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Biology

स्तनधारी कोशिकाओं में मानव Granzymes की एक उच्च उपज और लागत प्रभावी अभिव्यक्ति प्रणाली

Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52911
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1, 2
1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

Introduction

Gzms विशेष सीटीएल की लाइसोसोम और एन.के. कोशिकाओं 1 में स्थानीय अत्यधिक मुताबिक़ सेरीन प्रोटिएजों के एक परिवार के हैं। इन हत्यारा कोशिकाओं की साइटोटोक्सिक कणिकाओं भी उन्मूलन 2,3 के लिए किस्मत में एक लक्ष्य सेल की मान्यता पर Gzms के साथ एक साथ जारी कर रहे हैं कि झिल्ली में खलल न डालें प्रोटीन PFN और GNLY होते हैं। (- जी, कश्मीर, और एम एन GzmA) मानव (GzmA, बी, एच, कश्मीर और एम) में पांच Gzms, और चूहों में 10 Gzms कर रहे हैं। GzmA और GzmB सबसे प्रचुर मात्रा में है और बड़े पैमाने पर इंसानों और चूहों 1 में अध्ययन कर रहे हैं। हालाँकि, और अधिक हाल ही के अध्ययन सेल मौत रास्ते के रूप में अच्छी तरह से स्वास्थ्य और रोग 4 में अन्य तथाकथित अनाथ Gzms द्वारा मध्यस्थता अतिरिक्त जैविक प्रभाव की जांच करने के लिए शुरू कर दिया है।

PFN 5,6 द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं में कर दिया जब Gzms का सबसे अच्छा ज्ञात समारोह, GzmA और GzmB की विशेष रूप से, स्तनधारी कोशिकाओं में क्रमादेशित कोशिका मृत्यु के शामिल है। लेकिन, और अधिक हाल के अध्ययनों से यह भी PFN 7,8 द्वारा स्वतंत्र रूप से साइटोसोलिक प्रसव की, प्रतिरक्षा विनियमन और सूजन पर गहरा प्रभाव के साथ Gzms के बाह्य प्रभावों का प्रदर्शन किया। Gzms के साइटोसोलिक प्रवेश के बाद कुशलता से मारे गए हैं कि कोशिकाओं के स्पेक्ट्रम भी हाल ही में बैक्टीरिया 9,10 और यहां तक कि कुछ परजीवी से 11 स्तनधारी कोशिकाओं से चौड़ी हो गई थी। ये हाल की खोजों Gzm शोधकर्ताओं के लिए एक नया क्षेत्र खोल दिया। इसलिए, एक लागत प्रभावी, उच्च उपज स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली काफी उन भविष्य के अध्ययन के लिए रास्ता आसान हो जाएगा।

मूल निवासी मानव, माउस और चूहे Gzms सफलतापूर्वक सीटीएल और एन.के. कोशिकाओं लाइनों 12-14 का दाना अंश से शुद्ध किया गया है। हालांकि, हमारे हाथ में इस तरह के शोधन तकनीक की उपज कम से कम 0.1 मिलीग्राम / एल सेल संस्कृति (अप्रकाशित अवलोकन और 12) की सीमा में है। इसके अलावा, othe के द्वारा संक्रमण के बिना एक भी Gzm की chromatographic संकल्पआर Gzms और / या कणिकाओं में भी मौजूद हैं कि प्रोटीन (अप्रकाशित डेटा और 12,14) चुनौती दे रहा है। संयोजक Gzms भी इस तरह के HEK 293 18,19 के रूप में स्तनधारी कोशिकाओं में बैक्टीरिया 15, खमीर 16, कीट कोशिकाओं 17 में और में तैयार किए गए। केवल स्तनधारी अभिव्यक्ति सिस्टम देशी साइटोटोक्सिक प्रोटीन के समान posttranslational संशोधनों के साथ पुनः संयोजक एंजाइमों का उत्पादन करने की क्षमता सहन। Posttranslational संशोधनों endocytosis के द्वारा विशिष्ट तेज और लक्ष्य कोशिकाओं 20-22 भीतर प्रोटीज के intracellular स्थानीयकरण के साथ फंसाया गया है। इसलिए, pHLsec 23 का उपयोग करके Gzm अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड रीढ़ के रूप में (राडू Aricescu और वोन जोन्स, ऑक्सफोर्ड, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय के एक तरह का उपहार), हम में उच्च उपज प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक सरल, समय और लागत प्रभावी प्रणाली की स्थापना HEK293T कोशिकाओं। pHLsec एक चिकन Β actin के प्रमोटर के साथ एक सीएमवी बढ़ाने को जोड़ती है; साथ में, इन तत्वों प्रदर्शन हैटेड विभिन्न सेल लाइनों 24 में सबसे मजबूत प्रमोटर गतिविधि। इसके अलावा, प्लाज्मिड एक खरगोश Β ग्लोबिन Intron, अनुकूलित कोज़ाक और स्राव का संकेत है, एक लिस-6xHis-टैग और एक पाली-एक संकेत होता है। इंसर्ट के स्राव संकेत और उपयुक्त एन टर्मिनल डोमेन के कमी प्रोटीन के लिए इष्टतम अभिव्यक्ति और स्राव दक्षता सुनिश्चित करने लिस-6xHis-टैग (चित्रा 1) के बीच आसानी से क्लोन किया जा सकता है। Gzms की अभिव्यक्ति के लिए, हम इतना है कि ई.के. उपचार स्रावित Gzms (सक्रिय Gzms एन टर्मिनल के साथ शुरू सक्रिय एक enterokinase (ई.के.) साइट (DDDDK) द्वारा पीछा वेक्टर द्वारा प्रदान की गई स्राव संकेत के साथ अंतर्जात स्राव संकेत अनुक्रम की जगह अमीनो एसिड अनुक्रम IIGG 25)। इसके साथ ही इस विधि के लिए पक्ष में, HEK293T कोशिकाओं ऐसे Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के रूप में, कम कीमत माध्यम में तेजी से बढ़ती है, और लागत प्रभावी कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं।

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Protocol

अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pHLsec-Gzm की 1. उत्पादन

  1. मानव एन.के. कोशिकाओं से manufacturer` के बाद एक उपयुक्त आरएनए अलगाव विधि का उपयोग कर और एक प्रथम कतरा सीडीएनए synthesize किट का उपयोग कर टाइप रिवर्स (26 या सभी पांच मानव Gzms व्यक्त एन.के. सेल लाइन एन.के.-92 में तैयार के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं), कुल शाही सेना की तैयारी की सिफारिशों। 23 (राडू Aricescu और वोन जोन्स, ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय, ब्रिटेन की तरह का उपहार) के रूप में वर्णित Gzm सीडीएनए AgeI और KpnI साइटों (चित्रा 1) का उपयोग pHLsec में पीसीआर और क्लोन का उपयोग बढ़ाना।
    नोट: 1 टेबल में संकेत दिया निम्नलिखित प्राइमरों का प्रयोग करें।
  2. अनुक्रमण द्वारा सही सम्मिलित करता है की पुष्टि करें। DH5α कोशिकाओं में अभिव्यक्ति plasmids का विस्तार और एक endotoxin मुक्त प्लाज्मिड अलगाव किट का उपयोग कर शुद्ध और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  3. Unti -20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीग्राम / एमएल और दुकान की एकाग्रता में endotoxin मुक्त, बाँझ पानी में शुद्ध प्लास्मिड ResuspendL उपयोग।

HEK293T कोशिकाओं में Gzms 2. अभिव्यक्ति

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. मानक संस्कृति के माध्यम से तैयार करें। Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) युक्त उच्च ग्लूकोज (25 मिमी), GlutaMax (4 मिमी), सोडियम पाइरूवेट (1 मिमी) (मानक भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), पेनिसिलिन (100 इकाइयों / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10% जोड़ने 100 माइक्रोग्राम / एमएल)।
    2. अभिकर्मक मध्यम तैयार करें। पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के बिना संस्कृति के माध्यम से 25 माइक्रोग्राम / एमएल क्लोरोक्वीन (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पीबीएस में 1,000x शेयरों में से अभिकर्मक के दिन पर हौसले से जोड़) जोड़ें।
    3. सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम तैयार: सीरम मुक्त करने के लिए मध्यम HEK293 कोशिकाओं glutamine (4 मिमी), पेनिसिलिन (100 इकाइयों / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल), और 2.5mg / एल Amphotericin बी जोड़ने के लिए
    4. उपयोग करने से पहले एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ तालिका 2 और फिल्टर में वर्णित समाधान तैयार:
  2. HEK293T कोशिकाओं का विस्तार
    1. 20 मिलीलीटर पंथ में HEK293T कोशिकाओं आगे बढ़ें150 x 25 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन का उपयोग कर ure मध्यम।
    2. 80% confluency में विभाजित कोशिकाओं (1 का विभाजन अनुपात: 4, आमतौर पर हर 3 दिन)। प्रकोष्ठों शिथिल वे यंत्रवत् कड़ाई से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा trypsinization के बिना अलग किया जा सकता है, देते हैं।
    3. प्लेट कोशिकाओं अभिकर्मक पहले रात अभिकर्मक (बोने घनत्व ~ 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल) के दिन में 60-70 confluency% देने के लिए। एक सामान्य तैयारी आकार 20-25 संस्कृति व्यंजन शामिल हैं।
  3. कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक
    1. पूर्व अभिकर्मक को 1 घंटा, 20 मिलीलीटर अभिकर्मक मध्यम करने के लिए मानक संस्कृति के माध्यम से बदल जाते हैं। इस 1 घंटा ऊष्मायन कदम के अंत के पास, 10.95 मिलीलीटर DDH 2 0 और 50 मिलीलीटर ट्यूब में 2 एम 2 CaCl के 1.55 मिलीलीटर (1 ट्यूब / 5 व्यंजन) के साथ प्लास्मिड डीएनए के 400 माइक्रोग्राम मिश्रण।
    2. 1 अभिकर्मक के लिए पहले मिनट से 2, डीएनए कैल्शियम समाधान के 12.5 मिलीलीटर 12.5 मिलीलीटर 2x जोड़ने जोड़ने ट्यूबों के उलटा द्वारा मिश्रण और आरटी पर 30 सेकंड के लिए सेते हैं।
    3. वें जोड़ेंई मिश्रण सीधे कोशिकाओं (पकवान प्रति 5 एमएल), ड्रॉप बुद्धिमान माध्यम में करने के लिए 2.3.2 में तैयार किया। एक से थोड़ा नारंगी रंग करने के लिए मध्यम मोड़, पूरे क्षेत्र पर समान रूप से छिड़क।
    4. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 7-11 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% humidified हवा में सीओ 2) के लिए संस्कृति व्यंजन सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, एक ठीक वेग दिख रहा है। पूर्व गर्म पीबीएस के साथ सावधानी से कुल्ला, अभिकर्मक मध्यम निकालें और 2.1.3 में तैयार 20 मिलीलीटर सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम जोड़ें। एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 72 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. एसडीएस पृष्ठ पर सेल सतह पर तैरनेवाला का एक नमूना (~ 20 μl) चल रहा है और एक granzyme बैंड कल्पना करने के लिए Coomassie खूब ब्लू के साथ धुंधला द्वारा अभिकर्मक और अभिव्यक्ति की दक्षता का विश्लेषण करें।
  4. निकल IMAC द्वारा संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से Gzms का शुद्धिकरण
    1. ऊष्मायन के बाद, 250 मिलीलीटर ट्यूबों में सेल संस्कृति supernatants छानना और centrifugation द्वारा साफ है। पहली बार एक स्पिन के लिए बाहर ले जाने के (400 XG, 10 मिनट, 4 डिग्रीअलग कोशिकाओं से मध्यम साफ हो जाएगा कि सी)। किसी भी शेष सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG, 30 मिनट में ताजा 250 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    2. 5 एम NaCl के 5 एमएल को मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला के 250 मिलीलीटर प्रति 0.25 एम NISO 4 से 6.25 2 एम Tris-बेस (पीएच 8) की मिलीग्राम और 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक 500 मिलीलीटर वैक्यूम फिल्टर यूनिट (0.45 मिमी) का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर।
    3. एक उपयुक्त FPLC प्रणाली का उपयोग कर उसका बाध्यकारी बफर (10 कॉलम वॉल्यूम्स, सीवी) के साथ एक निकल IMAC स्तंभ संतुलित करना।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर equilibrated स्तंभ के लिए मंजूरी दे दी सतह पर तैरनेवाला लागू करें।
    5. सतह पर तैरनेवाला लागू किया गया था के बाद यूवी absorbance आधारभूत (आमतौर पर 10 सीवी) तक पहुँच जाता है, उसका बाध्यकारी बफर के साथ स्तंभ धो लें।
    6. Elute Gzms 0.5 मिलीलीटर की एक प्रवाह की दर में एक रेखीय 20 मिलीलीटर-ढाल (0-250 मिमी imidazole) के साथ / मिनट 2 मिलीलीटर-भिन्न के एकत्रित करते हुए। एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला द्वारा क्षालन भिन्न के विश्लेषण करें।
  5. Enterokinase (ई.के.)उपचार और कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा अंतिम क्लीन-अप
    1. ≤10 MWCO के साथ एक dialyzing ट्यूब में भिन्नों युक्त पूल Gzm। पूर्व ई.के. नियंत्रण के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर एक छोटा सा नमूना संग्रहीत करें।
    2. डायलिसिस ट्यूब में सीधे जमा अंश के लिए 0.02 यूनिट / प्रारंभिक सतह पर तैरनेवाला के 50 मिलीलीटर में ई.के. जोड़ें और हे / एन ई.के.-बफर में आरटी पर (कम से कम 16 घंटा) (4 एल, एक बार बदलने के बफर) dialyze।
    3. अगले दिन, ई.के. एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला द्वारा पूर्व ई.के. नियंत्रण की तुलना में Gzms में इलाज का विश्लेषण।
    4. एन टर्मिनल प्रसंस्करण पूरा हो गया है, जब एक (4 एल) बफर एस के लिए डायलिसिस बफर बदलने के लिए और आरटी पर एक और 4 घंटे के लिए dialyze। फ़िल्टर अपोहित (0.45 माइक्रोन)।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर साथ स्तंभ पर नमूना लोड एस बफर ए के साथ एक एस स्तंभ संतुलित करना।
    6. यूवी absorbance आधारभूत (लगभग 10 सीवी) तक पहुँच जाता है नमूना लोड करने के बाद, एस बफर के साथ स्तंभ धो लें। एक 30 मिलीलीटर रैखिक ढाल (150 से 1000 मिमी NaCl) के साथ Gzms elute। GzmA ई~ 750 मिमी NaCl पर ~ 700 मिमी NaCl और GzmM पर ~ 650 मिमी NaCl, GzmB पर तम्बूरे।
    7. एसडीएस पृष्ठ और वर्णमिति assays के (देखें नीचे) द्वारा क्षालन भिन्न के विश्लेषण करें। Gzms और ध्यान केंद्रित युक्त पूल भिन्न (लगभग 30 गुना, के बारे में 100 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए) स्पिन फिल्टर में (15 मिलीलीटर, 10 MWCO)। -80 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित Gzm तैयारियाँ और दुकान विभाज्य।

3. परीक्षण Gzm गतिविधि

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 50 मिमी Tris आधार, पीएच 7: वर्णमिति परख बफर तैयार करें।
      1. GzmA की माप के लिए, 0.2 मिमी और 5,5'-dithio बीआईएस (2-nitrobenzoic एसिड) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए परख बफर करने के लिए ना-सी बी जेड एल Lysine thiobenzyl एस्टर (एस Bzl) (बीएलटी) जोड़ने 0.22 मिमी की एक एकाग्रता के लिए (DTNB)। GzmB के लिए, 0.2 मिमी Boc-अला-अला-ASP-एस-Bzl (एएडी) और 0.22 मिमी DTNB शामिल हैं। GzmM के लिए, 0.2 मिमी सफलता-अला-अला-समर्थक ल्यू-P-nitroanilide (PNA) (AAPL) शामिल हैं। सिंथेटिक पेप्टाइड्स DMSO में (उपयुक्त शेयर समाधान से जोड़ रहे हैं, storएड हौसले परख से पहले बफर करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस) पर।
    2. दरार परख बफर तैयार: 100 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris आधार, पीएच 7.5
  2. वर्णमिति assays के
    1. 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों में क्षालन भिन्नों से छोटे Gzm नमूने (<5 μl) या केंद्रित शेयरों बांटो। एक सकारात्मक नियंत्रण (परीक्षण Gzm तैयारियाँ या कच्चे तेल की एन.के. सेल lysates) और एक नकारात्मक नियंत्रण (केवल बफर) को शामिल करें।
    2. (एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग) प्रत्येक अच्छी तरह से परख बफर के 100 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। एक microplate रीडर में 405 एनएम पर आयुध डिपो उपाय।
  3. विखंडन परख
    1. धारावाहिक dilutions के साथ; - शुद्ध substrates के उपयोग करते हुए दरार assays के लिए, (कुशल Gzm substrates के कुछ उदाहरण इस खंड के अंत में परिणाम अनुभाग में और नोट में प्रस्तुत कर रहे हैं 400 एनएम देशी या पुनः संयोजक, 100) एक प्रोटीन सब्सट्रेट सह सेते एक Gzm के विभिन्न समय के लिए परख बफर में (400 एनएम पर शुरू)।एसडीएस पृष्ठ और Coomassie या चांदी धुंधला द्वारा विश्लेषण; या पश्चिमी द्वारा विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग सोख्ता।
    2. सेल lysates का उपयोग कर दरार assays के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस तीन बार में एक इथेनॉल / ड्राई बर्फ स्नान और विगलन में ठंड से परख बफर और lyse के 1 मिलीलीटर में 10 6 HELA कोशिकाओं (या किसी भी उपलब्ध ट्यूमर सेल लाइन) को निलंबित। (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 XG) centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटाने।
    3. ऊपर के रूप में विभिन्न सांद्रता और समय पर Gzms के साथ मंजूरी दे दी lysate सह-सेते हैं। विखंडन उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting ने पता लगाया है।
      नोट: सदाशयी substrates के कुछ उदाहरण हैं जिसके लिए वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्ध हैं: बोली (BH3 बातचीत डोमेन मौत एगोनिस्ट) और GzmB 27,28 द्वारा cleaved कस्पासे 3; GzmA 29 से cleaved कई विषम परमाणु ribonucleoproteins (hnRNPA1, A2 और यू); GzmM 30 से साइटोमैगालोवायरस phosphoprotein 71।

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Representative Results

निम्नलिखित खंड में हम विधि रोशन करने के लिए एक GzmA तैयारी की एक पूरी प्रलेखन पेश करेंगे। हम भी सफलतापूर्वक शोधन क्षमता और गतिविधि के संबंध में इसी तरह के परिणाम का उत्पादन, GzmB और GzmM शुद्ध। हालांकि, उन बाद में तैयारियों से हम केवल डेटा के कुछ चयनित टुकड़े दिखाई देंगे। मौजूदा प्रोटोकॉल के बाद 293T कोशिकाओं से GzmB तैयारियों विभिन्न जैविक परख सिस्टम 9,29,31-34 में उनकी गतिविधियों पर प्रकाश डाला, कई प्रकाशित अध्ययन में इस्तेमाल किया गया।

एक ठेठ GzmA शुद्धि 2A चित्रा में दिखाया गया है। ~ GzmA के लिए 60/34 केडीए के तहत, 72 घंटा कम करने की शर्तों के तहत संस्कृति सतह पर तैरनेवाला GzmB और GzmM के लिए (~ 37 केडीए के आगे एकाग्रता के बिना एक Coomassie से सना हुआ एसडीएस पृष्ठ जेल पर एक detectable Gzm बैंड ने संकेत दिया गया था कुशल अभिकर्मक और अभिव्यक्ति के बाद ) की स्थिति को कम करने / गैर को कम करने। IMAC शुद्धि के बाद नमूने में प्रवेश के साथ इलाज किया गयाokinase (ई.के.)। ई.के. का एक दृश्य पारी नमूना (पोस्ट-ई.के.) पूर्व ई.के. नियंत्रण की तुलना में मनाया गया इलाज किया। Coomassie से सना हुआ प्रोटीन जैल पर एक भी बैंड उपस्थिति के साथ; एस स्तंभ पर अंतिम शुद्धि अत्यधिक शुद्ध Gzm तैयारियाँ (चित्रा 2B में GzmB और GzmM 2A चित्रा में GzmA) में हुई। जमा भिन्न के ~ 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए ध्यान केंद्रित किया गया। आमतौर पर, हम 100 मिलीलीटर संस्कृति सतह पर तैरनेवाला प्रति के बारे में 0.5 से 1 मिलीग्राम Gzms की पैदावार प्राप्त की। कुशल ग्लाइकोसिलेशन प्रदर्शित करने के लिए, कुछ प्रारंभिक तैयारियों एन से जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन से उच्च mannose oligosaccharides निकालता है जो Endoglycosidase (एंडो) एच, के साथ इलाज किया गया। मूल निवासी GzmA एक उच्च mannose oligosaccharide 35 के लिए बाध्य है, जो करने के लिए Asn-142 पर एक एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन साइट है। EndoH उपचार एक स्पष्ट गतिशीलता Gzm ए में बदलाव, साथ ही GzmB, HEK293T कोशिकाओं से तैयारियाँ प्रेरित नहीं बल्कि एसडीएस पृष्ठ और Coomassie द्वारा विश्लेषण के रूप में bacterially GzmA उत्पन्न मेंधुंधला (चित्रा -2)।

नियमित, हर Gzm बैच वर्णमिति assays में enzymatic गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया था। यह तेजी से और विश्वसनीय परीक्षण परख बफर के रंग बदलने के द्वारा spectrophotometrically संकेत दिया है कि छोटे सिंथेटिक पेप्टाइड्स की दरार से Gzms के proteolytic गतिविधि को दर्शाता है। कारण इन प्रोटिएजों फोड़ना, जिसके बाद अमीनो एसिड के अवशेष (P1 स्थिति) के विषय में विभिन्न वरीयताओं को, एक विशिष्ट पेप्टाइड की पसंद Gzms बीच बदलता है। बुनियादी अवशेषों (Arg, आर) और लाइसिन (लिस, कश्मीर) arginine के बाद GzmA cleaving, ट्रिप्सिन की तरह गतिविधि नहीं है। अधिमान्यतया एस्पार्टिक एसिड के अवशेष (एएसपी, डी) के बाद GzmB cleaves, और GzmM cleaves leucine (लियू, एल) और methionine (मेट, एम) के बाद 1। हमारी तरजीही पेप्टाइड पसंद GzmA गतिविधि को मापने के लिए बीएलटी एस-Bzl है, GzmM के लिए GzmB और AAPL -pNA के लिए एएडी एस-Bzl।

thiob के बीच प्रमुख अंतरकि Gzm thiobenzylester substrates की दरार केवल क्रोमोफोर DTNB के साथ अपने नीचे की ओर प्रतिक्रिया में एक वर्णजनीय प्रतिक्रिया से चलाता है जो लोबान-mercaptan, रिलीज की मध्यस्थता में enzylester substrates (एएडी और बीएलटी) और पी-nitroanilide सब्सट्रेट (AAPL), विशिष्ट रसायन शास्त्र है। पी-nitroanilide की Gzm की मध्यस्थता रिहाई वर्णमिति का पता लगाने के लिए पर्याप्त है, जबकि इसलिए, thiobenzylester substrates की प्रतिक्रिया buffers में DTNB, उपस्थित हो गया है। वर्णमिति assays के विस्तृत विधि हाल ही में प्रकाशित किया गया था 36। चित्रा 3 ए में क्रमश: एक GzmA और GzmM तैयारी की एस-स्तंभ से क्षालन भागों में प्रतिनिधि बीएलटी और AAPL esterase गतिविधि से पता चलता है। वर्णमिति परख भी देशी GzmB तैयारी करने के लिए पुनः संयोजक की गतिविधि तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, पुनः संयोजक 293T GzmB एक मानव एन.के. सेल से शुद्ध देशी GzmB की तुलना में समान दक्षता के साथ वर्णजनीय सब्सट्रेट cleavedएल रेखा के रूप में हाल ही में 12 में वर्णित है।

अधिक विशेष रूप से Gzm गतिविधि का परीक्षण करने के लिए जाना जाता है, प्रोटीन, substrates का उपयोग कर Gzm दरार assays के संकेत कर रहे हैं। ये दरार assays के सेल lysates के साथ, (यदि उपलब्ध हो) शुद्ध पुनः संयोजक या देशी प्रोटीन के साथ प्रदर्शन या बरकरार कोशिकाओं के साथ सबसे अधिक शारीरिक जा सकता है। एक प्रोटीन सब्सट्रेट उपलब्ध है, तो प्रोटियोलिटिक गतिविधि यह ज्ञात बैक्टीरियल GzmA के साथ प्रदर्शन किया और GzmB के साथ ही उपन्यास मानव माइटोकॉन्ड्रियल GzmM सब्सट्रेट NDUFAF3 साथ nuoCD और nuoF 9, substrates के रूप में Gzm तैयारी के साथ सरल सह ऊष्मायन प्रयोगों में विश्लेषण किया जा सकता (चित्रा -4 ए)।

सेल lysates कई Gzm substrates के एक और स्पष्ट स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। वाणिज्यिक एंटीबॉडी substrates के कई के खिलाफ उपलब्ध हैं। सेल lysates उत्पन्न करने के लिए एक तेज और आसान विधि पहले से 33 प्रदर्शन के रूप में कई फ्रीज / पिघलना चक्र लागू कर रहा है। डिटर्जेंट मैं का उपयोगवे Gzm गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में सिफारिश नहीं है। 4B चित्रा में, GzmA एक विरोधी hnRNPA1 एंटीबॉडी, साथ ही लोडिंग नियंत्रण के रूप में एक विरोधी Β actin के एंटीबॉडी का उपयोग कर एक immunoblot में प्रदर्शन किया है एक HeLa सेल lysate में hnRNPA1 की दरार मध्यस्थता।

बरकरार कोशिकाओं में दरार assays के (या cytotoxicity assays के) के लिए, एक अतिरिक्त वितरण अणु की उपलब्धता आवश्यक है (PFN या स्तनधारी कोशिकाओं के लिए Streptolysin हे, SLO,; GNLY या प्रोकार्योटिक कोशिकाओं के लिए अन्य रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स)। प्रसव के अणुओं की एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण है और व्यापक ठीक ट्यूनिंग की जरूरत के रूप में बरकरार कोशिकाओं में विखंडन assays के सबसे चुनौतीपूर्ण रहे हैं। एपोप्टोसिस assays के इन जटिल प्रोटोकॉल का परिचय इस पत्र के दायरे से बाहर है। यहाँ, हम केवल उदाहरण 12,13 के रूप में, साहित्य के विशाल शरीर का उल्लेख कर सकते हैं।

तालिका एक
<strong> तालिका 1: Gzm क्लोनिंग प्राइमर दृश्यों।

GzmA, GzmB और GzmM क्लोन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि प्राइमर दृश्यों संकेत कर रहे हैं। फॉरवर्ड प्राइमरों सक्रिय प्रोटीज के एन टर्मिनस से पहले एक ई.के. साइट शुरू करने के लिए डिजाइन किए गए थे (चित्रा 1 देखें)

सारणी 2
तालिका 2: शेयर समाधान और बफर रचनाएँ।

सबसे महत्वपूर्ण शेयर समाधान और buffers के व्यंजनों संकेत कर रहे हैं।

चित्र 1
चित्र 1। निर्माण क्लोनिंग के लिए क्रिटिकल pHLsec अनुक्रम।

अनुक्रम में, वेक्टर में कुछ तत्व हैंप्रोटिएजों की क्लोनिंग, स्राव, iMac शुद्धि और सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्रकाश डाला: कोज़ाक आम सहमति और स्राव संकेत दृश्यों, AgeI और KpnI प्रतिबंध साइटों, साथ ही सी टर्मिनल Lys_6xHis टैग। हम एन टर्मिनली एक enterokinase (ई.के.) साइट से जुड़े हुए है कि डालने के रूप में GzmA उदाहरण। पूरा वेक्टर रीढ़ की हड्डी का पूरा नक्शा के लिए, हम 23 में पूरक जानकारी के लिए देखें।

चित्र 2
चित्र 2। HEK 293 टी कोशिकाओं से अभिव्यक्ति, शोधन और पूरी तरह से ग्लाइकोसिलेटेड मानव Gzms के सक्रियण।

ए) की एक श्रृंखला से पता चलता है Coomassie से सना हुआ, गैर को कम करने के लिए सबसे पहले निकल IMAC शुद्धि, ई.के. उपचार और वित्तीय और प्रक्रियात्मक पहलुओं को सतह पर तैरनेवाला में अपनी स्राव से पूरी GzmA उत्पादन की प्रक्रिया का प्रदर्शन एसडीएस पृष्ठ जैल कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से एल चमकाने। संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (लाल) और गैर को कम करने (गैर लाल) की स्थिति को कम करने के तहत एसडीएस पृष्ठ पर चलाया गया था। GzmA एक डाइसल्फ़ाइड बंधन से स्थिर किया जाता है कि एक homodimer (ssGzmA) है। GzmA homodimer (~ 60 केडीए) बीएसए (~ 66 केडीए) को दूषित करने के लिए करीब चलाता है। शर्तों को कम करने के तहत GzmA मोनोमर (shGzmA) एक ~ 34 केडीए बैंड के रूप में प्रकट होता है। गैर को कम करने की शर्तों के तहत अंतिम GzmB और GzmM तैयारी की पवित्रता को प्रदर्शित करने के लिए, प्रतिनिधि Coomassie से सना हुआ जैल बी bacterially (ई कोलाई) में दिखाया जाता है GzmA के रूप में अच्छी तरह से GzmA और GzmB HEK293T कोशिकाओं में उत्पादन के रूप में EndoH के साथ इलाज किया और विश्लेषण किया गया उत्पन्न एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला गैर को कम करने से। बैक्टीरिया (सी) में उत्पादित गैर ग्लाइकोसिलेटेड GzmA की तुलना में HEK293T कोशिकाओं में उत्पादित Gzms की ग्लाइकोसिलेशन EndoH इलाज के बाद एक गतिशीलता पारी द्वारा प्रदर्शन किया है।

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चित्र तीन। संयोजक Gzms Hydrolyze सिंथेटिक पेप्टाइड्स।

ए), अंतिम एस स्तंभ से क्षालन भिन्न के छोटे नमूने substrates के रूप में, क्रमशः बीएलटी और AAPL, का उपयोग कर वर्णजनीय assays में GzmA और GzmM गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया। रेखांकन 405 एनएम पर एक आयुध डिपो वृद्धि के रूप में संकेत दिया गया था कि पेप्टाइड दरार दिखा। यूवी absorbance और एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (2A चित्रा और बी) में संकेत के रूप क्षालन में प्रोटीन चोटी के साथ सहसंबद्ध गतिविधि शिखर को भिन्न। संकेत सांद्रता में) में वर्णित 12 के रूप में तैयार बी), पुनः संयोजक 293T और देशी GzmB (वर्णजनीय सब्सट्रेट एएडी की उपस्थिति में incubated रहे थे। GzmB गतिविधि 405 एनएम पर एक आयुध डिपो परिवर्तन के रूप में संकेत दिया गया था। ग्राफ triplicates में परीक्षण किया गया है कि हमारी सबसे हाल ही Gzm तैयारियों के SEM मतलब ± पता चलता है।

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4. संयोजक Gzms फोड़ना प्रोटीन Substrates चित्रा।

ए) संयोजक जीएसटी टैग, बैक्टीरियल सांस की श्रृंखला प्रोटीन nuoCD और nuoF, साथ ही स्तनधारी सांस की श्रृंखला प्रोटीन NDUFAF3, 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए संकेत दिया Gzms का संकेत एकाग्रता के साथ इलाज किया गया। 20 μl प्रतिक्रियाओं में शुद्ध प्रोटीन की 1 माइक्रोग्राम इस्तेमाल किया गया। विखंडन एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला द्वारा विश्लेषण किया गया था। बी) ~ 1 मिलीग्राम / एमएल के एक प्रोटीन एकाग्रता में HeLa सेल lysate () विरोधी hnRNPA1 और Β actin के एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting से 30 मिनट के लिए पुनः संयोजक GzmA के संकेत सांद्रता के साथ incubated और विश्लेषण किया गया था।

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Discussion

GzmA और GzmB के शास्त्रीय और बड़े पैमाने पर अध्ययन भूमिका ताकना के गठन प्रोटीन PFN 1 से उनके साइटोसोलिक प्रसव के बाद स्तनधारी कोशिकाओं में apoptosis के शामिल है। हाल ही में, Gzms की साइटोटोक्सिक स्पेक्ट्रम बैक्टीरिया 9,10, साथ ही कुछ परजीवी से 11 करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं से काफी चौड़ी हो गया था। इसके अलावा, GzmA और GzmB के गैर-शास्त्रीय, बाह्य कार्यों के साथ ही विभिन्न अनाथ Gzms की जैविक महत्व अभी भी अस्पष्ट हैं। इस प्रोटोकॉल के द्वारा प्रदान के रूप में इसलिए, Gzms के एक मजबूत समय और लागत प्रभावी अभिव्यक्ति और शोधन प्रणाली, इन भविष्य के अध्ययन के लिए बहुत मदद की हो जाएगा।

इस विधि की शक्ति विशेष रूप से इस प्रणाली में प्रयोग किया जाता है कि अभिव्यक्ति वेक्टर, pHLsec 23, पर आधारित है। यह प्लाज्मिड ई में एक उच्च प्रतिलिपि संख्या है कोलाई, इस प्रकार कुशल डीएनए उत्पादन सक्षम करने से। इसकी बढ़ाने / प्रमोटर तत्व प्रदानविभिन्न सेल लाइनों 24 में सबसे मजबूत गतिविधि। यह प्रतिलेखन इकाई के भीतर एक Intron गये हैं। इंट्रोन्स अप करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए पाया गया है 37 से 100 गुना। इसके अलावा, प्लाज्मिड एक कोज़ाक आम सहमति और एक अनुकूलित स्राव संकेत, एक लिस-6xHis-टैग और एक पाली-एक संकेत (चित्रा 1) प्रदान करता है। इंसर्ट के स्राव संकेत और लिस-6xHis टैग के बीच AgeI और KpnI साइटों का उपयोग करके क्लोन किया जा सकता है। AgeI और XhoI का प्रयोग polyHis टैग से बचना होगा। Gzms के लिए, यह अभिव्यक्ति और iMac शुद्धि के बाद प्रोटिएजों की सक्रियता को सक्षम करने प्रोटिएजों के एन टर्मिनस पर एक enterokinase साइट डालने के लिए जरूरी हो गया था। अन्य एंजाइमों की अभिव्यक्ति के लिए यह आवश्यक नहीं हो सकता है। अभिव्यक्ति प्लाज्मिड सफलतापूर्वक कई विभिन्न लंबाई, ग्लाइकोसिलेशन राज्य अमेरिका, और डाइसल्फ़ाइड बांड की संख्या के निर्माणों है, साथ ही विभिन्न परतों 23 के साथ एकाधिक डोमेन निहित है कि प्रोटीन के लिए के लिए परीक्षण किया गया था।

38 बढ़ाया मध्यम करने के लिए (जो कि लाइसोसोमल डीएनए क्षरण को रोकता है)। हम अभिकर्मक दक्षता एक 15 सेमी पकवान (अप्रकाशित अवलोकन) के बारे में 80 माइक्रोग्राम पर केवल saturating डीएनए राशि का रैखिक निर्भर था पाया। इसलिए, हम अधिक से अधिक दक्षता के लिए इस प्रोटोकॉल में प्लास्मिड डीएनए / पकवान का 80 μ जी अप करने के लिए उपयोग करना चाहिये। यह तैयारी प्रति डीएनए के बारे में 2 मिलीग्राम (correspondin राशि होगी2 MaxiPrep स्तंभों के लिए छ)। अभिकर्मक दक्षता सबसे बड़ी आसानी से 72 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद एसडीएस पृष्ठ पर संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (लगभग 20 μ एल) का एक नमूना चलाकर नजर रखी थी। स्रावित प्रोटीज के एक प्रोटीन बैंड Coomassie धुंधला से दिखाई जानी चाहिए। Gzm बैंड कमजोर था और कोशिकाओं व्यवहार्य अलग और नहीं दिखाई दिया था, तो संस्कृतियों IMAC शुद्धि से पहले एक और 24 घंटे के लिए incubated रहे थे।

एक और सबसे महत्वपूर्ण कदम एंजाइम सक्रिय हो जाता है कि enterokinase (ई.के.) उपचार किया गया। ई.के. गतिविधि कैल्शियम निर्भर है और सोडियम क्लोराइड 39 या imidazole (अप्रकाशित अवलोकन) की उच्च सांद्रता से हिचकते हैं। इसलिए, यह पर्याप्त कैल्शियम और तटस्थ पीएच पर NaCl की अधिक से अधिक 50 मिमी युक्त ई.के. बफर के लिए पर्याप्त मात्रा (डायलिसिस बफर के 20 मिलीलीटर eluate 2 प्रति एल) के खिलाफ IMAC से eluate dialyze के लिए महत्वपूर्ण था। ई.के. उपचार आरटी पर 16 घंटे के लिए सिफारिश की है और एक गतिशीलता पारी ओ से पता चला है कि एसडीएस पृष्ठ द्वारा निगरानी की जानी चाहिएइलाज किया प्रोटीज च दरार को पूरा किया गया है। ताजा ई.के. जोड़ा गया है और बदलाव अधूरा था अगर ताजा ई.के. डायलिसिस बफर में ऊष्मायन जारी किया गया था। दरार को पूरा किया गया है केवल तभी, एस बफर ए के खिलाफ डायलिसिस शुरू किया गया था और शुद्धि जारी रखा। ई.के. का उत्प्रेरक प्रकाश श्रृंखला अंतिम कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी में Gzms से ई.के. का पूर्ण अलगाव की अनुमति देता है, 5.2 का एक अनुकरणीय मूल्य है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIzol Reagent Invitrogen 15596-026 Total RNA isolation kit
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064-014
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530L
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells Sigma 14571C
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco 31966-021
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO Thermo Scientific 68100
Enterokinase from bovine intestine Sigma E4906 recombinant, ≥20 units/mg protein
HisTrap Excel 5 ml column GE Healthcare 17-3712-06  Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml column GE Healthcare 17-1152-01  S column
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) Sigma C3647 GzmA substrate
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) MP Biomedicals 2193608 _10mg GzmB substrate
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) Bachem GzmM substrate
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma D8130 Ellman`s reagent

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References

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स्तनधारी कोशिकाओं में मानव Granzymes की एक उच्च उपज और लागत प्रभावी अभिव्यक्ति प्रणाली
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Dotiwala, F., Fellay, I., Filgueira, L., Martinvalet, D., Lieberman, J., Walch, M. A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (100), e52911, doi:10.3791/52911 (2015).

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