Introduction
Gzms özel CTL lizozomlar ve NK hücrelerinin 1 lokalize yüksek ölçüde homolog serin proteaz ailesidir. Bu katil hücreler ve sitotoksik zerreler, aynı zamanda ortadan kaldırılması 2,3 için olan bir hedef hücrenin tanınması üzerine Gzms ile eşzamanlı olarak serbest bırakılır membran kesintiye proteinleri PFN ve GNLY içerir. (- G, K, M ve N GzmA), insanlarda (GzmA, B, H, K ve M,), beş Gzms ve farelerde 10 Gzms vardır. GzmA ve GzmB en bol ve yaygın insan ve farelerde 1 çalışılmıştır bulunmaktadır. Ancak, daha yeni çalışmalar hücre ölümü yollar yanı sıra sağlık ve hastalık 4 diğer, sözde yetim Gzms aracılık ettiği ek biyolojik etkilerini araştırmak başladı.
PFN 5,6 hedef hücrelere verilebilir olduğunda Gzms en iyi bilinen işlevi, GzmA ve GzmB, özellikle de memeli hücrelerinde programlanmış hücre ölümü meydana gelmesidir. AncakDaha yeni çalışmalar da PFN 7,8 bağımsız Sitozolik teslimat, bağışıklık düzenleme ve inflamasyon üzerinde derin etkisi olan Gzms dışı etkilerini göstermiştir. Gzms sitozolik girmesinden sonra verimli öldürüldüğü hücrelerin spektrumu yakın zamanda bakterilerin 9,10 ve hatta bazı parazitler 11 memeli hücrelerinden genişletilmiştir. Bu yeni keşifler Gzm araştırmacılar için yepyeni bir alan açtı. Bu nedenle, maliyet-etkin, yüksek verim memeli sentezleme sistemi önemli ölçüde o gelecek çalışmalar için yol kolaylaştıracaktır.
Ana insan, fare ve sıçan Gzms başarılı bir CTL ve NK hücre hatları 12-14 granül fraksiyonundan saflaştırılmıştır. Bununla birlikte, elimizdeki tür saflaştırma tekniklerinin verimi daha az, 0.1 mg / L hücre kültürü (yayınlanmamış gözlem ve 12) aralığındadır. Bundan başka, tasarımlarıyla ile kirlenme olmadan, tek bir GZM kromatografik çözünürlüğür Gzms ve / veya granül halinde de mevcut proteinler (yayınlanmamış veriler ve 12,14) meydan okuyor. Rekombinant Gzms hatta HEK 293 18,19 gibi memeli hücrelerinde bakteriler 15, maya 16, böcek hücreleri 17 ve üretildi. Sadece, memeli ekspresyon sistemleri nativ sitotoksik protein aynı translasyon sonrası modifikasyonlar ile, rekombinan enzimler meydana potansiyeli taşımaktadır. Posttranslasyonel değişiklikler endositoz belirli alımı ve hedef hücrelerin 20-22 içinde proteaz hücre içi lokalizasyonu ile suçlanmıştır. Bu nedenle, pHLsec 23 kullanılarak Gzm ifade plazmid omurgası olarak (Radu Aricescu ve Yvonne Jones, Oxford, UK Üniversitesi bir tür hediye), biz yüksek verim protein üretimi için basit, zaman ve maliyet-etkin bir sistem kurdu HEK293T hücreleri. pHLsec tavuk Β-aktin promoteri ile bir CMV artırıcı birleştirir; Birlikte, bu elemanlar gösterilerted çeşitli hücre hatlarında 24 güçlü promotör aktivitesi. Buna ek olarak, plazmid, bir tavşan Β-globin intronu, optimize edilmiş bir Kozak ve sekresyon sinyalleri, bir Lys-6xHis-tag ve bir poli-A sinyali içerir. Uçlar sekresyon sinyali ve uygun N-terminal etki alanları yoksun proteinler için uygun bir ifade ve sekresyon etkinliğin sağlanması Lys-6xHis etiketi (Şekil 1) arasında uygun bir klonlanabilir. Gzms ekspresyonu sağlamak için, böylece EK tedavisi salgılanan Gzms (aktif Gzms N-terminali ile başlayan aktive bir enterokinaz (EK) Alanı (DDDDK) ve ardından vektör tarafından sağlanan salgılama sinyal ile endojen salgılama sinyal dizisi yerine amino asit sekansı IIGG 25). Buna ek olarak, bu yöntem için lehine HEK293T hücreleri, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) gibi düşük fiyatlı bir ortam içinde hızlı bir şekilde büyümesi ve maliyet-etkin bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi için de uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sentezleme plasmidi pHLsec-Gzm 1. Üretim
- Insan NK hücrelerinden manufacturer` izlenerek uygun bir RNA izolasyon yöntemi ile ve bir birinci tür cDNA sentez kiti kullanılarak ters transkribe (26 ya da beş, insan Gzms ifade NK hücre hattı NK-92 gibi hazırlanmıştır birincil hücreler) ve toplam RNA'nın hazırlanması s önerileri. 23 (Radu Aricescu Yvonne Jones, Oxford Üniversitesi, İngiltere tür bir hediye) 'de tarif edildiği gibi Gzm cDNA Agel ve Kpnl sitesi (Şekil 1) kullanılarak pHLsec PCR ve klon kullanılarak yükseltin.
Not: Tablo 1 'de gösterilen aşağıdaki primerler kullanın. - Dizileme ile doğru ekler onaylayın. DH5α hücrelerinde ifade plasmidlerini genişletin ve bir endotoksin içermeyen plazmid izolasyon kiti kullanılarak arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun.
- Unti -20 ° C 'de 2 mg / ml ve saklamak bir konsantrasyonda endotoksin içermeyen, steril su içinde yeniden süspanse edilen saflaştırılmış plasmidler,l kullanımı.
HEK293T hücrelerinde Gzms 2. İfade
- Reaktiflerin hazırlanması
- Standart kültür ortamı hazırlayın. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içeren, yüksek glikoz (25 mM), Glutamax (4 mM), sodyum piruvat (1 mM) (standart fetal buzağı serumu (FCS), penisilin (100 birim / ml), streptomisin ve% 10 ilave 100 ug / ml).
- Transfeksiyon ortamı hazırlayın. Penisilin-Streptomisin olmayan kültür ortamına 25 ug / ml miktarında klorokuin katılımının (-20 ° C'de saklanan PBS 1,000x hisse senetleri, gelen transfeksiyon gününde taze olarak ilave) ekleyin.
- Serumsuz kültür ortamı hazırlayın: serumsuz ortam için HEK293 hücreleri glutamin (4 mM), penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve 2,5 mg / L amfoterisin B add
- Kullanmadan önce, bir 0.45 um filtre ile Tablo 2 ve filtre açıklanan çözümler hazırlayın:
- HEK293T hücreleri genişletme
- 20 ml kült HEK293T hücreleri büyütün150 x 25 mm doku kültürü yemekleri kullanarak ure orta.
- % 80 confluency Split hücreleri (1 split oranı: 4, genellikle her 3. gün). Hücreler gevşek mekanik olarak titizlikle yukarı ve aşağı pipetleme tripsinleme olmadan ayrılabilir, ekleyin.
- Levha hücreleri, transfeksiyondan önceki gece transfeksiyonu (tohum ekme yoğunluğu ~ 2 x 10 5 hücre / ml) günde% 60-70 konfluense elde edildi. Bir zamanki hazırlık boyutu 20-25 kültür kaplarına oluşmaktadır.
- Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu
- Transfeksiyondan önce 1 saat, 20 ml transfeksiyon ortamı, standart kültür ortamı değiştirin. Bu 1 saat inkübasyon aşamasının sonuna doğru, 10.95 mi GKD 2 0 ve 50 ml tüpler içinde 2M CaCl2 1.55 ml (1 tüp / 5 yemekler) ile plazmid DNA, 400 ug karıştırın.
- 1 transfeksiyondan önce, en az 2, DNA-kalsiyum çözeltisinin 12.5 ml 12.5 mi 2x HBS ekleyin tüpler ters çevirme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edilir.
- Th ekleE karışımı doğrudan hücreleri (tabak başına 5 mi), damla damla ortama 2.3.2 hazırlandı. Biraz turuncu renk orta dönüm tüm alana eşit serpin.
- Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 7-11 saat (37 ° C,% 5 nemlendirilmiş hava içinde CO2) için kültür kaplarına inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ince bir çökelti görülebilir. Önceden ısıtılmış PBS ile dikkatle yıkayın, transfeksiyon Ortamı çıkarın ve 2.1.3 hazırlanmış 20 mi serumsuz kültür ortamı ilave edin. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 72 saat süreyle inkübe edilir.
- SDS-PAGE üzerinde hücre yüzer bir numunesi (~ 20 ul) çalışan ve bir granzim bant görselleştirmek için Coomassie Brillant Blue ile soylara ile transfeksiyonu ve ekspresyonudur etkinliğini analiz edin.
- Nikel IMAC ile kültür süpernatanından Gzms saflaştırılması
- Kuluçkadan sonra, 250 ml tüpler içine hücre kültürü süpernatanları süzün ve santrifüj ile temiz. İlk bir spin yürütmek (400 xg, 10 dak, 4 °Müstakil hücrelerden orta silinir C). Kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için 4 ° C sıcaklıkta 4000 x g'de, 30 dakika taze 250 ml tüpler ve spin süpernatant aktarın.
- 5 M NaCl 5 mi, temizlenmiş süpernatan, 250 ml başına 0.25 M N'nin 4 6,25 2 M Tris-Base (pH 8) içinde çözdürülür ve 1 ml ilave edilir. 500 ml Vakum filtre ünitesi (0.45 mm) kullanılarak süpernatant süzün.
- Uygun bir FPLC sistemi kullanılarak His-bağlama tamponu A (10 kolon hacim, CV) bir nikel-IMAC sütunu dengelenmesi.
- 4 ° C de, 0.5 ml / dk'lık bir akış oranında dengelenen kolona süpernatant uygulanır.
- Süpernatan tatbik edilmesinden sonra UV emilimi temel (genellikle 10 CV) ulaşana kadar, His-bağlama tamponu ile kolondan yıkanır.
- Elute Gzms 0.5 ml bir akış hızında doğrusal bir 20 ml'lik gradyanı (0-250 mM imidazol) ile 2 ml / dakika-fraksiyonlar toplanırken. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile elüsyon fraksiyonları analiz edin.
- Enterokinaz (EK)işleme ve katyon değişim kromatografisi ile son temizlik
- ≤10 MWCO bir dializ tüpü içinde kısımlar içeren havuz Gzm. Ön-EK kontrol olarak -20 ° C'de küçük bir örnek saklayın.
- Diyaliz tüpü içinde doğrudan toplanmış fraksiyonuna 0.02 birim / ilk süpernatan 50 ml EK ekleyin ve O / N EK-tampon maddesi içinde oda sıcaklığında (en az 16 saat) (4 L, bir kez değiştirme tamponu) diyaliz.
- Ertesi gün, EK, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile ön-EK kontrol ile karşılaştırıldığında Gzms tedavi analiz eder.
- N-terminal işlem tamamlandığında, bir (4 L) tampon S diyaliz tamponu değiştirmek ve oda sıcaklığında bir 4 saat diyaliz. Filtre diyalizat (0.45 mikron).
- 4 ° C de, 0.5 ml / dk'lık bir akış oranında sütunun üzerinde örnek kuvveti S tampon maddesi A ile S-sütunu dengelenmesi.
- UV absorbans taban (10 CV) ulaşılana kadar numunesi yüklemesinden sonra, S tampon A ile bir sütun yıkayın. 30 mi lineer gradyan (150 ila 1000 mM NaCI) ile Gzms yıkayın. GzmA E~ 750 mM NaCl'de ~ 700 mM NaCI ve GzmM de ~ 650 mM NaCI, GzmB de dolgu maddeleri.
- SDS-PAGE ve kolorimetrik analizler (aşağıya bakınız) ile elüsyon fraksiyonları analiz edin. Gzms ve konsantre içeren havuz kısımlar (yaklaşık 30 kat, 100 uM bir konsantrasyona kadar), eğirme filtresi (15 mi, 10 MWCO). -80 ° C 'de konsantre edilir Gzm preparatlar ve mağaza kısım.
3. Test Gzm etkinliği
- Reaktiflerin hazırlanması
- 50 mM Tris-Base, pH 7: kolorimetrik deney tamponu hazırlayın.
- GzmA ölçülmesi için, 0.2 mM ve 5,5'-ditiyo-bis (2-nitrobenzoik asit) 'in bir nihai konsantrasyona kadar deney tamponu Na-CBZ-L-lisin tiyobenzil ester (S-Bzl) (BLT) ekleyin 0.22 mM bir konsantrasyona kadar (DTNB). GzmB için, 0.2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) ve 0.22 mM DTNB bulunmaktadır. GzmM için, 0.2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (pNA) (AAPL) içerir. Sentetik peptidler DMSO içinde (uygun ana çözeltilerden ilave edilmiştir, stored taze tahlil önce tampon -20 ° C).
- Klivaj deneyi tamponu hazırlayın: 100 mM NaCI, 50 mM Tris-baz, pH 7.5
- 50 mM Tris-Base, pH 7: kolorimetrik deney tamponu hazırlayın.
- Kolorimetrik analizler
- 96-gözlü düz dipli plakalarda elüsyon fraksiyonları küçük Gzm örnekleri (<5 ul) veya konsantre stok dağıtın. Bir pozitif kontrol (test edilen Gzm müstahzarlar ya da ham olarak NK hücre lizatları) ve bir negatif kontrol (sadece tampon) içerir.
- (Bir çok kanallı pipet kullanarak) her bir oyuğa, deney tamponu içinde 100 ul ekle. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin. Mikroplaka okuyucu içinde 405 nm'de OD'yi ölçün.
- Klivaj deneyi
- Seri seyreltme ile; - saflaştırılmış maddeleri kullanarak bölünme tahlilleri için, (verimli Gzm yüzeylerde birkaç örnek bu bölümün sonundaki sonuç bölümünde ve notta sunulmuştur 400 nM doğal veya rekombinant, 100) bir protein substrat ko-inkübe Bir GZM çeşitli kez deney tamponu (400 nM'de başlayarak).SDS-PAGE ve Coomassie ya da gümüş lekeleme ile analiz; ya da Batı spesifik antikorlar kullanılarak kurutma.
- Hücre lizatları kullanılarak klivaj deneyleri için, 37 ° C olmak üzere üç kez, bir etanol / kuru buz banyosunda ve eritme dondurma ile deney tamponu ve parçalanmasıyla, 1 ml, 10 6 HeLa hücreleri (ya da herhangi bir uygun tümör hücre hattı) askıya. (4 ° C'de 10 dakika boyunca 15,000 x g) santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır.
- Yukarıdaki gibi çeşitli konsantrasyonlarda ve zaman zaman Gzms ile temizlenir lizat Co-kuluçkaya yatmaktadır. Yarılma uygun antikorlar kullanılarak imünolekeleme ile tespit edilir.
Not: iyi niyetli alt tabakalar bir kaç örnekleri ticari antikorlar mevcuttur: Teklif (BH3 etkileşen etki ölüm agonisti) ve GzmB 27,28 parçalanabilen kaspaz 3; GzmA 29 ile parçalanabilen çok heterojen bir çekirdek ribonükleoprotein (hnRNPA1, A2 ve U); GzmM 30 ile sitomegalovirüs phosphoprotein 71.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıdaki bölümde yöntemi aydınlatmak için bir GzmA hazırlık tam bir dokümantasyon sunacak. Ayrıca başarılı saflaştırma etkinliği ve aktivitesi ile ilgili olarak benzer sonuçlar üreten GzmB ve GzmM saflaştırılmıştır. Ancak, bu daha sonraki hazırlıkları sadece verilerin birkaç seçilmiş parçaları gösterecektir. Mevcut protokolü takip eden 293T hücrelerinden elde GzmB preparatları çeşitli biyolojik deney sistemlerinde 9,29,31-34 etkinliklerini vurgulayarak Yayınlanmış bir kaç çalışma kullanılmıştır.
Tipik GzmA saflaştırma Şekil 2A'da gösterilmiştir. ~ GzmA için 60/34 kDa altında, 72 saat indirgeme koşulları altında kültür üst GzmB ve GzmM için (~ 37 kDa bir daha konsantrasyon olmadan bir Coomassie boyalı SDS-PAGE jeli üzerinde bir bulgulanabilir Gzm bant ile belirtilmiştir verimli transfeksiyon ve ifade sonra ) indirgeyici koşullar / indirgeyici olmayan. IMAC saflaştırmadan sonra numuneler butonu ile muamele edildiokinase (EK). EK A görünür vardiya örneği (post-EK) öncesi EK kontrol ile karşılaştırıldığında gözlendi tedavi. Coomassie boyalı bir protein jeli üzerinde tek bir bant görünümü ile, S-kolonu üzerinde yapılan son saflaştırma son derece saf Gzm preparatları (Şekil 2B'de GzmB ve GzmM Şekil 2A GzmA) ile sonuçlanmıştır. Bir araya toplanan fraksiyonlar ~ 100 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere konsantre edilir. Tipik haliyle, 100 ml kültür süpernatan başına 0,5-1 mg Gzms verimlerini elde edilmiştir. Etkin glikosilasyon göstermek için, bir kaç ön hazırlık N-bağlantılı glikoproteinlerin yüksek manoz oligosakaritler kaldırır endoglikosidaz (Endo) H ile muamele edildi. Ana GzmA bir yüksek mannoz oligosakarit 35 bağlı olduğu, Asn-142 de, bir N-bağlantılı glikosilasyon sitesi vardır. EndoH tedavisi belirgin bir hareket Gzm A kayma, hem de GzmB, HEK293T hücrelerinden preparatlar uyarılır fakat SDS-PAGE ve Coomassie ile analiz edildiği bakteriyel GzmA oluşturulan bölgesindekiboyama (Şekil 2C).
Rutin olarak, her Gzm toplu kolorimetrik analizler enzimatik aktivitesi için test edilmiştir. Bu, hızlı ve güvenilir bir test deney tamponu bir renk değişikliği ile spektrofotometrik olarak belirtilir, küçük sentetik peptitler yarılmasıyla Gzms proteolitik aktivitesini göstermektedir. Nedeniyle, bu proteazlar bölen sonra, amino asit artıklarının (P1 konumu) üzerinde farklı tercihlere, belirli bir peptidin bir seçim Gzms arasında farklılık gösterir. Bazik kalıntılar (Arg, R) ve lisin (Lys, K) arginin sonra GzmA yaran, tripsin-benzeri aktiviteye sahiptir. Tercihen aspartik asit kalıntısı (Asp, D) sonra GzmB böler ve GzmM böler lösin (Leu, L) ve metionin (Met, M) 1. Bizim öncelikli peptid seçim GzmA aktivitesini ölçmek için BLT -S-Bzl olduğunu GzmM için GzmB ve AAPL -pNA için AAD -S-Bzl.
thiob arasındaki en önemli farkbu Gzm thiobenzylester alt-tabakaların ayrılması yalnızca kromoforu DTNB ile alt baş reaksiyonda bir kromojenik reaksiyon tetikler benzil-merkaptan, açıklamaları aracılık içinde enzylester substratlar (AAD ve blt) ve p-nitroanilid alt-tabaka (AAPL), belirli bir kimyadır. P-nitroanilit Gzm aracılı salma kolorimetrik tespiti için yeterli iken, Bu nedenle, thiobenzylester substratların Reaksiyon tamponlar DTNB, mevcut olması gerekmektedir. kolorimetrik analizler detaylı bir yöntem en son yayınlanan 36. Şekil 3A, sırasıyla bir GzmA ve GzmM hazırlama S-sütunundan elüsyon fraksiyonlarında Örnek blt ve AAPL esteraz etkinliği göstermektedir. Kolorimetrik Tahlil, aynı zamanda nativ GzmB preparatlarına rekombinant aktivitesini karşılaştırmak için kullanıldı. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, rekombinant 293T GzmB bir insan NK cel saflaştırılmış doğal GzmB kıyasla benzer bir verim ile kromojenik alt tabaka ayrıldıl hattı olarak son zamanlarda 12'ye nitelendirdi.
Daha özel olarak ise Gzm aktivitesini test etmek için, bilinen bir protein substratlar kullanılarak Gzm klivaj deneyleri gösterilir. Bu parçalanma deneyleri, hücre lizatları ile, (eğer varsa) saflaştırılmış rekombinant ya da nativ protein ile veya bozulmamış hücreler ile en fizyolojik edilebilir. Bir protein alt-tabaka mevcut ise, proteolitik aktivite, bu bilinen bakteriyel GzmA ile gösterilen ve GzmB yanı sıra yeni insan mitokondriyal GzmM alt-tabaka NDUFAF3 ile nuoCD ve nuoF 9, alt tabakalar olarak Gzm preparatları ile basit bir ko-inkubasyon deneyleri analiz edilebilir (Şekil 4A).
Hücre lisatları birden Gzm yüzeylerde başka bariz bir kaynak oluşturmaktadır. Ticari antikorlar yüzeylerde birçok karşı kullanılabilir. Hücre lizatları oluşturmak için hızlı ve basit bir yöntem daha önce 33 gösterildiği gibi birden donma / çözülme döngüleri uygulayarak gereğidir. deterjanlar i kullanımıOnlar Gzm aktivitesine müdahale gibi tavsiye edilmez s. Şekil 4B'de, GzmA bir anti-hnRNPA1 antikoru, hem de yükleme kontrolü olarak bir anti-Β-aktin antikor kullanılarak bir immunoblotun gösterilmiştir bir HeLa hücre lizatında hnRNPA1 bölünmesini aracılı.
Sağlam hücrelerde parçalanma deneyleri (veya sitotoksisite deneyleri), ek bir dağıtım molekülünün bulunması gereklidir (PFN veya memeli hücreleri için streptolizin O, SLO; GNLY veya prokaryotik hücreler için diğer antimikrobiyal peptitler). Teslimat moleküllerinin konsantrasyonu kritik ve kapsamlı ince ayar ihtiyacı olarak sağlam hücreler bölünme deneyleri en zorlu bulunmaktadır. Apoptoz tahliller bu karmaşık protokolleri Tanıtımı Bu yazının kapsamı dışındadır. Burada, biz sadece örnekler 12,13 olarak, edebiyatın geniş gövdesine başvurabilir.
<strong> Tablo 1: Gzm Klonlama Primer Dizileri.
GzmA, GzmB ve GzmM klonlamak için kullanılan primer sekansları gösterilir. İleri primerler aktif proteaza N-terminalinde önce EK mevkisinin katılması için tasarlanmıştır (bakınız Şekil 1)
Tablo 2: Stok Çözeltiler ve Tampon kompozisyonlar.
En önemli stok çözümleri ve tamponların tarifleri belirtilmiştir.
Şekil 1. yapısını klonlamak için kritik pHLsec Dizisi.
Dizisinde, vektörde bir kaç elemanlardırproteazlar klonlanması, sekresyon IMAC saflaştırma ve aktivasyonu için önemli olduğu vurgulanır: Kozak konsensüs ve sekresyon sinyal sekansları, Agel ve Kpnl kısıtlama bölgeleri, hem de C-terminali Lys_6xHis etiket. Biz N-terminal bir enterokinaz (EK) siteye kaynaşmış olan insert olarak GzmA örneklenmiştir. Tam vektör omurgasının tam haritası için, 23'ünde ek bilgilere bakınız.
Şekil 2,. HEK 293 T Hücreleri Anlatım, saflaştırılması ve Tam Glikosile İnsan Gzms aktivasyonu.
A) bir dizi gösteren Coomassie-lekelenmiş, indirgeyici olmayan birinci Nikel IMAC saflaştırma, EK tedavisi ve Fina süpernatant içindeki salgılanması ile ilgili bütün GzmA üretim sürecini gösteren SDS-PAGE jellerinin katyon değişim kromatografisi ile l parlatma. Kültür yüzer madde (kırmızı) ve indirgeyici olmayan (non-kırmızı) indirgeyici koşullar altında SDS-PAGE üzerinde çalıştırıldı. GzmA bir disülfid bağı ile stabilize edilir bir homodimer (ssGzmA) 'dir. GzmA homodimer (~ 60 kDa) BSA (~ 66 kDa) kirletici yakın çalışır. Indirgeyici koşullar altında GzmA monomer (shGzmA) bir p 34 kDa bandı olarak görünür. Indirgeyici olmayan koşullar altında son GzmB ve GzmM preparatların saflığı göstermek için, Örnek Coomassie boyanmış jeller B. bakteriyel (E. coli) gösterilmiştir GzmA da GzmA ve GzmB HEK293T hücrelerinde üretilen EndoH ile muamele edilmiş ve analiz edilmiştir oluşturulan SDS-PAGE ve Coomassie boyama olmayan azaltarak. Bakteriler (C) 'de üretilen glikosile GzmA kıyasla HEK293T hücrelerinde üretilen Gzms glikosilasyonu EndoH tedaviden sonra bir hareketlilik kayması ile ortaya konmuştur.
ig3.jpg "/>
Şekil 3. Rekombinant Gzms hidrolize sentetik peptitler.
A), son S sütunundan elüsyon fraksiyonlarının küçük örnekler alt-tabakalar olarak sırasıyla blt ve AAPL kullanılarak Kromojenik deneylerde GzmA ve GzmM aktivitesi için test edildi. Grafikler 405 nm'de OD artışı olarak ifade edilmiştir peptid bölünmesini göstermektedir. UV absorbansı ve SDS-PAGE analizi (Şekil 2A ve B) 'de gösterildiği gibi, elüsyon protein tepe noktası ile bağlantılı faaliyet pik fraksiyonlar. Belirtilen konsantrasyonlarda) 'de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 12 B), yeniden birleştirici 293T ve yerli GzmB (kromojenik substrat asit varlığında inkübe edildi. GzmB aktivitesi 405 nm'de OD değişiklik olarak belirtilmiştir. Grafik üç kez test edilmiştir, en son Gzm preparatlar ortalama ± SEM gösterilir.
52911 / 52911fig4.jpg "/>
4. Rekombinant Gzms Ayrılma ve protein maddelerinin Şekil.
A) Rekombinant GST-etiketli, bakteriyel solunum zinciri proteinleri nuoCD ve nuoF yanı sıra, bir memeli solunum zincir proteini NDUFAF3, 37 ° C'de 15 dakika boyunca belirtilen Gzms konsantrasyonu ile muamele edilmiştir. 20 ul reaksiyonlarda saflaştırılmış proteinlerin 1 ug kullanıldı. Yarılma SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilmiştir. B) yaklaşık 1 mg / ml'lik bir protein konsantrasyonunda HeLa hücre lisatı (), anti hnRNPA1 ve Β-aktin antikor kullanılarak imünolekeleme ile 30 dakika boyunca yeniden birleştirici GzmA belirtilen konsantrasyonları ile inkübe edildi ve analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GzmA ve GzmB klasik ve yaygın olarak çalışılan bir rol gözenek oluşturucu protein PFN 1 kendi sitosolik doğumdan sonra memeli hücrelerinde apoptosisin olduğu. Son zamanlarda, Gzms sitotoksik spektrumu bakteri 9,10, ve de bazı parazitler 11 için memeli hücrelerinden önemli ölçüde genişletildi. Ayrıca, GzmA ve GzmB olmayan klasik, hücre dışı fonksiyonları yanı sıra çeşitli yetim Gzms biyolojik önemi hala karanlıktır. Bu protokol tarafından sağlanan nedenle, Gzms sağlam zaman ve maliyet-etkin anlatım ve arıtma sistemi, bu gelecek çalışmalar için büyük yardım olacaktır.
Bu yöntemin mukavemeti, özellikle bu sistemde kullanılan ekspresyon vektörü, pHLsec 23 dayanır. Bu plazmid, E. yüksek kopya sayısında var E. coli, ve böylece etkili bir DNA üretilmesi sağlanır. Bu güçlendirici / promotör elemanları teminÇeşitli hücre çizgileri 24 güçlü aktivitesi. Bu transkripsiyon birimi olan bir intron içerir. İntronlar kadar Memeli hücrelerinde gen ekspresyonunu arttırmak için bulunmuştur 37 100 kat. Buna ek olarak, plazmid, bir konsensüs Kozak ve optimize edilmiş bir salgılama sinyalini, bir Lys-6xHis-tag ve bir poli-bir sinyal (Şekil 1) içerir. Uçlar sekresyon sinyali ve Lys-6xHis etiketi arasında Agel ve Kpnl sitesi kullanılarak klonlanabilir. Agel ve XhoI kullanma poliHis etiketi önlemek olacaktır. Gzms için, ifade ve saflaştırma işleminden sonra IMAC proteazların aktivitesini sağlayan proteazlann N-ucunda bir enterokinaz merkezi ilave edilmesi gerekli olmuştur. Diğer enzimlerin sentezlenmesi için bu gerekli olmayabilir. sentezleme plasmidi başarılı bir şekilde çok sayıda, değişik uzunluklarda, glikosilasyon durumları ve disülfid bağlarının numaralarının yapıları yanı sıra, farklı bir kat 23, birden çok alan içerdiği proteinler için için test edildi.
38 gelişmiş orta (bu lizozomal DNA bozulmasını önleyen). Biz transfeksiyon verimi 15 cm çanak (yayınlanmamış gözlem) için yaklaşık 80 ug sadece doyurarak DNA miktarının doğrusal bağımlı olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, biz maksimal verimlilik için bu protokolü plazmid DNA / çanak 80 μ g kadar kullanmanızı öneririz. Bu preparasyon başına DNA yaklaşık 2 mg (mütekabil miktar olacaktır2 MaxiPrep sütununa g) verdi. transfeksiyon verimi en kolay 72 saat inkübasyon döneminden sonra, SDS-PAGE üzerinde, kültür yüzer (20 μ l) 'in bir örneği çalıştırarak izlenmiştir. Salgılanan proteaz bir protein bandı Coomassie boyama ile görünür olmalıdır. Gzm bant zayıftı ve hücreler canlı ayırmak ve ortaya olmadıysa, kültürler IMAC saflaştırma önce başka 24 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı.
Başka en önemli adım enzimi aktive enterokinaz (EK) tedavi oldu. EK aktivitesi, kalsiyum bağlıdır ve NaCl 39 ya da imidazol (yayınlanmamış gözlem) yüksek konsantrasyonlarda inhibe edilir. Bu nedenle, yeterli kalsiyum ve nötr pH'da NaCI fazla 50 mM ihtiva eden EK tamponu yeterli hacimde (diyaliz tampon maddesi, 20 ml eluat 2 başına L) karşı IMAC gelen elüat diyaliz için çok önemliydi. EK tedavisi oda sıcaklığında 16 saat boyunca tavsiye edilen ve bir hareketlilik kayma o ortaya SDS-PAGE ile kontrol edilmelidirişlenmiş proteaz f bölünme tamamlanmış olsaydı. Taze EK eklendi ve vardiya eksik olup olmadığını taze EK Diyaliz tamponunda inkübasyon devam edildi. Bölünme tamamlandıktan Yalnızca S tampon A'ya karşı diyaliz başladı ve arıtma devam etti. EK katalitik hafif zincir sonu katyon değiştirme kromatografisinde Gzms gelen EK tamamen ayrılmasını sağlayan, 5.2 bir pl değerine sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C.
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
