Introduction
De Gzms er en familie af meget homologe serinproteaser lokaliseret i specialiserede lysosomer af CTL og NK-celler 1. De cytotoksiske granulater af disse dræberceller indeholder også de membran-proteiner forstyrrer pFN og GNLY der er udgivet samtidig med Gzms efter genkendelse af en målcelle bestemt til eliminering 2,3. Der er fem Gzms hos mennesker (GzmA, B, H, K og M), og 10 Gzms i mus (GzmA - G, K, M og N). GzmA og GzmB er den mest udbredte og omfattende undersøgt hos mennesker og mus 1. Imidlertid har nyere undersøgelser er begyndt at undersøge celle-død veje samt de yderligere biologiske virkninger medieret af de andre, såkaldte forældreløse Gzms i sundhed og sygdom 4.
Den bedst kendte funktion af Gzms, især GzmA og GzmB, er induktion af programmeret celledød i pattedyrceller ved levering ind i målceller ved hjælp af PFN 5,6. Dog, Også nyere undersøgelser viste ekstracellulære virkninger af Gzms med dybtgående indvirkning på immunforsvaret regulering og inflammation, uafhængigt af cytosolisk levering af PFN 7,8. Spektret af celler, der aflives effektivt efter cytosolisk bogføring af Gzms blev også for nylig udvidet fra pattedyrceller for bakterier 9,10 og endda visse parasitter 11. Disse seneste opdagelser åbnet op for en helt nyt felt for Gzm forskere. Derfor vil en omkostningseffektiv, højt udbytte pattedyrsekspressionssystem væsentligt lette vejen for de fremtidige undersøgelser.
Nativ human, mus og rotte Gzms er blevet renset med succes fra granulatet brøkdel af CTL og NK-celler linjer 12-14. , I vore hænder udbyttet af sådanne oprensningsteknikker er imidlertid i området fra mindre end 0,1 mg / l cellekultur (upubliceret observation og 12). Desuden den kromatografiske opløsning på en enkelt Gzm uden forurening med other Gzms og / eller proteiner, der også er til stede i granulatet er udfordrende (upublicerede data og 12,14). Rekombinante Gzms blev produceret i bakterier, gær 15 16, insektceller 17 og i selv i pattedyrceller, såsom HEK 293 18,19. Kun de pattedyrekspressionssystemer bærer potentialet til at producere rekombinante enzymer med posttranslationelle modifikationer er identiske med det native cytotoksiske protein. Posttranslationelle modifikationer har været impliceret med den specifikke optagelse ved endocytose og den intracellulære lokalisering af proteasen inden målceller 20-22. Derfor, ved hjælp af pHLsec 23 (en slags gave fra Radu Aricescu og Yvonne Jones, University of Oxford, UK) som plasmidskelettet for Gzm udtryk vi etableret en enkel, tids- og omkostningseffektivt system til højt udbytte proteinproduktion i HEK293T cells. pHLsec kombinerer en CMV enhancer med en kylling Β-actin promotor; sammen, disse elementer demonstrationted den stærkeste promotoraktivitet i forskellige cellelinier 24. Derudover indeholder plasmidet en kanin Β-globin intron, optimeret Kozak og sekretionssignaler, en Lys-6xHis-tag og en poly-A-signal. Inserts kan klones bekvemt mellem sekretionen signalet og Lys-6xHis-tag (figur 1) at sikre optimal ekspression og sekretion effektivitet for proteiner, der mangler passende N-terminale domæner. Til ekspression af de Gzms, vi erstattet den endogene sekvens sekretion signal med det sekretionssignal tilvejebringes af vektoren efterfulgt af en enterokinase (EK) sted (DDDDK), således at EK behandling aktiveret udskilte Gzms (aktive Gzms begynder med den N-terminale aminosyresekvens IIGG 25). Derudover fordel for denne fremgangsmåde, HEK293T celler vokser hurtigt i billig medium, såsom Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), og er velegnede til omkostningseffektiv calcium-phosphat-transfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion af ekspressionsplasmidet pHLsec-Gzm
- Forbered totalt RNA fra humane NK-celler (primære celler fremstillet som i 26 eller NK-celle NK-92 udtrykke alle fem menneskelige Gzms) anvendelse af en egnet RNA-isolering fremgangsmåde og revers transkribere anvendelse af en første-streng cDNA syntetisere kit, efter manufacturer` anbefalinger. Forstærk Gzm cDNA under anvendelse af PCR og klon i pHLsec som beskrevet i 23 (slags gave fra Radu Aricescu og Yvonne Jones, University of Oxford, UK) ved hjælp af de Agel- og KpnI sites (Figur 1).
BEMÆRK: Brug følgende primere er angivet i tabel 1. - Bekræfte korrekte inserts ved sekventering. Expand ekspressionsplasmiderne i DH5a-celler og renses ved anvendelse af et endotoksin-frit plasmid isolation kit og følge producentens instruktioner.
- Resuspendere oprensede plasmider i endotoksin-fri, sterilt vand ved en koncentration på 2 mg / ml og opbevares ved -20 ° C until brug.
2. Ekspression af Gzms i HEK293T celler
- Fremstilling af reagenser
- Forbered standard dyrkningsmedium. Til Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende høj glucose (25 mM), GlutaMax (4 mM), natriumpyruvat (1 mM) tilsættes 10% af standard føtalt kalveserum (FCS), penicillin (100 enheder / ml), streptomycin ( 100 pg / ml).
- Forberede transfektion medium. Til dyrkningsmedium uden penicillin-streptomycin tilsættes 25 pg / ml chloroquin (tilføj frisk på dagen for transfektion fra 1.000 x lagre i PBS, opbevaret ved -20 ° C).
- Forbered serumfrit dyrkningsmedium: Til serum-frit medium for HEK293-celler tilføje glutamin (4 mM), penicillin (100 enheder / ml), streptomycin (100 ug / ml), og 2,5 mg / l amphotericin B.
- Forberede de løsninger, der er beskrevet i tabel 2 og filter med et 0,45 um filter før brug:
- Udvidelse HEK293T celler
- Grow HEK293T celler i 20 ml kulture medium ved anvendelse 150 x 25 mm vævskulturskåle.
- Opdelte celler ved 80% konfluens (split-forhold på 1: 4, normalt hver 3. dag). Celler løst vedhæfte, de kan være mekanisk fritliggende uden trypsinbehandling ved fuldt pipettere op og ned.
- Plate celler natten før transfektion til opnåelse 60-70% konfluens på dagen for transfektion (podningsdensitet ~ 2 x 10 5 celler / ml). En sædvanlig præparat størrelse består af 20 til 25 dyrkningsskåle.
- Calcium-phosphat-transfektion
- 1 time før transfektion, ændre standard dyrkningsmedium til 20 ml transfektionsmedium. Nær slutningen af denne 1 times inkubation trin, blandes 400 ug plasmid-DNA med 10,95 ml Hedeselskabet 2 0 og 1,55 ml 2 M CaCl2 i 50 ml rør (1 rør / 5 retter).
- 1 til 2 minutter før transfektionen, tilsættes 12,5 ml 2x HBS til 12,5 ml DNA-Calcium-opløsning, bland ved inversion af rørene og inkuberes i 30 sekunder ved stuetemperatur.
- Tilføj the blanding fremstillet i 2.3.2 direkte til cellerne (5 ml pr skål), dråbevis i mediet. Drys jævnt over hele området, vender mediet til en lidt orange farve.
- Inkuber dyrkningsskålene for 7 til 11 timer i en vævskulturinkubator (37 ° C, 5% CO2 i befugtet luft). Efter inkubationen et fint bundfald er synlig. Fjern transfektion medium, skylles forsigtigt med forvarmet PBS og tilsættes 20 ml serumfrit dyrkningsmedium fremstillet i 2.1.3. Inkuberes i 72 timer i en vævskultur-inkubator.
- Analyser transfektion og ekspression effektivitet ved at køre en prøve (~ 20 pi) af cellesupernatanten på SDS-PAGE og farvning med Coomassie Brilliant Blue til visualisering en granzym band.
- Oprensning af Gzms fra kultur supernatanten ved nikkel-IMAC
- Efter inkubationen dekanteres cellekultursupernatanterne i 250 ml rør og klar ved centrifugering. Udfør en første tur (400 xg, 10 min, 4 °C), som vil fjerne mediet fra løsnede celler. Supernatanten overføres i friske 250 ml rør og centrifugering ved 4000 x g, 30 minutter ved 4 ° C for at fjerne eventuelt resterende celledebris.
- Der tilsættes 5 ml 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-base (pH 8) og 1 ml 0,25 M Niso 4 pr 250 ml klarede supernatant. Filtrere supernatanten under anvendelse af en 500 ml Vacuum filterenhed (0,45 mm).
- Ækvilibrere en nikkel-IMAC-søjle med His-bindende buffer A (10 søjlevolumener, CV) anvendelse af et egnet FPLC-system.
- Påfør den klarede supernatant til den ækvilibrerede søjle ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min ved 4 ° C.
- Efter at supernatanten blev påført, vaske søjlen med His-bindingsbuffer, indtil UV-absorbans baseline er nået (sædvanligvis 10 CV).
- Eluer Gzms med en lineær 20 ml-gradient (fra 0 til 250 mM imidazol) ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min under opsamling 2 ml-fraktioner. Analyser elueringsfraktionerne ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning.
- Enterokinase (EK)behandling og endelig oprydning ved kationbytningskromatografi
- Pool Gzm fraktioner i en dialyserende rør med ≤10 MWCO. Gemme en lille prøve ved -20 ° C som præ-EK kontrol.
- Tilføj EK på 0,02 enhed / 50 ml initial supernatant direkte til den poolede fraktion i dialyserøret og dialyseres O / N (mindst 16 timer) ved stuetemperatur i EK-puffer (4 L, ændre puffer en gang).
- Den næste dag, analysere EK behandlet Gzms i sammenligning med før-EK kontrol ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning.
- Når N-terminal behandlingen er færdig, ændre dialyse puffer til S puffer A (4 liter) og dialyseres i yderligere 4 timer ved stuetemperatur. Filter dialysat (0,45 um).
- Ækvilibrere en S-søjle med S buffer A. Læg prøven på søjlen med ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min ved 4 ° C.
- Efter prøve lastning, vaske søjlen med S buffer A, indtil UV-absorbans baseline er nået (ca. 10 CV). Elueres Gzms med en 30 ml lineær gradient (150 til 1.000 mM NaCl). GzmA elut på ~ 650 mM NaCl, GzmB på ~ 700 mM NaCl og GzmM på ~ 750 mM NaCl.
- Analyser elueringsfraktioner ved SDS-PAGE og kolorimetriske assays (se nedenfor). Pool fraktioner indeholdende Gzms og koncentrat (ca. 30 gange, til en koncentration på ca. 100 uM) i spin-filtre (15 ml, 10 MWCO). Alikvot de koncentrerede Gzm forberedelser og opbevares ved -80 ° C.
3. Test Gzm aktivitet
- Fremstilling af reagenser
- Forbered kolorimetrisk assay buffer: 50 mM Tris-Base, pH 7.
- Til måling af GzmA, tilsættes Na-CBZ-L-lysin thiobenzyl ester (S-Bzl) (BLT) til assaypufferen til en slutkoncentration på 0,2 mM og 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) til en koncentration på 0,22 mM. For GzmB, omfatter 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) og 0,22 mM DTNB. For GzmM, omfatter 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (pNA) (AAPL). Syntetiske peptider tilføjet fra passende stamopløsninger (i DMSO, Stored ved -20 ° C) til bufferen frisk før assayet.
- Forbered spaltning assaybuffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,5
- Forbered kolorimetrisk assay buffer: 50 mM Tris-Base, pH 7.
- Kolorimetriske assays
- Fordel små Gzm prøver (<5 pi) fra elueringsfraktioner eller koncentreret bestande i 96-brønds fladbundede plader. Omfatter en positiv kontrol (testet Gzm præparater eller rå NK cellelysater) og en negativ kontrol (kun buffer).
- Tilsættes 100 pi assaypuffer til hver brønd (med en multi-kanal pipette). Der inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C. Måle OD ved 405 nm i en mikropladelæser.
- Spaltningsbestemmelse
- For spaltningsprodukter assays under anvendelse af oprensede substrater, co-inkuberes et protein substrat (native eller rekombinant, 100-400 nM, et par eksempler på effektive Gzm substrater præsenteres i resultatet sektion og i noten i slutningen af dette afsnit) med seriefortyndinger af en Gzm (begyndende ved 400 nM) i assaypuffer i forskellige tidsrum.Analyser ved SDS-PAGE og Coomassie eller sølvfarvning; eller ved western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer.
- Til spaltning assays under anvendelse af cellelysater, suspendere 10 6 HeLa-celler (eller enhver tilgængelig tumor cellelinie) i 1 ml assaybuffer og lyserer ved frysning i en ethanol / tøris-bad og optøning ved 37 ° C tre gange. Fjerne cellerester ved centrifugering (15.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C).
- Co-inkubere det klarede lysat med Gzms ved forskellige koncentrationer og tidspunkter som ovenfor. Spaltning detekteres ved immunoblotting under anvendelse af egnede antistoffer.
BEMÆRK: Et par eksempler på bona fide substrater for hvilke kommercielle antistoffer er tilgængelige: Byd (BH3-interagerende domæne død agonist) og caspase 3 spaltes af GzmB 27,28; flere heterogene nukleare ribonucleoproteiner (hnRNPA1, A2 og U) spaltes af GzmA 29; cytomegalovirus phosphoprotein 71 af GzmM 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det følgende afsnit vil vi præsentere en komplet dokumentation af en GzmA forberedelse til at belyse metoden. Vi har også med succes renset GzmB og GzmM, der producerer lignende resultater med hensyn til rensning effektivitet og aktivitet. Men fra de senere præparater vil vi kun vise nogle få udvalgte stykker af data. GzmB præparater fra 293T-celler efter den nuværende protokol blev brugt i flere publicerede undersøgelser, der fremhæver deres virksomhed i forskellige biologiske analysesystemer 9,29,31-34.
En typisk GzmA oprensning er vist i figur 2A. Effektiv transfektion og udtryk efter 72 timer blev angivet med en påviselig Gzm band på en Coomassie-farvet SDS-PAGE-gel uden yderligere koncentration af kultursupernatanten (~ 37 kDa for GzmB og GzmM under reducerende forhold, ~ 60/34 kDa for GzmA under ikke-reducerende / reducerende betingelser). Efter IMAC oprensning blev prøverne behandlet med indtasteokinase (EK). En synlig forskydning af EK behandlede prøve (post-EK) i forhold til før-EK-kontrol blev observeret. Den endelige rensning på S-søjlen resulterede i meget ren Gzm præparater (GzmA i figur 2A; GzmB og GzmM i figur 2B) med et enkelt bånd udseende på Coomassie-farvede proteingeler. De samlede fraktioner blev koncentreret til en endelig koncentration på ~ 100 uM. Typisk vi opnåede udbytter af omkring 0,5 til 1 mg Gzms per 100 ml kultursupernatant. At demonstrere effektiv glycosylering, blev et par indledende præparater behandlet med Endoglycosidase (Endo) H, som fjerner oligosaccharider med højt mannoseindhold fra N-bundne glycoproteiner. Native GzmA har en N-bundet glycosyleringssted ved Asn-142, hvortil et oligosaccharid med højt mannoseindhold er bundet 35. EndoH behandling inducerede en indlysende mobilitet skift i Gzm A, samt GzmB, præparater fra HEK293T celler, men ikke i bakterielt frembragt GzmA som analyseret ved SDS-PAGE og Coomassiefarvning (figur 2C).
Rutinemæssigt blev hver Gzm batch testes for enzymatisk aktivitet i kolorimetriske assays. Denne hurtige og pålidelig test demonstrerer proteolytisk aktivitet af Gzms ved spaltning af små syntetiske peptider, der er angivet spektrofotometrisk ved en farveændring af assaypufferen. På grund af forskellige præferencer vedrørende de aminosyrerester (P1 position), hvorefter disse proteaser spalter, valget af et specifikt peptid varierer mellem Gzms. GzmA har trypsinlignende aktivitet, spaltning efter de basiske rester arginin (Arg, R) og lysin (Lys, K). GzmB spalter fortrinsvis efter asparaginsyrerester (Asp, D) og GzmM spalter efter leucin (Leu, L) og methionin (Met, M) 1. Vores fortrinsret peptid valg er BLT -S-Bzl at måle GzmA aktivitet AAD -S-Bzl for GzmB og AAPL -pNA for GzmM.
Den største forskel mellem thiobenzylester substrater (AAD og BLT) og p-nitroanilid substrat (AAPL) er den specifikke kemi, idet Gzm medierer kløvning af thiobenzylester substrater frigiver benzyl-mercaptan, som kun udløser en chromogen reaktion i sin efterfølgende reaktion med kromoforen DTNB. Derfor, i reaktions- stødpuder af thiobenzylester substrater DTNB skal være til stede, mens Gzm-medieret frigivelse af p-nitroanilid er tilstrækkelig til kolorimetrisk detektion. Den detaljerede fremgangsmåde til de kolorimetriske assays blev for nylig publiceret 36. Figur 3A viser den repræsentative BLT og AAPL esteraseaktivitet i elueringsfraktionerne fra S-søjle i en GzmA og GzmM forberedelse hhv. Kolorimetrisk assay blev også anvendt til at sammenligne aktiviteten af rekombinant native GzmB præparater. Som vist i figur 3B, rekombinant 293T GzmB spaltede chromogene substrat med samme effektivitet sammenlignet med nativ GzmB oprenset fra en human NK cell linje, som nyligt beskrevet 12.
For mere specifikt teste Gzm aktivitet, er Gzm spaltningsanalyser anvendelse af kendte proteinsubstrater angivet. Disse spaltningsprodukter assays kan udføres med renset rekombinant eller nativt protein (hvis det findes), med cellelysater eller de fleste fysiologiske med intakte celler. Hvis et protein-substrat er tilgængelig, kan proteolytisk aktivitet analyseres i simple co-inkubation eksperimenter med de Gzm præparater som dette påvises med det kendte bakterielle GzmA og GzmB substrater nuoCD og nuoF 9, samt med det hidtil ukendte humane mitokondriske GzmM substrat NDUFAF3 (figur 4A).
Cellelysater repræsentere en anden indlysende kilde til multiple Gzm substrater. Kommercielle antistoffer er tilgængelige mod mange af substraterne. En hurtig og enkel metode til at generere cellelysater er ved at anvende flere fryse / tø-cykler som tidligere påvist 33. Brugen af rengøringsmidler is ikke anbefales, da de kan forstyrre Gzm aktivitet. I figur 4B, GzmA medieret spaltning af hnRNPA1 i en HeLa-cellelysat demonstreres i et immunblot under anvendelse af et anti-hnRNPA1 antistof, såvel som et anti-Β-actin antistof som ladningskontrol.
For spaltningsprodukter analyser (eller cytotoksicitetsassays) i intakte celler, er det nødvendigt at tilgængeligheden af en ekstra levering molekyle (PFN eller Streptolysin O, SLO, for pattedyrceller, GNLY eller andre antimikrobielle peptider til prokaryote celler). Spaltningsanalyser i intakte celler er mest udfordrende som koncentrationen af leveringen molekyler er kritisk og kræver omfattende finjustering. Introduktion disse komplekse protokoller af apoptose analyser ligger uden for rammerne af dette papir. Her kan vi kun henvise til det store mængde litteratur, som eksempler 12,13.
<strong> Tabel 1: Gzm Kloning primersekvenser.
Primersekvenserne, der blev brugt til at klone GzmA, GzmB og GzmM er angivet. Fremadrettede primere blev designet til at introducere en EK websted før den N-terminale ende af aktiv protease (se figur 1)
Tabel 2: Lager Solutions og Buffer Kompositioner.
Opskrifterne for de vigtigste stamopløsninger og buffere er angivet.
Figur 1. pHLsec Sequence Kritisk for Construct Cloning.
I sekvensen, et par elementer i vektoren erfremhævet som er vigtige for kloning, sekretion, IMAC oprensning og aktivering af proteaserne: Kozak konsensus og sekretion signalsekvenser, de Agel- og KpnI restriktionssites, såvel som den C-terminale Lys_6xHis tag. Vi eksemplificeret GzmA som indsatsen, der er N-terminalt fusioneret til et enterokinase (EK) site. For hele kortet af det komplette vektor rygraden, henviser vi til de supplerende oplysninger i 23.
Figur 2. Udtryk, Rensning og Aktivering af Fuldt Glycosylerede Menneskelige Gzms fra HEK 293 T-celler.
A) viser en serie af Coomassie-farvet, ikke-reducerende SDS-PAGE geler demonstrerer hele GzmA produktionsprocessen fra dets sekretion i supernatanten først Nikkel-IMAC oprensning, EK behandling og fina l polering via kationbytningskromatografi. Kultursupernatanten blev kørt på SDS-PAGE under reducerende (rød) og ikke-reducerende (ikke-rød) betingelser. GzmA er en homodimer (ssGzmA), der er stabiliseret med en disulfidbinding. Den GzmA homodimer (~ 60 kDa) løber tæt kontaminerende BSA (~ 66 kDa). Under reducerende betingelser i GzmA monomer (shGzmA) vises som en ~ 34 kDa bånd. For at demonstrere renhed af det færdige GzmB og GzmM præparater repræsentativt Coomassie-farvede geler under ikke-reducerende betingelser er vist i B. Bakterielt (E. coli), der genereres GzmA samt GzmA og GzmB produceret i HEK293T celler blev behandlet med EndoH og analyseret ved ikke-reducerende SDS-PAGE og Coomassie-farvning. Glycosylering af Gzms produceret i HEK293T celler påvises ved en mobilitetsskift efter EndoH behandling sammenlignet med ikke-glycosyleret GzmA produceret i bakterier (C).
ig3.jpg "/>
Figur 3. Rekombinant Gzms hydrolyserer Syntetiske peptider.
A) blev små prøver af elueringsfraktionerne fra sidste S-søjle testet for GzmA og GzmM aktivitet i kromogene assays under anvendelse BLT og AAPL henholdsvis som substrater. Grafer viser peptidspaltning, der blev angivet som en OD stigning ved 405 nm. Aktivitetstoppen fraktioner korrelerede med proteinet top i elueringen som angivet i UV-absorbans og SDS-PAGE analyse (figur 2A og B). B), rekombinant 293T og nativ GzmB (fremstillet som beskrevet 12) ved angivne koncentrationer blev inkuberet i nærvær af det kromogene substrat ALD. GzmB aktivitet blev angivet som en OD ved 405 nm. Grafen viser middelværdien ± SEM af vores seneste Gzm præparater, der blev testet i triplikater.
52.911 / 52911fig4.jpg "/>
Figur 4. Rekombinant Gzms Cleave proteinsubstrater.
A) Rekombinante GST-mærket, bakterielle respiratoriske kæde proteiner nuoCD og nuoF samt det mammale respiratoriske kæde protein NDUFAF3, blev behandlet med angivne koncentration af angivne Gzms i 15 minutter ved 37 ° C. 1 ug af oprensede proteiner i 20 reaktioner pi blev anvendt. Spaltning blev analyseret ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning. B) HeLa-cellelysat (ved en proteinkoncentration på ~ 1 mg / ml) blev inkuberet med angivne koncentrationer af rekombinant GzmA i 30 minutter og analyseret ved immunoblotting ved anvendelse af anti hnRNPA1 og Β-actin antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det klassiske og omfattende undersøgt rolle GzmA og GzmB er induktionen af apoptose i mammale celler efter deres cytosolisk levering af det poredannende protein PFN 1. For nylig blev den cytotoksiske spektrum af Gzms udvidet betydeligt fra mammale celler for bakterier 9,10, samt til visse parasitter 11. Endvidere er de ikke-klassiske, ekstracellulære funktioner GzmA og GzmB samt den biologiske betydning af de forskellige sjældne Gzms er stadig uklar. Derfor er en robust tids- og omkostningseffektiv ekspression og oprensning ordningen for Gzms, som oplyst af denne protokol, vil være til stor hjælp for disse fremtidige studier.
Styrken ved denne metode er særligt baseret på ekspressionsvektoren, pHLsec 23, som anvendes i dette system. Dette plasmid har et højt kopital i E. coli, således at en effektiv DNA-produktion. Dens enhancer / promotorelementer giverstærkeste aktivitet i forskellige cellelinier 24. Den indeholder en intron inden transkriptionsenheden. Introner har vist sig at forbedre genekspression i pattedyrceller op til 100 gange 37. Desuden plasmidet indeholder en Kozak-konsensus og en optimeret sekretionssignal, en Lys-6xHis-tag og en poly-A-signal (figur 1). Inserts kan klones ved hjælp af Agel- og KpnI sites mellem sekretionssignal og Lys-6xHis tag. Anvendelse af Agel og Xhol vil undgå polyHis tag. For Gzms, var det nødvendigt at indsætte et enterokinase site ved N-terminalen af proteaserne muliggør aktivering af proteaserne efter ekspression og oprensning IMAC. Til ekspression af andre enzymer dette måske ikke nødvendigt. Ekspressionsplasmidet succes testet for flere konstruktioner af forskellige længder, glycosyleringstilstande samt antallet af disulfidbindinger, samt for proteiner, som indeholdt flere domæner med forskellige folder 23.
38. Vi fandt, at transfektionseffektivitet var lineært afhængige af DNA beløb mætte kun på omkring 80 ug til 15 cm skål (upubliceret observation). Derfor anbefaler vi at bruge op til 80 μ g plasmid-DNA / skål i denne protokol for maksimal effektivitet. Dette vil svare til ca. 2 mg DNA pr forberedelse (corresponding til 2 Maxiprep søjler). Transfektionseffektiviteten var mest let overvåges ved at køre en prøve af kultursupernatant (ca. 20 μ l) på SDS-PAGE efter 72 timers inkubationsperiode. Et protein bånd med den secernerede protease skal være synlig ved Coomassie-farvning. Hvis Gzm bånd var svag og cellerne ikke løsnes og optrådte levedygtig blev kulturerne inkuberet i yderligere 24 timer før IMAC oprensning.
En anden mest kritiske trin var enterokinase (EK) behandling som aktiverer enzymet. EK aktivitet er calciumafhængig, og inhiberes af høje koncentrationer af NaCl 39 eller imidazol (upubliceret observation). Derfor var det afgørende at dialysere eluatet fra IMAC mod et tilstrækkeligt volumen (20 ml eluat per 2 liter dialysebuffer), i EK puffer indeholdende lidt kalk og ikke over 50 mM NaCl ved neutral pH. EK behandling anbefales i 16 timer ved stuetemperatur, og bør overvåges ved hjælp af SDS-PAGE, som afslørede en mobilitetsskift of den behandlede protease hvis spaltningen var fuldstændig. Frisk EK blev tilsat, og inkubering i frisk EK Dialyse puffer fortsattes hvis skiftet var ufuldstændig. Kun hvis spaltningen var fuldstændig, dialyse mod S puffer A blev startet og oprensning fortsat. Den katalytiske lette kæde af EK har en pi-værdi på 5,2, hvilket tillader fuldstændig adskillelse af EK fra Gzms i den endelige kationbytningskromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C.
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
