Protocol
Declaración de Ética: Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos y las directrices de la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Macquarie.
1. VEP Electrodo Implantación
- Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg / kg) y medetomidina (0,5 mg / kg).
Nota: Después de la inducción de la anestesia, observar los reflejos de retirada (prueba de pellizco, reflejo corneal y palpebral, etc.) y su ausencia como una indicación para comenzar la cirugía. Continuamente observar a los animales durante toda la cirugía y administrar fármaco anestésico adicional (10% de la dosis de ketamina inicial por top-up) si los reflejos están presentes. Las ratas adultas (> 12 semanas) se utilizan en los experimentos. - Afeitarse la piel de la zona quirúrgica.Colocar el animal en un cojín de calentamiento (37 ° C) para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Preparar la piel mediante la aplicación tópica de povidona yodada. Aplicar drapeado quirúrgico. Aplicar pomada oftálmica tópica para evitar la sequedad de la córnea bajo anestesia general. Mantener la asepsia utilizando instrumentos estériles.
- Hacer una incisión en la piel en la línea media longitudinal de la piel de la cabeza. Despeja el tejido conectivo para lograr una buena exposición del cráneo.
- Con cuidado, perforar pequeños agujeros de trépano manualmente utilizando un taladro micro mano en 7 mm detrás del bregma y 3 mm lateral a la línea media.
- Electrodos tornillo de implante a través del cráneo en la corteza (zona 17), que penetran en la corteza a una profundidad de aproximadamente 0,5 mm. Implantar un electrodo tornillo de referencia en mm rostral línea media 3 al bregma. Aplicar cemento dental para encajonar y fijar los tornillos (no siempre es necesario).
- Suturar la piel de la cabeza, administrar pomada antibiótica sobre la piel y permitir que el animal en Recover de la anestesia en un cojín de calentamiento.
Nota: Como alternativa, los electrodos se pueden dejar expuestos, por lo que la piel no necesita ser reabierto en cada grabación. Inmediatamente después de la cesación de la cirugía, pero antes de la recuperación de la anestesia, administrar un fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID) (si no se administra antes de la cirugía) o un analgésico opioide. Monitorear los animales constantemente hasta que la recuperación total de la anestesia y totalmente ambulatoria. - Deje por lo menos 1 semana para que los animales se recuperan de la cirugía antes de la grabación VEP.
2. Inyección Nervio Óptico
- Anestesiar al animal, preparar la piel y aplicar drapeado que el anterior (1.1 y 1.2).
- Hacer una incisión de 1 a 1,5 cm en la piel por encima de la órbita de un ojo seleccionados al azar. Abra el tejido subcutáneo para alcanzar la cavidad orbital usando iris finas tijeras. Abra la conjuntiva y anterior de la cápsula de Tenon bajo el microscopio operativo.
- Retirar la extraoculareslos músculos y las glándulas lagrimales intraobital para exponer aproximadamente 3 mm de longitud del nervio óptico. Abra las capas de duramadre y materia aracnoide alrededor del nervio óptico longitudinal utilizando una cuchilla oftálmica.
- Inserte la pipeta de vidrio en el nervio óptico a una distancia de 2 mm posterior al globo. La micropipeta de vidrio está unida a una jeringa Hamilton.
- Inyectar 1% lisolecitina (0,4 a 1,0 l, con 0,02% de azul de Evan que no tiene efectos sobre la mielinización) lentamente en el nervio aproximadamente durante un período de 30 seg.
- Suturar la incisión de la piel. Aplique ungüento antibiótico para prevenir la infección. Compañeros de ojos se pueden servir como controles internos para grabaciones de electrofisiología.
- Coloque los animales sobre una almohadilla de calentamiento para recuperarse de la anestesia.
3. VEP grabación
- Anestesiar el animal y preparar la piel como 1.1 y 1.2.
Nota: dosis más baja de los anestésicos puede ser utilizado para reco electrofisiológicording (ketamina 40 mg / kg y medetomidina 0,25 mg / kg). - Coloque la rata en un cuarto oscuro y deje que se adapte a la oscuridad de 5-30 min. En algunos casos, las ratas pueden ser, respectivamente, adaptada a la oscuridad O / N para escotópica o la luz adaptado para grabaciones VEP fotópica 8.
- Mantener la temperatura corporal a 37 ± 0,5 ° C por el sistema manta homeotermos con una sonda de termómetro rectal.
- Dilatar las pupilas con gotas para los ojos 1,0% tropicamida. Abra la piel sobre el cráneo para acceder al pre-colocado en electrodos de tornillo in situ.
- Conectar el tornillo sobre la corteza visual del ojo contralateral estimulado y el tornillo de referencia para el amplificador. Inserte un electrodo de aguja en la cola como el suelo. Medir y mantener la impedancia del electrodo por debajo de 5 kW.
- Coloque un estimulador mini-Ganzfeld directamente sobre la piel alrededor de los párpados para proporcionar aislamiento ojo superiores 7. La iluminación del estimulador debe calibrarse de antemanopor un fotómetro.
- Entregar la estimulación fótica través de destellos de luz de 100 veces a una frecuencia de 1 Hz, con bajas y altas configuración del filtro de paso de banda de 1 Hz y 100, respectivamente. La tasa de muestreo de la señal es en 5 kHz.
Nota: Las señales deben ser muestreados al menos a unos 250 a 300 Hz para asegurar que más de dos muestras se recogen durante cada ciclo. - Suturar la piel de la espalda y mantener a los animales en un cojín de calentamiento para recuperarse de la anestesia. La grabación se puede grabar varias veces en animales individuales para monitorear los cambios funcionales en un período de tiempo.
- En el punto final, administrar una inyección sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg / kg, ip) para la eutanasia del animal. Confirmar la eutanasia por paro cardíaco, parada respiratoria y disminución de la temperatura corporal.
4. Preparación del tejido e Histología
- Quitar los nervios ópticos de los animales sacrificados bajo el microscopio y fijar el tejido en 1% de paraformaldehído O / N. <li> Lavar el tejido a fondo con solución salina. Tratar el tejido en un procesador automático de tejidos e incrustar en parafina. Secciones fotografica (5-10 micras) con un micrótomo rotatorio.
- Incubar las secciones en 0,1% solución de azul rápido como Luxol (en el 95% de etanol) O / N a 56 ° C. Diferenciar las secciones de 0,05% de carbonato de litio durante 30 segundos y luego etanol al 70% durante 30 seg. Por último, contrateñir en solución violeta de cresilo 0,1% durante 30 segundos antes de montar las secciones. Utilice la tinción con azul rápido para identificar la mielina en el nervio óptico 5.
Nota: Para el estudio inmunohistoquímico, fijar tejidos en paraformaldehído al 1%, se lava con solución salina y se incuba con un 30% de sacarosa O / N. Incrustar tejidos en octubre medio de inclusión y hacer cryosections usando un criostato.
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Representative Results
Reproducibles rastros VEP intra períodos de sesiones se muestran en la Figura 1 y un retraso significativo en la latencia N1 se pueden ver después de la inyección del nervio óptico. Las lesiones del nervio óptico parciales de desmielinización se pueden observar en las secciones histológicas utilizando Luxol tinción azul rápido 5. La figura 2 muestra una sección representativa con una pequeña lesión desmielinizada focal en el centro del nervio óptico. Tenga en cuenta que la sección transversal no representa el volumen total de la lesión. El área desmielinizada se puede medir en cada sección transversal consecutivo del nervio para deducir el volumen de la lesión mediante el uso de la reconstrucción tridimensional. Hemos demostrado una fuerte correlación entre el retraso de latencia y volumen de la lesión utilizando este modelo en nuestros estudios anteriores y no había VEP retardo de latencia en los controles inyectados con solución salina 5.
Se cree que los componentes VEP principios siguientes a la iluminación del flash son más estables 7 5. Por lo tanto, se recomienda que la latencia N1 se debe utilizar para el análisis de datos y para el monitoreo VEP longitudinal para evaluar el impacto de las terapias remielinizantes. La amplitud de los VEP, aunque más variable en comparación con la latencia, es más indicativo de la función de los axones en el nervio óptico 6. Escalamiento basado en Electroencefalograma puede ser considerado para el análisis de amplitud 9.
Figura 1. VEP retraso después de la inyección del nervio óptico. Representante VEP traza de una rata individual antes y 2 días después de la microinyección nervio óptico (0,8 l lisolecitina). Grabaciones VEP se repitieron en el cada día (rastros intra sesiones son espectáculon en el mismo color) para demostrar la reproducibilidad de este protocolo de grabación VEP. (Barra de escala vertical: 10 mV; barra de escala horizontal: 10 ms). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La desmielinización en el nervio óptico. Sección transversal Representante del nervio óptico de la rata después de lisolecitina microinyección. El componente de la mielina se tiñe azul utilizando luxol azul rápido. Una pequeña lesión focal de la desmielinización se puede ver en el centro de la sección. Área desmielinizada se puede medir en longitudinales secciones transversales de serie para estimar el volumen de la lesión en una escala de tres dimensiones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Instituto de Investigación Oftalmológica de Australia (ORIA). Agradecemos Prof. Algis Vingrys y el Dr. Explosión Bui, Universidad de Melbourne, por principio nos ayuda a desarrollar la técnica de grabación VEP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
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