Introduction
De Gzms zijn een familie van sterk homologe serineproteasen gelokaliseerd in gespecialiseerde lysosomen van CTL en NK-cellen 1. De cytotoxische korrels van deze killer cellen bevatten ook de membraan verstoren eiwitten PFN en GNLY die gelijktijdig worden uitgebracht met de Gzms bij herkenning van een doel cel bestemd is voor de eliminatie 2,3. Er zijn vijf Gzms bij mensen (GzmA, B, H, K en M) en 10 Gzms in muizen (GzmA - G, K, M en N). GzmA en GzmB zijn de meest voorkomende en uitgebreid bestudeerd bij mensen en muizen 1. Echter, meer recente studies begonnen de celdood routes en de additionele biologische effecten gemedieerd door de andere, zogenaamde orphan Gzms bij gezondheid en ziekte 4 onderzoeken.
De best bekende functie van het Gzms, met name GzmA en GzmB, is de inductie van geprogrammeerde celdood in zoogdier- cellen, indien in de doelcellen uit met PFN 5,6. Echter, Meer recente studies toonden ook extracellulaire effecten van de Gzms met grote invloed op het immuunsysteem regelgeving en ontsteking, onafhankelijk van cytosolische levering door PFN 7,8. Het spectrum van cellen die efficiënt worden gedood na cytosolische vermelding van de Gzms is onlangs uitgebreid van zoogdiercellen bacteriën 9,10 en zelfs sommige parasieten 11. Deze recente ontdekkingen opende een geheel nieuw gebied voor GZM onderzoekers. Daarom zal een kostenefficiënte, high-yield zoogdierexpressiesysteem aanzienlijk verlichten de weg voor deze toekomstige studies.
Natief humaan, muis en rat Gzms met succes gezuiverd uit de granule fractie van CTL en NK-cellen 12-14. In onze handen de opbrengst van dergelijke zuiveringstechnieken in het bereik van minder dan 0,1 mg / L cellen (ongepubliceerde waarneming en 12). Bovendien is de chromatografische resolutie van een enkele GZM zonder besmetting door other Gzms en / of eiwitten die aanwezig zijn in de granules betwist (ongepubliceerde gegevens en 12,14). Recombinant Gzms werden bacteriën 15, 16 gisten, insectencellen en 17 geproduceerd zelfs in zoogdiercellen zoals HEK 293 18,19. Alleen de zoogdierlijke expressiesystemen zijn voorzien van de mogelijkheid om recombinante enzymen met posttranslationele modificaties identiek met het natieve eiwit cytotoxisch. Posttranslationele modificaties zijn geïmpliceerd bij de specifieke opname door endocytose en de intracellulaire lokalisatie van het protease binnen doelcellen 20-22. Daarom, met behulp van pHLsec 23 (een soort geschenk van Radu Aricescu en Yvonne Jones, Universiteit van Oxford, UK) als het plasmide backbone voor GZM expressie, hebben we een eenvoudige, tijd- en kostenefficiënte systeem voor high-yield eiwitproductie in HEK293T cellen. pHLsec combineert CMV enhancer met een kip Β-actine-promoter; Samen vormen deze elementen demonstratiested de sterkste promoteractiviteit in verschillende cellijnen 24. Bovendien bevat het plasmide een konijn Β-globine intron, geoptimaliseerde Kozak en secretiesignalen, een Lys-6xHis-tag en een poly-A signaal. Inserts kunnen geschikt worden gekloneerd tussen de secretiesignaal en Lys-6xHis-tag (Figuur 1) voor een optimale expressie en secretie efficiëntie van proteïnen ontbreekt geschikte N-eindstandige domeinen. Voor de expressie van de Gzms vervingen we de endogene secretie signaalsequentie de secretie signaal van de vector, gevolgd door een enterokinase (EK) plaats (DDDDK), zodat EK behandeling geactiveerd het uitgescheiden Gzms (actieve Gzms beginnen met de N-eindstandige aminozuursequentie IIGG 25). Bovendien vóór deze werkwijze HEK293T cellen groeien snel in goedkope medium, bijvoorbeeld Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en zijn zeer geschikt voor kosteneffectieve calcium fosfaat transfectie methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Productie van de expressieplasmide pHLsec-GZM
- Bereid totaal RNA van humane NK-cellen (primaire cellen bereid zoals in 26 of NK cellijn NK-92 expressie vijf menselijke Gzms) met geschikte RNA-isolatie methode en reverse transcriberen met behulp van een eerste streng cDNA synthetiseren kit, na manufacturer` s aanbevelingen. Amplify GZM cDNA met PCR en klonen in pHLsec zoals beschreven in 23 (vriendelijke gift van Radu Aricescu en Yvonne Jones, University of Oxford, UK) met behulp van AgeI en KpnI plaatsen (Figuur 1).
OPMERKING: Gebruik de volgende primers aangegeven in tabel 1. - Bevestig juiste inserts door sequencing. Vouw de expressieplasmiden in DH5a-cellen en zuiveren met behulp van een endotoxine-vrij plasmide isolatiekit en de aanwijzingen van de fabrikant.
- Resuspendeer de gezuiverde plasmiden in endotoxine vrij, steriel water bij een concentratie van 2 mg / ml en bewaar bij -20 ° C until gebruik.
2. Expressie van Gzms in HEK293T cellen
- Bereiding van reagentia
- Bereid standaard kweekmedium. Om Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met hoge glucose (25 mM), GlutaMax (4 mM), natriumpyruvaat (1 mM) voeg 10% van standaard foetaal kalfsserum (FCS), penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine ( 100 ug / ml).
- Bereid transfectie medium. Om kweekmedium zonder penicilline-streptomycine voeg 25 ug / ml chloroquine (voeg pas op de dag van transfectie van 1000x voorraden in PBS, opgeslagen bij -20 ° C).
- Bereid serumvrij kweekmedium: To serumvrij medium voor HEK293-cellen voegen glutamine (4 mM), penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 ug / ml) en 2,5 mg / l amfotericine B.
- Bereid de in tabel 2 en filter beschreven met een 0,45 urn filter vóór gebruik oplossingen:
- Uitbreiding van HEK293T cellen
- Groeien HEK293T cellen in 20 ml culture medium met 150 x 25 mm weefselkweek gerechten.
- Split cellen bij 80% confluentie (split-verhouding van 1: 4, meestal elke 3e dag). Cellen losjes hechten, kunnen ze mechanisch worden verwijderd zonder trypsine door rigoureus en neer te pipetteren.
- Plate cellen de nacht vóór transfectie tot 60-70% confluentie te geven op de dag van transfectie (zaaidichtheid ~ 2 x 10 5 cellen / ml). Een gebruikelijke opstelling grootte uit 20-25 kweekschalen.
- Calcium-fosfaat- transfectie
- 1 uur voorafgaand aan transfectie, veranderen de standaard kweekmedium tot 20 ml transfectie medium. Tegen het einde van de 1 uur incubatiestap meng 400 ug plasmide DNA met 10,95 ml DDH 2 0 en 1,55 ml 2 M CaCl2 in 50 ml buizen (1 tube / 5 schotels).
- 1-2 min voorafgaand aan de transfectie, voeg 12,5 ml HBS 2x met 12,5 ml van de DNA-Calcium-oplossing, mengen door omkeren van de buis en incubeer gedurende 30 seconden bij KT.
- Th toevoegene mengsel bereid in 2.3.2 direct naar de cellen (5 ml per gerecht), drop-wise in het medium. Strooi gelijkmatig over het gehele oppervlak, draaien het medium een licht oranje kleur.
- Incubeer de kweekschalen gedurende 7-11 uur in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 in bevochtigde lucht). Na de incubatie, een fijn neerslag zichtbaar. Verwijder het transfectie medium, roer voorzichtig met voorverwarmde PBS en voeg 20 ml serumvrij kweekmedium bereid in 2.1.3. Incubeer 72 uur in een weefselkweek incubator.
- Analyseer de transfectie en expressie-efficiëntie worden uitgevoerd door een monster (~ 20 pi) van de cel supernatant op SDS-PAGE en kleuring met Coomassie Brilliant Blue een granzyme band zichtbaar.
- Zuivering van Gzms uit kweeksupernatant door Nickel-IMAC
- Na de incubatie, het decanteren celkweeksupernatanten in 250 ml buizen en helder door centrifugeren. Voer een eerste spin (400 x g, 10 min, 4 °C) dat het medium te verwijderen uit losgemaakte cellen. Breng het supernatant in 250 ml verse buizen en centrifugeren bij 4000 xg, 30 minuten bij 4 ° C om alle resterende celresten te verwijderen.
- Voeg 5 ml van 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-Base (pH 8) en 1 ml van 0,25 M NiSO 4 per 250 ml van de heldere supernatant. Filtreer de bovenstaande vloeistof met behulp van een 500 ml vacuüm filtereenheid (0,45 mm).
- Equilibreer een kolom Nickel-IMAC met Zijn bindende buffer A (10 kolomvolumes, CV) met een geschikte FPLC systeem.
- Breng de heldere supernatant aan de geëquilibreerde kolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min bij 4 ° C.
- Nadat de supernatant werd aangebracht, waskolom met His-bindingsbuffer totdat UV-absorptie basislijn is bereikt (gewoonlijk 10 CV).
- Elueer Gzms met een lineaire 20 ml gradiënt (0-250 mM imidazool) bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min tijdens het verzamelen 2 ml-fracties. Analyseer de elutie fracties door SDS-PAGE en Coomassie kleuring.
- Enterokinase (EK)behandeling en de definitieve sanering door kationuitwisselingschromatografie
- Pool GZM bevattende fracties in een dialyseren buis met ≤10 MWCO. Sla een monster bij -20 ° C als pre-EK control.
- Voeg EK in 0,02 eenheden / 50 ml initiële supernatant direct naar gepoolde fractie in de dialysebuis en dialyze O / N (minimaal 16 uur) bij kamertemperatuur in EK-buffer (4 l, change buffer eenmaal).
- De volgende dag, analyseren EK behandeld Gzms in vergelijking met de pre-EK control door SDS-PAGE en Coomassie kleuring.
- Als N-eindstandige verwerking voltooid is, verandert dialyse buffer S buffer A (4 L) en dialyze nog eens 4 uur bij KT. Filter dialysaat (0,45 pm).
- Equilibreer een S-S-kolom met buffer A. Plaats het monster op de kolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min bij 4 ° C.
- Na het monster laden, wassen van de kolom met S buffer A tot UV-absorptie basislijn is bereikt (ongeveer 10 CV). Elueer het Gzms met een 30 ml lineair gradiënt (150 tot 1000 mM NaCl). GzmA eluiten bij ~ 650 mM NaCl, GzmB bij ~ 700 mM NaCl en GzmM bij ~ 750 mM NaCl.
- Analyseer elutie fracties door SDS-PAGE en colorimetrische assays (zie hieronder). Pool fracties die Gzms en concentraat (ongeveer 30-voudig tot een concentratie van ongeveer 100 uM) in rotatie filters (15 ml, 10 MWCO). Aliquot de geconcentreerde GZM voorbereidingen en bewaar bij -80 ° C.
3. Testen GZM activiteit
- Bereiding van reagentia
- Bereid colorimetrische assay buffer: 50 mM Tris-Base, pH 7.
- Voor het meten van GzmA toevoegen Na-CBZ-L-Lysine thiobenzyl ester (S-Bzl) (BLT) aan de assay buffer tot een eindconcentratie van 0,2 mM en 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) tot een concentratie van 0,22 mM. Voor GzmB bevatten 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) en 0,22 mM DTNB. Voor GzmM bevatten 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (pNA) (AAPL). Synthetische peptiden worden toegevoegd uit passende voorraad oplossingen (in DMSO, stored bij -20 ° C) aan de buffer vers voor de assay.
- Bereid splitsing assay buffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,5
- Bereid colorimetrische assay buffer: 50 mM Tris-Base, pH 7.
- Colorimetrische assays
- Verdeel GZM kleine monsters (<5 ui) van elutiefracties of geconcentreerde voorraden in de 96-well platbodem platen. Neem een positieve controle (getest GZM preparaten of ongezuiverde NK cellysaten) en een negatieve controle (alleen buffer).
- Voeg 100 ul assaybuffer aan elk putje (een multi-channel pipet). Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Meet de OD bij 405 nm in een microplaat reader.
- Klievingsbepaling
- Voor klieving assays met gezuiverd substraten, co-incuberen van een eiwitsubstraat (natief of recombinant, 100-400 nM, enkele voorbeelden van doeltreffende GZM substraten worden in het resultaat en in de opmerking einde van deze paragraaf) met seriële verdunningen van GZM (beginnend bij 400 nM) in assaybuffer voor verschillende tijdstippen.Analyse door SDS-PAGE en Coomassie en zilverkleuring; of door Western blotting met specifieke antilichamen.
- Voor klieving assays gebruikt cellysaten, schorsen 10 6 HeLa-cellen (of eventueel beschikbare tumorcellijn) in 1 ml bepalingsbuffer en lyseren bevroren in een ethanol / droog ijsbad en ontdooien bij 37 ° C drie keer. Verwijder celresten door centrifugatie (15.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C).
- Co-incubeer de geklaard lysaat met Gzms bij verschillende concentraties en tijden als hierboven. Splitsing wordt gedetecteerd door immunoblotting gebruikmaking van geschikte antilichamen.
LET OP: Een paar voorbeelden van bona fide substraten waarvoor commerciële antilichamen zijn beschikbaar: Bied (BH3-interactie domein dood agonist) en caspase 3 gesplitst door GzmB 27,28; meerdere heterogene nucleaire ribonucleoproteins (hnRNPA1, A2 en U) gesplitst door GzmA 29; cytomegalovirus fosfoproteïne 71 door GzmM 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de volgende paragraaf zullen we een volledige documentatie van een GzmA voorbereiding presenteren aan de methode te verlichten. We hebben ook met succes gezuiverd GzmB en GzmM, produceren vergelijkbare resultaten met betrekking tot de zuivering efficiëntie en activiteit. Echter, van die latere preparaten wij maar toont enkele geselecteerde stukjes informatie. GzmB voorbereidingen van 293T cellen na het huidige protocol werden gebruikt in verschillende studies gepubliceerd, met de nadruk hun activiteiten in verschillende biologische testsystemen 9,29,31-34.
Een typische GzmA zuivering is weergegeven in figuur 2A. Efficiënte transfectie en expressie na 72 uur werd aangegeven door een detecteerbaar GZM band op een Coomassie-gekleurde SDS-PAGE gel zonder verdere concentratie van het kweeksupernatant (~ 37 kDa voor GzmB en GzmM onder reducerende omstandigheden; ~ 60/34 kDa voor GzmA onder non-reducerende / reducerende omstandigheden). Na de IMAC zuivering werden de monsters behandeld met invoerenokinase (EK). Een zichtbare verschuiving van het EK behandelde monster (post-EK) vergeleken met de pre-EK control waargenomen. De laatste zuivering van de S-kolom resulteerde in zeer zuiver GZM preparaten (GzmA in figuur 2A, GzmB en GzmM in figuur 2B) met een enkele band verschijning op met Coomassie gekleurde gels eiwit. De samengevoegde fracties werden geconcentreerd tot een uiteindelijke concentratie van ~ 100 uM. Kenmerkend we verkregen opbrengsten van ongeveer 0,5 tot 1 mg per Gzms 100 ml kweeksupernatant. Om efficiënt glycosylering te demonstreren, werden een paar eerste voorbereidingen behandeld met Endoglycosidase (Endo) H, die een hoge mannose oligosacchariden van N-gebonden glycoproteïnen verwijdert. Natief GzmA een N-gebonden glycosylatieplaats op Asn-142, waaraan een hoog mannose oligosaccharide gebonden 35. EndoH behandeling induceerde een duidelijke mobiliteitverschuiving in de GZM A, alsmede GzmB, preparaten van HEK293T-cellen maar niet in bacterieel geproduceerde GzmA zoals geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassiekleuring (Figuur 2C).
Routinematig werd elke GZM batch getest op enzymatische activiteit in colorimetrische assays. Deze snelle en betrouwbare testprogramma wordt proteolytische activiteit van het Gzms door de splitsing van kleine synthetische peptiden die spectrofotometrisch wordt aangegeven door een kleurverandering van de assay buffer. Door de verschillende voorkeuren betreffende de aminozuurresten (P1 positie) waarna deze proteasen splitsen, de keuze van een bepaald peptide varieert tussen de Gzms. GzmA heeft trypsine-achtige activiteit, splitsen na de basische residu's arginine (Arg, R) en lysine (Lys, K). GzmB splitst bij voorkeur na asparaginezuurresten (Asp, D), en GzmM splitst na leucine (Leu, L) en methionine (Met, M) 1. Onze preferentiële peptide keuze is BLT -S-Bzl naar GzmA activiteit te meten, AAD -S-Bzl voor GzmB en AAPL -pNA voor GzmM.
Het belangrijkste verschil tussen de thiobenzylester substraten (AAD en BLT) en p-nitroanilide substraat (AAPL) de specifieke chemie, doordat GZM medieert splitsing van thiobenzylester substraten releases benzyl-mercaptan, die slechts veroorzaakt een chromogene reactie in de stroomafwaartse reactiezone met de chromofoor DTNB. Daarom is in de reactiebuffers van thiobenzylester substraten DTNB aanwezig moet zijn, terwijl de GZM-gemedieerde afgifte van p-nitroanilide voldoende is voor de colorimetrische detectie. De gedetailleerde werkwijze voor de colorimetrische assays werd onlangs gepubliceerd 36. Figuur 3A toont de representatieve BLT en AAPL esterase activiteit in de elutie fracties van de S-kolom van een GzmA en GzmM bereiding, respectievelijk. Colorimetrische test werd ook gebruikt om de activiteit van recombinant vergelijken natief GzmB preparaten. Zoals getoond in figuur 3B, recombinant 293T GzmB gesplitst het chromogene substraat met gelijke efficiëntie in vergelijking met natief GzmB gezuiverd uit een menselijke NK cell lijn, zoals onlangs beschreven 12.
Om GZM activiteit meer specifiek te testen, worden GZM splitsing testen met behulp van bekende eiwitsubstraten aangegeven. Deze splitsing assays kunnen worden uitgevoerd met gezuiverd recombinant of natief eiwit (indien aanwezig), met cellysaten of de meeste fysiologische met intacte cellen. Indien een eiwit substraat beschikbaar is, kan proteolytische activiteit in eenvoudige co-incubatie experimenten met GZM preparaten zoals bleek bij de bekende bacteriële GzmA en GzmB substraten nuoCD en nuoF 9, en met de nieuwe humane mitochondriale GzmM substraat NDUFAF3 geanalyseerd (Figuur 4A).
Cellysaten vormen een duidelijke bron van meerdere GZM substraten. Commerciële antilichamen beschikbaar tegen veel van de substraten. Een snelle en eenvoudige methode om cellysaten genereren door toepassing van meervoudige vries / ontdooi cycli eerder aangetoond 33. Het gebruik van detergenten is niet aanbevolen als ze kunnen interfereren met GZM activiteit. In figuur 4B, GzmA gemedieerde klieving van hnRNPA1 in een HeLa cel lysaat wordt getoond in een immunoblot met gebruikmaking van een anti-hnRNPA1 antilichaam en een anti-Β-actine antilichaam ladingscontrole.
Voor klieving assays (of cytotoxiciteit assays) in intacte cellen, de beschikbaarheid van een nalevering molecule nodig (PFN of streptolysine O, SLO, voor zoogdiercellen, GNLY of andere antimicrobiële peptiden voor prokaryote cellen). Splitsing assays in intacte cellen moeilijkste als de concentratie van de levering moleculen is kritisch en moet uitgebreide fijnafstemming. De invoering van deze complexe protocollen van apoptose assays valt buiten het bestek van dit document. Hier kunnen we alleen verwijzen naar de enorme hoeveelheid literatuur, als voorbeelden 12,13.
<strong> Tabel 1: GZM Klonen Primer sequenties.
De primersequenties die zijn gebruikt voor het kloneren GzmA, GzmB en GzmM aangegeven. Voorwaartse primers werden ontworpen om een EK plaats voor de N-terminus van het actieve protease voeren (zie figuur 1)
Tabel 2: De Solutions en Buffer Compositions.
De recepten van de belangrijkste voorraadoplossingen en buffers zijn aangegeven.
Figuur 1. pHLsec Sequence Kritiek voor Construct Klonen.
In de reeks, een aantal elementen in de vector wordenbenadrukt die belangrijk zijn voor klonering, uitscheiding, IMAC zuivering en activatie van de proteasen zijn: De Kozak consensus en secretie signaalsequenties, de Agel en KpnI restrictieplaatsen, alsook de C-terminale Lys_6xHis tag. We voorbeeld GzmA als inzetstuk dat is N-terminaal gefuseerd met een enterokinase (EK) website. Voor de volledige kaart van de volledige vector backbone, verwijzen we naar de aanvullende informatie in 23.
Figuur 2. Expressie, zuivering en activering van Volledig Glycosylated Human Gzms van HEK 293 T-cellen.
A) toont een reeks van Coomassie-gekleurde, niet-reducerende SDS-PAGE gels waaruit de gehele GzmA productieproces van de secretie in de supernatant eerste Ni-IMAC zuivering EK behandeling en fina l polijsten via kationuitwisselingschromatografie. Het kweeksupernatant werd op SDS-PAGE onder reducerende (rood) en niet-reducerende (non-red) condities. GzmA is een homodimeer (ssGzmA) die wordt gestabiliseerd door een disulfidebinding. De GzmA homodimeer (~ 60 kDa) loopt in de buurt van vervuilende BSA (~ 66 kDa). Onder reducerende omstandigheden de GzmA monomeer (shGzmA) verschijnt als een ~ 34 kDa band. Om de zuiverheid van het uiteindelijke GzmB en GzmM preparaten tonen representatieve Coomassie gekleurde gels onder niet-reducerende omstandigheden wordt in B. Bacterieel (E. coli) gegenereerde GzmA en GzmA en GzmB geproduceerd in HEK293T-cellen werden behandeld met EndoH en geanalyseerd door niet-reducerende SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Glycosylering van de in HEK293T cellen Gzms blijkt uit een mobiliteitsverandering na behandeling met EndoH in vergelijking met niet-geglycosyleerd GzmA geproduceerd in bacteriën (C).
ig3.jpg "/>
Figuur 3. Recombinant Gzms Hydrolyze synthetische peptiden.
A), kleine monsters van de elutie fracties van de uiteindelijke S kolom werden getest op GzmA en GzmM activiteit chromogene assays gebruikt BLT en AAPL respectievelijk als substraten. Grafieken tonen splitsingsplaats die werd aangeduid als OD verhoging bij 405 nm. Activiteit piekfracties gecorreleerd met het eiwit piek in de elutie zoals aangegeven in UV-absorptie en SDS-PAGE-analyse (figuur 2A en B). B), recombinant en natief GzmB 293T (vervaardigd zoals beschreven 12) bij bepaalde concentraties werden geïncubeerd in aanwezigheid van het chromogene substraat AAD. GzmB activiteit werd aangeduid als OD verandering bij 405 nm. De grafiek toont het gemiddelde ± SEM van de meest recente GZM preparaten die getest werden in triplo.
52.911 / 52911fig4.jpg "/>
Figuur 4. Recombinant Gzms Cleave eiwitsubstraten.
A) Recombinant GST-gemerkte bacteriële ademhalingsketen eiwitten nuoCD en nuoF, alsmede het zoogdier ademhalingsketen eiwit NDUFAF3, werden behandeld met aangewezen concentratie geïndiceerd Gzms gedurende 15 minuten bij 37 ° C. 1 ug gezuiverd eiwit in 20 pl reacties werden gebruikt. Splitsing werd geanalyseerd door SDS-PAGE en Coomassie kleuring. B) HeLa-cellysaat (in een eiwitconcentratie van ~ 1 mg / ml) werd geïncubeerd met aangegeven concentraties van recombinant GzmA gedurende 30 minuten en geanalyseerd door immunoblotting met behulp van anti hnRNPA1 en Β-actine-antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De klassieke en uitgebreid bestudeerd rol van GzmA en GzmB is de inductie van apoptose in zoogdiercellen na cytosolische levering door de porie vormende eiwit PFN 1. Onlangs werd de cytotoxische spectrum van de Gzms aanzienlijk verbreed van zoogdiercellen tot 9,10 bacteriën, alsmede bepaalde parasieten 11. In de non-klassieke, extracellulaire functies van GzmA en GzmB en de biologische betekenis van de verschillende wees Gzms nog onduidelijk. Daarom is een robuuste tijd- en kosten-efficiënte expressie en zuivering systeem van de Gzms, zoals die door dit protocol, zal zijn van grote hulp voor deze toekomstige studies.
De kracht van deze methode is vooral gebaseerd op de expressie vector, pHLsec 23, die wordt gebruikt in dit systeem. Dit plasmide heeft een hoog kopie-aantal in E. coli, waardoor een efficiënte DNA productie. De enhancer / promotor elementen zorgen voor desterkste activiteit in verschillende cellijnen 24. Het bevat een intron in de transcriptie-eenheid. Introns werden gevonden genexpressie in zoogdiercellen tot 100-voudige verbetering 37. Bovendien, het plasmide verschaft een Kozak consensus en een geoptimaliseerde secretiesignaal, een Lys-6xHis-tag en een poly-A signaal (figuur 1). Inserts kunnen worden gekloond met behulp van Agel en Kpnl plaatsen tussen de secretie-signaal en de Lys-6xHis tag. Met behulp van Agel en Xhol zal voorkomen dat de polyHis tag. Voor de Gzms, was het noodzakelijk om een enterokinase plaats aan het N-uiteinde van de proteasen waardoor activatie van de proteasen na expressie en IMAC zuivering voegen. Voor de expressie van andere enzymen het wellicht niet nodig. Het expressieplasmide werd met succes getest voor meerdere constructen van verschillende lengtes, glycosyleringstoestanden en het aantal disulfide bindingen, en voor eiwitten die meerdere domeinen bevatten met verschillende plooien 23.
38 medium. We vonden dat transfectie-efficiëntie was lineair afhankelijk van de hoeveelheid DNA enige verzadiging bij ongeveer 80 ug voor een 15-cm schaal (niet gepubliceerde waarneming). Daarom raden wij u tot 80 μ g plasmide DNA / schotel in dit protocol voor maximale efficiency. Deze bedraagt ongeveer 2 mg DNA per preparaat (corresponding tot 2 Maxiprep kolommen). De transfectie-efficiëntie werd zeer gemakkelijk gevolgd door het uitvoeren van een monster van kweeksupernatant (ongeveer 20 μ l) op SDS-PAGE na 72 uur incubatie periode. Een eiwit band van de afgescheiden protease moet zichtbaar door Coomassie kleuring zijn. Indien de GZM band was zwak en de cellen niet los en bleek levensvatbaar, werden de kweken gedurende nog 24 uur voor IMAC zuivering.
Een ander meest kritische stap was de enterokinase (EK) behandeling die het enzym activeert. EK activiteit calciumafhankelijke en wordt geremd door hoge concentraties NaCl 39 en imidazool (ongepubliceerde waarneming). Daarom was het belangrijk om het eluaat van de IMAC dialyseren tegen een voldoende (20 ml eluaat per 2 L dialysebuffer) van EK buffer die voldoende calcium en ten hoogste 50 mM NaCl bij neutrale pH. EK behandeling wordt aanbevolen voor 16 uur bij kamertemperatuur en moeten worden gecontroleerd door SDS-PAGE dat er een verschuiving van de mobiliteit o onthuldf de behandelde protease wanneer de splitsing is voltooid. Verse EK werd toegevoegd en het incuberen in vers EK dialyse buffer werd gehandhaafd wanneer de verschuiving onvolledig was. Alleen wanneer de splitsing is voltooid, S dialyse tegen buffer A werd uitgevoerd en de zuivering voortgezet. De katalytische lichte keten EK heeft een pI waarde van 5,2, zodat de volledige scheiding van het EK Gzms in de uiteindelijke kationenuitwisselingschromatografie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C.
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
