farklılaşma (A) gün 2, transdüksiyon sonra 4, 6 ve 8 H1 hESC ETV2 / GATA2 kaynaklı farklılaşma Faz kontrast görüntüleri; Ölçek çubuğu, 100 mikron. (B) günün farklılaşma 3'te hematopoetik geçiş endotelyal geçiren ETV2 / GATA2 kaynaklı hücrelerin flow sitometri analizleri:-VE kaderin + HE hücrelerin CD226 ifade CD73 ifadesini yoksundur. Endotelial hücrelerin küçük bir yüzdesi, CD73 (non-HE) ifade etmektedir. (C) Akış SİTOMETRİK birgün 7 sonrası transdüksiyon üzerinde ETV2 / GATA1- ve ETV2 / GATA2 kaynaklı H1 hPSCs bir nalysis. (D) 14 gün süre ile FBS ve SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF ve EPO ile takviye edilmiş ortam içinde genişletilmiş ETV2 / GATA2 kaynaklı hematopoietik hücrelerin akış sitometrik analizi. (E) eritroid (E), makrofajlar (M), granülositler (Gr) ve yüksek Proliferatif Potansiyel koloniler (HES) temsil eden ETV2 / GATA2 CFC tahlilde transdüksiyona tâbi tutulmamış hücreler ve karşılık gelen Wright lekeli sitos- pinler oluşan hematopoietik koloni türleri. Sitos- pinler için CFC tahlil, 250 mikron, Ölçeği bar, 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. GATA2 / TAL1 ve hPSCs arasında GATA2 / TAL1 / LMO2 kaynaklı farklılaşma GATA2 (A) Faz kontrast görüntüleri / TAL1 / LMO2günlerde 2, 4, 6 ve 8 H1 hESC -kaynaklı farklılaşma; Ölçek çubuğu, 100 mikron. (B) farklılaşma 3. gününde hematopoietik geçiş endotelyal geçiren GATA2 / TAL1 kaynaklı hücreler akış sitometrik analizi: VE-cadherin + hücreleri HE markör CD226 ekspresyonunu kazanır. Endotelial hücrelerin küçük bir yüzdesi, CD73 (non-HE) ifade etmektedir. (C) H1 hESC, günde 5 GATA2 / TAL1 kaynaklı farklılaşma immünofloresan boyama; VE-cadherin + hücreleri (yeşil) hematopoietik işaretleyici CD43 (kırmızı) ekspresyonunu kazanır. (D) GATA2 / TAL1 / Flow sitometri analizleri LMO2 kaynaklı SCF, TPO, EPO ve bFGF ile takviye edilmiş serumsuz ortam içinde genişleme, ertesi gün 14 sonrası transdüksiyon süspansiyonun hematopoietik kültürleri; (E) eritroid (E), makrofajlar (M), ve M temsil Wright-lekeli sitos- pinler mukabil GATA2 / TAL1 / LMO2 farklılaşmış cellsand göre CFC deneyde oluşan hematopoietik koloni türleriegakaryocytes (Mk). Sitos- pinler için CFC tahlil, 250 mikron, Ölçeği bar, 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: lentiviral transdüksiyon prosedürü Optimizasyonu GFP lentivirüs farklı MOI H1 HESC (A) İletimi.. (B) Hücre canlılığı ve (her virüs için 2) farklılaşma (her virüs için 1) düşük, GATA2 / TAL1 / LMO2 ile transduced kültürlerde verim ve yüksek İçişleri Bakanlığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TFs aşırı ifadesi ile hPSCs hematopoietik farklılaşması için yukarıda tarif edilen yöntem olup, HESC ve böylece en fazla 30 milyon kan hücrelerinin üretimini gelen izin iPSCs gelen HE ve miyeloid ve eritropent-magakaryocytic öncüller için hızlı ve etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir Bir milyon pluripotent kök hücreleri 10. Bu yöntem, çok sayıda HESC ve iPSCs hatları 10 tutarlı farklılık sergiledi. ETV2 ve GATA2 tarafından farklılaşma sırasında gata1 faktörleri yanı sıra GATA2 ve TAL1 faktörleri, hücreler, HE kan üreten endotel oluşturan ve hematopoetik geçiş bir endotel uğrar. HE oluşumu genellikle gün 3 ve farklılaşma 4 arasında görülmektedir. HE aşaması belirgin almasına olurken LMO2, TAL1 bir transkripsiyonel ko-faktör eklenmesi GATA2 ve TAL1 kombinasyonu, anlamlı, farklılaşma sağlamlığı artmıştır.
Yönlendirilmiş differentia başarısıtranskripsiyon faktörleri ile hPSCs arasında tion esas olarak (i) hücrelere nükleik asitlerin etkili bir doğum, (ii) hücre canlılığı genetik manipülasyonlar takip ve hücre içindeki egzojen transkriptlerin (iii) etkili bir çeviri bağlıdır.
Tarif edilen metodun önemli safhalardan biri HEK 293T hücre transfeksiyonu için kesin bir tamponu pH bağlıdır etkili bir lentiviral birimlerinin üretimi, ve viral, üretim ve transdüksiyon deneyleri, tüm adımlarda endotoksin kirletici bulunmamasıdır. HEK 293T hücrelerinde viral üretiminin hiçbir belirti 13 gözlenmesi halinde ambalaj ve zarf plazmidler dahil olmak üzere tüm yapıları, bütünlüğü, kontrol edilmelidir.
Transkripsiyon faktörlerinin kombinasyonları kullanarak farklılaşma protokol tasarımı birkaç değişkenler düşünmelisiniz. Viral transdüksiyon yüksek verim, başarılı farklılaşması için çok önemlidir. Transdüksiyon verimliliği yöntemine bağlıdır beri virüs için kullanılanüretimi ve saflaştırılması, tavsiye edilir (Şekil 4A), bir GFP-lentiviral vektör kullanarak hPSC transdüksiyon optimize eder. Viral birleştirme Aşağıdaki transdüksiyon transgen spesifik primerler (Tablo 3), genomik PCR kullanılarak kontrol edilmelidir. Farklılaşma optimizasyonu da reaksiyon karışımı içinde lentiviral konsantrasyonunun ayarlanmasını içermelidir. Virüs nispeten düşük bir miktarda, 0.5-1 İB, hPSC farklılaşmasını indükleyebilir. Daha yüksek bir MOI farklılaşma verimini artırır, aynı zamanda, hücre ölümü (Şekil 4B) artar. Ek iyileştirme adımı reaksiyon karışımı içinde her bir virüs için MOI oranı ayarlama içerebilir. GATA2 In / ETV2 GATA2 için İçişleri Bakanlığı iki katına kültürleri transdüse, ETV2 göre, farklılaşma etkinliğini arttırır. Gata1 / ETV2, GATA2 / TAL1 ve GATA2 / TAL1 / LMO2 her virüs için eşit İçişleri Bakanlığı için en uygunudur.
TFs transdüksiyon sonra, hücrelerin büyük bir çoğunluğu underwsadece çok az sayıda hücre farklılaşmamış morfoloji muhafaza ederken angiohematopoietic farklılaşma KBB. PSIN-EF1α lentiviral vektörler antibiyotik direnci dahil olduğundan, puromisin ile kültürlerin tedavisi bakiye farklılaşmamış hücreleri yok etmek için kullanılabilir.
Karakteristik endotel morfolojileri ve sonraki yuvarlak kan hücreleri ile hücre oluşumu, başarılı bir farklılaşma göstermektedir. Ortalama olarak, GATA2 / ETV2 kombinasyonu CD43% 40-50 üreten + VE-kaderin kalan% 30'a kadar hücreleri ile farklılaşma gün 9-10 tarafından +/- kan hücrelerini VE-kaderin + CD43 -. Gata1 / ETV2 kombinasyonu daha hızlı bir şekilde CD43 ekspresyonunu indükler ve GATA2 / ETV2 kombinasyonu ile karşılaştırıldığında CD43 + hücrelerinin daha büyük bir sayı oluşturur. Bu kültürlerde, + hücrelerinin birlikte ifade CD43 çoğunluğu-cadherin. / TAL1, CD43 + hücrelerinin sayısı genellikle ulaşır GATA2 ile transduced kültürlerde 40-50%. GATA2 için LMO2 eklenmesi / TAL1 ölçüde hızlandırır ve kan üretimini artırır ve belirgin gelişme endotel aşamasını sözleşmeleri.
Koloni oluşturan deneyler indüklenen hematopoietik progenitörlerin tipi ve sıklığını belirlemek için kullanılır. Koloni oluşturan hücrelerin yapısı bireysel koloniler Wright lekeli sitos- pinler hazırlanması ile teyit edilebilir. ETV2 ve GATA2 ile dönüştürülmüş hPSCs daha çok büyük (çapı 0.5 mm'den daha büyük) bir olgun myeloid hücreleri ve ara sıra eritroid ve megakaryositik hücreler, olgunlaşmamış granülositik ve monositik hücrelerin oluşan yüksek çoğalma potansiyeli (HES) miyeloid koloniler oluşturur. GATA2 içinde CFC ortalama% 80'den fazla Açık / ETV2 transdüse kültürler miyeloid hidroelektrik santrallerinin işletmeye alınışından vardır. Buna ek olarak, bu kültürlerin genellikle toplam CFC az% 20'sini oluşturan eritroid ve makrofaj koloni (Şekil 2E), üretir. ETV2 ve gata1 ile hPSC iletimi büyük ölçüde arttırır th% 50 kadar CFC-E e oranı. TAL1 ve GATA2 transdüse kültürler ve çok az makrofaj kolonileri ile megakaryositik kolonilerinin (toplam CFC% 10'dan fazla) (toplam CFC az% 5) (toplam CFC% 80'den fazla) çoğunlukla eritroid üretirler. TAL1 için LMO2 ve GATA2 kombinasyonunun eklenmesi ile önemli düzeyde koloni oluşturan hücrelerin sıklığını arttırır eritro-megakaryositik 10 potansiyeli. Transkripsiyon faktörleri tarif edilen kombinasyonları ile transdüksiyon, aşağıdaki CFC aktivitesi desen farklıdır hESC ve hiPSC hatlar 10 arasındaki tutarlıdır.
Özetle, hPSCs içinde lentiviral aracılı aşırı ekspresyonu TFs kullanarak HE indüksiyon ve kan nispeten hızlı ve etkili bir araçtır. Bu sistem aynı zamanda, diğer TF'lerin farklılaşma kapasitelerinin değerlendirilmesi için kullanılan ve endotelyal ve hematopoietik tarifnamede için gerekli olanlar tespit edilebilir. Bununla birlikte, mevcut protokolü ex çalışmaları için sınırlı bir kullanıma sahiptirBu yüzey reseptörü aracılı sinyallemeyi bypass TFs kullanır ekstrasellüler, HE indüklenmesinde dahil sinyalizasyon. Geçerli protokol bir transjenin yapısal ifade kullanarak kan üretimini tarif de, benzer sonuçlar modifiye mRNA'ları 10 kullanılarak elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IS Cynata için kurucu ortağı ve danışmanlık yapmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
|||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
|||
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
|||
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
