Introduction
所述Gzms是一族局部存在的CTL专门溶酶体和NK细胞1高度同源的丝氨酸蛋白酶。这些杀伤细胞的细胞毒性颗粒还包含与膜破坏蛋白质PFN和GNLY被在识别去往消除2,3靶细胞的同时释放与Gzms。有五个Gzms在人类（GzmA，B，H，K和M），和10 Gzms小鼠（GzmA - G，K，M和N）。 GzmA和GZMB是最丰富的和广泛的研究在人类和小鼠1。然而，最近的研究已经开始研究细胞死亡途径以及由在健康和疾病4，另外，所谓孤儿Gzms介导的额外的生物效应。
该Gzms最著名的功能，特别是GzmA和GZMB的，是程序性细胞死亡在哺乳动物细胞中的诱导时由PFN 5,6-递送到靶细胞。然而，最近的研究还PFN 7,8展示了Gzms细胞外效应与免疫调节和炎症产生深远的影响，独立胞浆交付。这是在Gzms胞浆入境后有效地杀伤细胞的光谱也于近日从哺乳动物细胞扩大至9,10细菌，甚至某些寄生虫11。最近的这些发现开辟了一个全新的领域进行研究GZM。因此，经济高效，高产哺乳动物表达系统将显著缓解的方式为那些未来的研究。
天然人，小鼠和大鼠Gzms已成功地从CTL和NK细胞线12-14的颗粒级分纯化。然而，在我们手中的这样的纯化技术的产率小于0.1毫克/升细胞培养物（未发表的观测和12）的范围内。此外，单个GZM由诺特的色谱分离而不污染řGzms和/或蛋白质，也存在于该颗粒是具有挑战性（未公布的数据和12,14）。重组Gzms产生于细菌15，酵母16，昆虫细胞17和甚至在哺乳动物细胞如HEK 293 18,19。仅在哺乳动物表达系统承担产生重组酶具有相同于天然细胞毒性蛋白质的翻译后修饰的潜力。翻译后修饰已牵涉与通过内吞作用的特异性摄取和蛋白酶的靶细胞20-22内的细胞内定位。因此，通过使用pHLsec 23质粒骨干GZM表达（拉杜Aricescu和伊冯·琼斯，英国牛津大学一个样的礼物），我们建立了一个简单，时间和成本效益的系统，高产蛋白生产HEK293T细胞。 pHLsec结合CMV增强用鸡Β肌动蛋白启动子;在一起，这些元件demonstra泰德在各种细胞系24中的最强的启动子活性。此外，该质粒含有兔Β珠蛋白内含子，优化的Kozak和分泌信号，一个赖氨酸的6xHis标签和一个多聚A信号。插入可方便地分泌信号，并确保对缺乏适当的N-末端结构域的蛋白的最佳表达和分泌效率的赖氨酸的6xHis标签（ 图1）之间进行克隆。为Gzms的表达，我们换成由载体随后肠激酶（EK）的网站（DDDDK）提供的分泌信号内源分泌信号序列，使得EK治疗活化分泌Gzms（活性Gzms开始与N-末端氨基酸序列IIGG 25）。另外，在有利于该方法，HEK293T细胞在低价介质快速增长，如Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），并且非常适合于成本效益的磷酸钙转染法。
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Protocol
1.生产表达质粒pHLsec-GZM的
- 从人NK细胞制备总RNA用合适的RNA分离的方法和使用第一链cDNA合成试剂盒反转录（在26或NK细胞系的NK-92表达所有五个人类Gzms制备为原代细胞），继manufacturer`的建议。使用GZM基因PCR和克隆到pHLsec在23（拉杜Aricescu和伊冯·琼斯，英国牛津大学样的礼物）描述使用AGEI和KpnI位点（ 图1）放大。
注意：使用在表1所示的以下引物。 - 确认无误后插入测序。展开DH5α细胞中的表达质粒和净化使用无内毒素质粒提取试剂盒，并按照制造商的说明。
- 重悬在无内毒素的无菌水的纯化的质粒以2mg / ml和商店的浓度在-20℃until采用。
Gzms在HEK293T细胞2.表达
- 试剂的制备
- 制备标准培养基。以Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）含有高葡萄糖（25毫米），Glutamax的（4毫摩尔），丙酮酸钠（1mM的）添加标准胎牛血清（FCS），青霉素（100单位/ ml），链霉素10％（ 100微克/毫升）。
- 准备转染培养基。而不青霉素 - 链霉素的培养基中添加25微克/ ml的氯喹（在转染当天，从1000倍的股票在PBS，储存在-20℃下添加新鲜）。
- 制备无血清培养基：向无血清培养基中的HEK293细胞中添加谷氨酰胺（4毫摩尔），青霉素（100单位/ ml），链霉素（100微克/毫升），并为2.5mg / L的两性霉素B.
- 准备使用前于表2和过滤器描述了一个0.45微米的过滤器的解决方案：
- 扩大HEK293T细胞
- 成长HEK293T细胞20毫升崇拜采用150×25mm的组织培养皿中茜。
- 在80％汇合分裂细胞（分比为1：4，通常每3天）。细胞松散连接，它们可通过严格上下抽吸被机械分离的无胰蛋白酶消化。
- 板的细胞转染的前一天晚上，得到60-70％汇合在转染（接种密度〜2×10 5个细胞/ ml）的一天。通常制剂规模由20至25培养皿。
- 磷酸钙转染
- 1小时转染前，改变标准培养基到20ml转染培养基。邻近的这1小时温育步骤结束时，混合400微克质粒DNA与10.95毫升双蒸2 O和在50ml试管1.55毫升2M 氯化钙 （1管/ 5菜）。
- 1至2之前转染分钟，添加12.5毫升2×HBS到12.5的DNA的钙溶液的毫升，由管倒置混合和温育30秒，在室温。
- 第添加ë混合物直接加入细胞（每皿5毫升）逐滴入培养基制备2.3.2。均匀地洒在整个区域，把介质到浅橙色的颜色。
- 孵育培养皿为7至11小时，在组织培养恒温箱（37℃，5％CO 2的湿润空气）。培养后，微细的析出物是可见的。移除转染介质，用预热的PBS小心冲洗并加入2.1.3制备20毫升无血清培养基中。孵育72小时在组织培养箱。
- 通过运行在SDS-PAGE的细胞上清液的样品（约20微升）和用考马斯亮蓝染色来可视化颗粒酶带分析的转染和表达效率。
- 净化Gzms从培养上清镍IMAC
- 培养后，弃去细胞的培养物上清液加到250ml试管并离心清晰。开展第一自旋（400 XG，10分钟，4℃C），将清除介质从分离的细胞。转移在新鲜250毫升管和自旋上清液以4000×g离心，30分钟，在4℃以除去任何残留的细胞碎片。
- 加入5毫升5 M氯化钠，6.25毫升0.25M的制备NiSO 4的2M Tris碱（pH 8）中和1毫升每250毫升清除上清液。使用500ml的真空过滤器单元（0.45毫米）过滤上清。
- 平衡使用合适的FPLC系统镍IMAC柱与他的结合缓冲液A（10柱体积，CV）。
- 以0.5毫升/分钟，在4℃的流速施加的澄清的上清液到平衡柱。
- 上清液施加之后，直到UV吸收基线达到（通常为10 CV）与他的结合缓冲液洗柱。
- 洗脱Gzms具有线性20毫升梯度（0至250mM咪唑）以0.5毫升/分钟流速，同时收集2毫升的级分。分析洗脱的级分通过SDS-PAGE和考马斯染色。
- 肠激酶（EK）处理和最终的清理通过阳离子交换层析
- 游泳池GZM包含在透析管≤10截留分子量组分。储存在-20℃的小样本作为预EK控制。
- 在0.02单位/50毫升初始上清液添加EK直接向汇集馏分在透析管中透析O / N（至少16小时）在RT在EK-缓冲器（4L，改变缓冲一次）。
- 第二天，分析EK在相比于预EK控制通过SDS-PAGE和考马斯染色处理Gzms。
- 当N-末端处理完成后，改变透析缓冲至S缓冲液A（4 L）和透析另外4小时，在室温。透析过滤（0.45微米）。
- 平衡一个的S-柱带有S缓冲液A与加载样品上柱以0.5ml /分钟，在4℃的流速。
- 样后，直到紫外吸收基线达到（约10 CV）洗带S缓冲液A柱。洗脱Gzms用30ml的线性梯度（150〜1000毫摩尔NaCl）。 GzmAê在琵琶〜650毫米氯化钠，在GZMB〜700毫米氯化钠和GzmM在〜750毫米氯化钠。
- 分析洗脱的级分通过SDS-PAGE和比色测定法（见下文）。含有Gzms和浓缩池级分（约30倍，至约100μM的浓度）的自旋过滤器（15毫升，10 MWCO）。分装浓GZM准备并储存在-80℃。
3.测试GZM活动
- 试剂的制备
- 制备比色测定缓冲液：50毫摩尔Tris-基地，pH为7。
- 为GzmA的测量，添加的Na-CBZ-L-赖氨酸苄硫基酯（S-BZL）（BLT）的测定缓冲液以0.2毫和5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）的终浓度（DTNB），以0.22毫浓度。对于GZMB，包括0.2毫米的Boc - 丙氨酸 - 丙氨酸 - 天冬氨酸 - S-BZL（AAD）和0.22毫DTNB。对于GzmM，包括0.2毫米SUC-丙氨酸 - 丙氨酸 - 脯氨酸 - 亮氨酸对硝基苯胺（PNA）（AAPL）。合成肽是由适当的储备溶液中加入（在DMSO中，保存位置编在-20℃）到缓冲新鲜的测定之前。
- 制备裂解测定缓冲液：100mM NaCl的50毫摩尔Tris-碱，pH 7.5
- 制备比色测定缓冲液：50毫摩尔Tris-基地，pH为7。
- 比色法
- 分发来自洗脱份小样本GZM（<5μL）或个股集中在96孔平底板。包括一个阳性对照组（测试GZM制剂或粗NK细胞裂解液）和阴性对照（只缓冲）。
- 加入100微升测定缓冲液到每个孔中（使用多通道移液器）。孵育10分钟，在37℃。测量的OD在酶标仪405nm处。
- 切割测定法
- 为使用纯化的底物裂解测定法，共孵育的蛋白质底物（天然的或重组的，100 - 400纳米;高效GZM衬底的几个例子将在本节的末尾呈现在结果部分，并在注）与连续稀释的一个GZM在不同时间测定缓冲液（起始于400纳米）。通过SDS-PAGE和考马斯或银染色分析;或者通过免疫印迹使用特异性抗体。
- 对于使用细胞裂解物裂解测定法，悬浮在1ml分析缓冲液和裂解10 6个HeLa细胞（或任何可用的肿瘤细胞系）通过在37℃下三次在乙醇/干冰浴中解冻冷冻。通过离心（在4℃下15000×g离心10分钟）除去细胞碎片。
- 共孵育澄清的裂解液与Gzms各种浓度和倍以上。切割是通过使用合适的抗体进行免疫印迹检测到。
注：国际棋联基板善意的几个例子商业抗体是其中可供选择：买入（BH3相互作用域死亡激动剂）和caspase 3由GZMB 27,28切割;多个异构核核糖（hnRNPA1，A2和U）由GzmA 29切割;巨细胞病毒磷71 GzmM 30。
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Representative Results
在下面的部分中，我们将提出一个GzmA制剂的一个完整的文件照亮方法。我们还成功纯化GZMB和GzmM，在生产方面的净化效率和活动类似的结果。然而，从这些准备工作后，我们将只显示几个选定的数据块。从293T细胞按照目前的协议GZMB准备在几个已发表 的研究中使用，突出了他们活动的各种生物检测系统9,29,31-34。
一个典型的GzmA纯化示于图2A中 。有效转染和表达在72小时中在还原条件下显示通过在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的可检测GZM带未经培养上清液（〜37 kDa的为GZMB和GzmM进一步集中;〜三十四分之六十〇kDa的为GzmA下非还原/还原条件）。对IMAC纯化后，将样品与输入处理okinase（EK）。的EK的可见移位处理过的样品（后EK）相比，预EK控制进行了观察。上的S柱最终纯化导致高纯度GZM制剂（GzmA 图2A; GZMB和GzmM 图2B）具有单个带的外观上考马斯染色的蛋白质凝胶。将合并的级分浓缩至〜100μM的终浓度。通常情况下，我们得到的每100毫升培养上清液约0.5至1毫克Gzms产量。为了证明有效的糖基化，一些前期准备分别用内切糖苷酶（远藤）H，从而消除由N-连接的糖蛋白的高甘露低聚糖。天然GzmA具有N-连接的糖基化位点处的Asn-142中，向其中一个高甘露寡糖势必35。 EndoH处理诱导明显的迁移率在GZM A，以及GZMB，从HEK293T细胞制剂，但不是在细菌中产生GzmA如通过SDS-PAGE和考马斯分析染色（ 图2C）。
按常规，每GZM批次在比色测定酶活性测试。这种快速和可靠的测试由小的合成肽是由测定缓冲液的颜色变化用分光光度计指示的裂解展示了Gzms的蛋白水解活性。由于有关的氨基酸残基（P 1的位置）之后，这些蛋白酶切割不同的偏好，一个特定肽的选择Gzms各不相同。 GzmA具有胰蛋白酶样活性，裂解后的碱性残基精氨酸（Arg，R）和赖氨酸（Lys，K）。 GZMB裂解后优先天冬氨酸残基（天冬氨酸，D）和GzmM裂解亮氨酸（Leu，L）和甲硫氨酸（Met，M）的后1。我们以优惠的选择肽BLT是-S-BZL来衡量GzmA活动，AAD -S-BZL的GZMB和AAPL -pNA为GzmM。
该thiob之间的主要区别enzylester基板（AAD和BLT）和对硝基苯胺底物（Apple）是在特定的化学性质，在该GZM介导thiobenzylester基板的裂解释放苄基硫醇，其中仅触发在其与生色DTNB下游反应生色反应。因此，在thiobenzylester衬底的反应缓冲液DTNB必须存在，而对硝基苯胺的GZM介导的释放是足够的比色检测。比色测 定的详细方法最近发表36。 图3A示出了代表性的BLT和AAPL酯酶活性在从GzmA和GzmM制备的S柱的洗脱级分，分别。比色测定法也可用于重组的活性比较天然GZMB制剂。 如图3B所示 ，重组293T GZMB裂解生色底物具有相似的效率与从一个人NK大公纯化天然GZMBL线，如最近描述12。
更具体地测试GZM活性，使用公知的蛋白质底物GZM切割分析来表示。这些裂解测定法可与纯化的重组或天然蛋白进行（如果可用），用细胞裂解物或最生理与完整细胞的。如果一个蛋白底物是可用的，蛋白水解活性可以用简单的共孵育实验用，因为这是证明与已知的细菌GzmA和GZMB基板nuoCD和nuoF 9，以及与新的人线粒体GzmM基板NDUFAF3的GZM制剂进行分析（ 图4A）。
细胞裂解液代表的多个GZM基板的另一个明显的来源。商业抗体可针对许多衬底。一种快速和简单的方法，以产生细胞裂解物是通过将多个冷冻/解冻循环如以前证明33。使用洗涤剂我不是建议，因为他们可以用GZM活动干扰。在图4B中 ，GzmA介hnRNPA1的裂解在HeLa细胞裂解物用抗hnRNPA1抗体，以及抗Β肌动蛋白抗体作为上样对照中演示的免疫印迹。
为进行裂解测定（或细胞毒性试验）在完整细胞，附加递送分子的可用性是必要的（PFN或链球菌溶血素O，SLO，用于哺乳动物细胞; GNLY或其它抗微生物肽用于原核细胞）。在完整细胞裂解测定法是最具挑战性的作为传递分子的浓度是非常关键的，并且需要大量的微调。引入这些复杂的细胞凋亡检测的协议是超出了本文的范围。在这里，我们只能引用文学的浩瀚身体，作为例子12,13。
<STRONG>表1：GZM克隆引物序列。
了用来克隆GzmA，GZMB和GzmM引物序列表示。正向引物被设计来介绍活性蛋白酶的N-末端之前EK位点（ 见图1）
表2：库存解决方案和缓冲区组成。
最重要的储备溶液和缓冲液的配方表示。
图1。 pHLsec顺序至关重要的构造克隆。
在该序列中，在载体中的几个元件是突出显示了对蛋白酶的克隆，分泌，净化IMAC和激活重要的：科扎克共识和分泌信号序列中，AGEI和KpnI酶切位点，以及C端Lys_6xHis标签。我们例举GzmA一如即N-末端融合于肠激酶（EK）的网站上的插入件。为完整的载体骨架的全图，我们指的是在23的补充信息。
图2。表达，纯化及全糖基化人Gzms的激活从HEK 293 T细胞。
A）示出了一系列的考马斯染色，非还原SDS-PAGE凝胶证实从其分泌整个GzmA生产过程中上清液至第一镍的IMAC纯化，EK治疗和菲纳通过阳离子交换层析升抛光。将培养上清液在还原（红色）和非还原（非红色）的条件下进行SDS-PAGE上。 GzmA是同二聚体（ssGzmA），其通过二硫键稳定。该GzmA同型二聚体（〜60 kDa）的运行接近污染BSA（〜66 kDa的）。在还原条件下的GzmA单体（shGzmA）显示为〜34 kDa带。非还原条件下以证明最终GZMB和GzmM制剂的纯度，代表考马斯染色的凝胶显示于B.菌群（ 大肠杆菌 ）中产生GzmA以及GzmA和GZMB在HEK293T细胞中产生治疗用EndoH和分析通过非还原SDS-PAGE和考马斯染色。相比于在细菌中（C）的生产非糖基化GzmA在HEK293T细胞产生的Gzms的糖基化被证明EndoH处理后的流动性变化。
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图3。重组Gzms水解酸化合成肽。
A）中，从最后的S柱的洗脱级分的小样本中使用BLT及AAPL，分别作为底物显色测定法进行了测试GzmA和GzmM活性。图表显示，被表示为的OD增加405nm处的肽裂解。活性峰级分用在如在UV吸收和SDS-PAGE分析（ 图2A和B）表示的洗脱的蛋白峰相关。 B）重组293T和本地GZMB（如所述制备12）在指定浓度的孵育在显色底物AAD的存在。 GZMB活性表示为OD变化在405纳米。图显示了平均值±我们认为以一式三份测试了最近GZM制剂的SEM。
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图4.重组Gzms劈斩蛋白底物。
A）的重组GST-标记的，细菌的呼吸链蛋白nuoCD和nuoF，以及哺乳动物呼吸链蛋白NDUFAF3，在37℃下处理与表示Gzms 15分钟的指定浓度。 1在20μl反应纯化的蛋白质的微克被使用。裂解物用SDS-PAGE和考马斯染色分析。 B）的HeLa细胞裂解物（以约1毫克/毫升的蛋白质浓度），通过使用抗hnRNPA1和Β - 肌动蛋白抗体进行免疫印迹孵育指定浓度的重组GzmA的30分钟并进行分析。
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Discussion
GzmA和GZMB的经典和广泛研究的作用是诱导凋亡在哺乳动物细胞中的其胞质递送由所述孔形成蛋白PFN 1之后。最近，Gzms的细胞毒性谱显著从哺乳动物细胞扩大到细菌9,10，以及某些寄生虫11。此外，GzmA和GZMB的非经典，胞外功能以及各种孤儿Gzms的生物学意义仍不清楚。因此，Gzms的健壮时间和成本的高效表达和纯化系统中，通过该协议规定，将是对这些未来的研究有很大的帮助。
该方法的强度是特别基于该表达载体，pHLsec 23，用于在该系统中。此质粒具有在大肠杆菌中高拷贝数大肠杆菌 ，从而实现高效的DNA的生产。其增强子/启动子元件提供的最强活性的各种细胞系24。它包含的转录单位内的内含子。内含子已被发现能增强在哺乳动物细胞中的基因表达高达100倍37。此外，该质粒提供了Kozak共有和优化的分泌信号，一个赖氨酸的6xHis标签和一个多聚A信号（ 图1）。插入可以通过使用分泌信号和赖氨酸6xHis标签之间的AGEI和KpnI位点克隆。使用AGEI和XhoI将避免polyHis标签。为Gzms，有必要插入肠激酶位点是使活化表达和IMAC纯化后的蛋白酶的蛋白酶的N-末端。用于其它酶的表达，这可能不是必要的。表达质粒成功地测试了各种长度，糖基化状态，并且二硫键数目的多个构建体，以及用于包含多个域具有不同的褶皱23的蛋白质。
38的介质。我们发现，转染效率是线性相关的DNA量仅为15厘米的培养皿（未发表的观察）在饱和约80微克。因此，我们建议使用多达80μ微克质粒DNA /皿在这个协议的最大效率。这将达到约2mg每制备的DNA（corresponding至2大量制备列）。转染效率最容易由72小时温育期后运行的培养上清液（约20μ升）在SDS-PAGE的样品进行监测。分泌的蛋白酶的蛋白条带应该是通过考马斯染色可见。如果GZM带弱，故细胞不分离，并出现活力，将培养物温育的IMAC纯化之前另外24小时。
另一个最重要的步骤是，肠激酶（EK）的治疗，激活酶。 EK活性是钙依赖的，并且由高浓度的NaCl 39或咪唑（未发表的观察）的抑制。因此，这是至关重要的透析从对IMAC洗脱物对含有足量的钙和不超过50毫摩尔NaCl的在中性pH EK缓冲足够体积（20毫升洗脱液每2升透析缓冲液）。建议16小时EK治疗在RT，并应通过SDS-PAGE是揭示一个迁移率变动Ô监视f显示处理的蛋白酶如果裂解完全。新鲜EK并将新鲜EK透析缓冲继续孵育如果移位是不完整的。只有当切割完成后，透析的缓冲器A的开始和纯化继续。 EK的催化轻链具有的5.2的pI值，允许EK从Gzms在最终阳离子交换层析的完全分离。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
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