Protocol
Ethics Hinweise: Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem australischen Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken und den Richtlinien der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und wurden durch die genehmigte Tierethikkommission der Macquarie University.
1. VEP Elektrodenimplantation
- Betäuben das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (75 mg / kg) und Medetomidin (0,5 mg / kg).
Hinweis: Nach der Einleitung der Narkose, beachten Sie die Entzugs Reflexe (Pinch-Test, der Hornhaut und der Augenlidreflex, etc.) und ihre Abwesenheit als Indikation zur Operation zu beginnen. Tiere ständig in der gesamten Operation zu überwachen und zu verwalten zusätzliche Anästhetika (10% vom Ausgangs Ketamin Dosis pro top-up), wenn die Reflexe vorhanden sind. Adulte Ratten (> 12 Wochen) werden in den Experimenten verwendet. - Rasur die Haut des OP-Bereich.Legen Sie das Tier auf eine wärmende Unterlage (37 ° C), um die Körpertemperatur während der Operation aufrecht zu erhalten. Bereiten Sie die Haut durch topische Anwendung von PVP-Jod. Bewerben Chirurgisches Tuch. Gelten topische Augensalbe zur Hornhaut Trockenheit unter Vollnarkose zu vermeiden. Pflegen Keimfreiheit, indem sie sterile Instrumente.
- Einen Längshautschnitt auf der Mittellinie der Kopfhaut. Deaktivieren Sie das Bindegewebe um gute Belichtung des Schädels zu erreichen.
- Vorsichtig bohren kleine Bohrlöcher manuell mit einem Mikrohandbohrmaschine auf 7 mm hinter dem Bregma und 3 mm lateral der Mittellinie.
- Implantatschraube Elektroden durch den Schädel in die Rinde (Bereich 17), Durchdringen der Kortikalis zu einer Tiefe von etwa 0,5 mm. Implantat eine Referenzelektrode Schraube auf der Mittellinie 3 mm rostral des Bregma. Bewerben Zahnzement zu umhüllen und fixieren Sie die Schrauben (nicht immer erforderlich).
- Naht der Haut des Kopfes, zu verwalten antibiotische Salbe auf die Haut und lassen Sie das Tier recover aus der Narkose auf einer Erwärmung pad.
Hinweis: Alternativ können Elektroden können dem Tageslicht ausgesetzt werden, so dass die Haut muss nicht in jeder Aufzeichnungs wieder geöffnet werden. Unmittelbar nach Beendigung der Operation, aber vor dem Aufwachraum, verwalten ein nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAID) (wenn nicht vor der Operation verabreicht wird) oder ein Opioid-Analgetikum. Überwachen Sie die Tiere ständig bis zur vollständigen Wiederherstellung nach Betäubung und ambulant voll. - Lassen Sie mindestens 1 Woche für die Tiere von der Operation vor der VEP Aufnahme erholen.
2. Optic Nerve Injection
- Betäuben das Tier, bereiten die Haut und wenden drapieren wie oben beschrieben (1.1 und 1.2).
- Einen 1- bis 1,5-cm-Einschnitt in der Haut oberhalb der Umlaufbahn von einer zufällig ausgewählten Auge. Öffnen Sie das Unterhautgewebe, um die Augenhöhle mit feinen Iris Schere zu erreichen. Öffnen Sie die Bindehaut und vorderen Tenon-Kapsel unter dem Operationsmikroskop.
- Ziehen Sie die äußeren AugenMuskeln und intraobital Tränendrüsen auf ca. 3 mm Länge des Sehnervs freizulegen. Öffnen Sie die Dura und Arachnoidea Angelegenheit Schichten um den Sehnerv in Längsrichtung mit einer ophthalmischen Klinge.
- Legen Sie die Glaspipette in den Sehnerv in einem Abstand von 2 mm hinter der ganzen Welt. Die Glas-Mikropipette wird in eine Hamilton-Spritze befestigt ist.
- Injizieren 1% Lysolecithin (0,4-1,0 ul, mit 0,02% Evans Blau, das keine Auswirkungen auf die Myelinisierung) langsam in das Nerven ungefähr über einen Zeitraum von 30 sec.
- Naht der Hautschnitt. Gelten antibiotische Salbe um Infektionen zu vermeiden. Partneraugen können als interne Kontrollen für die Elektrophysiologie Aufnahmen serviert.
- Legen Sie die Tiere auf einer Erwärmung pad sich von der Anästhesie zu erholen.
3. VEP Recording
- Betäuben das Tier und bereiten die Haut wie 1.1 und 1.2.
Hinweis: Niederdosis Narkosemittel kann für elektrophysiologische reco verwendet werdenrding (Ketamin 40 mg / kg und Medetomidin 0,25 mg / kg). - Legen Sie die Ratte in einem dunklen Raum und lassen Sie ihn in die Dunkelheit für 5 anzupassen - 30 min. In einigen Fällen können Ratten jeweils dunkel angepasst O / N für scotopic oder Licht zur photopischen VEP Aufnahmen 8 angepasst werden.
- Aufrechterhaltung der Körpertemperatur auf 37 ± 0,5 ° C durch die homoeothermic Tuchsystem mit einer rektalen Temperaturfühler.
- Erweitern die Schüler mit 1,0% Tropicamid Augentropfen. Öffnen Sie die Haut über den Schädel, um auf die vorge platziert in situ Schraube Elektroden.
- Schließen Sie die Schraube über der kontralateralen visuellen Kortex des stimulierten Auge und dem Referenzschraube an den Verstärker. Legen Sie eine Nadelelektrode in den Schwanz als die Erde. Messen Sie und pflegen die Elektrodenimpedanz unter 5 kOhm.
- Legen Sie eine Mini-Ganzfeld-Stimulator direkt auf der Haut um die Augenlider, um überlegene Augen Isolierung 7 bereitzustellen. Die Beleuchtung der Stimulator muss vorher kalibriert werdenmit einem Photometer.
- Liefern Fotostimulation durch Lichtblitze 100 mal mit einer Frequenz von 1 Hz, bei niedrigen und hohen Bandpassfiltereinstellungen von 1 bis 100 Hz. Das Signal Abtastrate bei 5 kHz.
Gilt: Signale sollte mindestens bei ca. 250 abgetastet werden - 300 Hz, um sicherzustellen, dass mehr als zwei Proben werden während eines jeden Zyklus gesammelt. - Naht der Haut zurück und die Tiere zu halten auf einer Erwärmung pad sich von der Anästhesie zu erholen. Aufzeichnungs kann wiederholt auf einzelne Tiere aufgezeichnet werden, um funktionelle Veränderungen über einen Zeitraum zu überwachen.
- Am Endpunkt, eine Überdosis zu verabreichen Injektion von Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg, ip), um das Tier einschläfern. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Herzstillstand, Atemstillstand und eine Abnahme der Körpertemperatur.
4. Gewebepräparation und Histologie
- Entfernen Sie die Sehnerven von eingeschläfert Tiere unter dem Mikroskop und befestigen Sie das Gewebe in 1% Paraformaldehyd O / N. <li> gründlich waschen das Gewebe mit Kochsalzlösung. Behandeln Sie das Gewebe in einem automatischen Gewebeprozessor und betten in Paraffin. Geschnittenen Abschnitte (5-10 & mgr; m) unter Verwendung eines Rotationsmikrotom.
- Abschnitte in 0,1% fast blue Lösung wie Luxol (in 95% Ethanol) O / N Inkubieren bei 56 ° C. Differenzieren Sie die Abschnitte in 0,05% Lithiumcarbonat für 30 Sekunden und dann 70% Ethanol für weitere 30 sec. Schließlich in 0,1% Cresylviolett Lösung Gegenfärbung 30 Sekunden vor der Montage der Teile. Nutzen Sie die schnelle Blau-Färbung, um Myelin in den Sehnerv 5 zu identifizieren.
Hinweis: Für die Immunhistochemie Studie beheben Gewebe in 1% Paraformaldehyd, wasche mit Kochsalzlösung und Inkubation mit 30% Saccharose O / N. Betten Sie Gewebe in OCT Einbettmedium und machen Gefrierschnitten unter Verwendung eines Kryostaten.
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Representative Results
Reproduzierbare inner sessional VEP Spuren sind in Abbildung 1 dargestellt und eine signifikante Verzögerung in N1 Latenzzeit kann nach dem Sehnerv Injektion zu sehen. Teil Sehnerv Läsionen der Demyelinisierung auf histologischen Schnitten mit Luxol schnelle Blau-Färbung 5 beobachtet werden. Abbildung 2 zeigt einen repräsentativen Querschnitt mit einer kleinen Brenn demyelinisierten Läsion in der Mitte des Sehnerven. Beachten Sie, dass Querschnitt repräsentieren nicht Gesamtvolumen der Läsion. Die demyelinisierten Bereich auf jeder aufeinanderfolgenden Querschnitt des Nervs, die Läsion Lautstärke mit der dreidimensionalen Rekonstruktion abzuleiten gemessen werden. Wir haben eine starke Korrelation zwischen Latenzverzögerung und Läsionsvolumen Verwendung dieses Modells in unseren früheren Studien gezeigt, und es gab keine VEP Latenz Verzögerung in den mit Kochsalzlösung injiziert Kontrollen 5.
Es wird angenommen, dass eine frühe VEP-Komponenten nach der Blitzbeleuchtung stabiler sind 7 5. Daher empfehlen wir, dass N1 Latenz sollte zur Datenanalyse und für Längs VEP-Überwachung bei der Beurteilung der Auswirkungen der remyelinisierende Therapien verwendet werden. Die Amplitude des VEP, obwohl mehr variable Vergleich zum Latenz mehr anzeigt Funktion der Axone im optischen Nerv 6. Elektroenzephalogramm-basierte Skalierung kann zur Amplitudenanalyse 9 betrachtet werden.
Abbildung 1. VEP Verzögerung nach Sehnerv Injektion. Repräsentative VEP Spuren von einem einzelnen Ratten vor und 2 Tage nach der Sehnerv Mikroinjektion (0,8 ul Lysolecithin). VEP Aufnahmen wurden auf dem jeden Tag wiederholt (intra-sessional Spuren zeigenn in der gleichen Farbe), um die Reproduzierbarkeit dieses VEP Aufnahmeprotokoll zeigen. (Vertikale Skala bar: 10 & mgr; V; horizontale Maßstab: 10 msec). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Demyelinisierung im Sehnerven. Repräsentativen Querschnitt des Sehnerven von einer Ratte nach Lysolecithin Mikroinjektion. Die Myelin Komponente blau gefärbt mit Hilfe Luxol schnell blau. Ein kleiner Fokus Läsion der Demyelinisierung in der Mitte des Querschnitts gesehen werden. Demyelinisierten Bereich kann auf serielle Längsquerschnitte, um die Läsion Volumen in einem dreidimensionalen Skala schätzen gemessen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Ophthalmic Research Institute of Australia (Oria) unterstützt. Wir danken Prof. Algis Vingrys und Dr. Bang Bui, University of Melbourne, für zunächst uns helfen, die VEP Aufnahmetechnik zu entwickeln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
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