Protocol
О себе Этика: Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с австралийским Кодекса практики по уходу и использованию животных для научных целей и принципов в заявлении ARVO для использования животных в офтальмологических и Vision Research, и были одобрены Комитет по этике Животное Macquarie University.
1. ВЭП Электрод Имплантация
- Обезболить животное с внутрибрюшинной инъекции кетамина (75 мг / кг) и медетомидина (0,5 мг / кг).
Примечание: После индукции анестезии, наблюдать рефлексы отмены (щепотка испытаний, роговицы и глазная рефлекторные и т.д.) и их отсутствие как признак, чтобы начать операцию. Постоянно следить животных на протяжении операции и управлять дополнительной обезболивающий препарат (10% от начальной дозы кетамина на топ-Up), если рефлексы присутствуют. Взрослые крысы (> 12 недель) используют в опытах. - Бритье кожи операционного поля.Поместите животное на площадку потепления (37 ° C), чтобы поддерживать температуру тела во время операции. Подготовьте кожу через местного применения повидон-йода. Применить хирургического драпировки. Применить актуальные глазной мази, чтобы предотвратить сухость роговицы под общим наркозом. Поддерживать асептики, используя стерильные инструменты.
- Сделайте продольный разрез кожи по средней линии кожи головы. Снимите соединительную ткань, чтобы достичь правильной экспозиции черепа.
- Осторожно, просверлить небольшие отверстия заусенцев вручную с помощью микро ручная дрель на 7 мм за темя и 3 мм сбоку от средней линии.
- Имплантаты винтовые электроды через череп в коре головного мозга (область 17), проникающие в кору на глубину около 0,5 мм. Имплантат опорный винт электрода на мм ростральной средней линии 3 к темени. Применить зубной цемент накрыть и исправить винты (не всегда обязательно).
- Шовный кожу головы, управлять мазь с антибиотиком на кожу и позволяют животному ReCoвер от наркоза на потепление площадку.
Примечание: В качестве альтернативы, электроды могут быть оставлены открытыми, так, чтобы кожа не должны быть возобновлено в каждой записи. Сразу же после прекращения операции, но до анестетика восстановления, управлять нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) (если не вводят до операции) или опиоидного анальгетика. не Монитор животных постоянно до полного восстановления от анестетика и полностью амбулаторно. - Позвольте по крайней мере 1 неделю животные, чтобы оправиться от операции до записи ВЭП.
2. Зрительный нерв впрыска
- Обезболить животное, подготовить кожу и применять драпировки, как описано выше (1,1 и 1,2).
- Сделайте 1 до 1,5 см разрез в приведенном выше орбиты случайно выбранных кожей вокруг глаз. Откройте подкожной ткани, чтобы достичь орбитального полость, используя тонкие ножницы радужной оболочки глаза. Откройте конъюнктиву и передней капсулы шип под операционным микроскопом.
- Уберите экстраокулярноймышцы и intraobital слезных желез подвергать примерно 3 мм длины зрительного нерва. Откройте Dura и паутинной материи слои вокруг зрительного нерва в продольном направлении с помощью глазной лезвие.
- Вставьте стеклянную пипетку в зрительном нерве на расстоянии 2 мм кзади от шара. Стекло микропипетки крепится с помощью шприца Гамильтона.
- Вводят 1% лизолецитин (0,4 - 1,0 мкл, 0,02% голубой Эванса, который не имеет воздействия на миелинизации) медленно в нерве приблизительно в течение 30 секунд.
- Шовный разрез кожи. Применить мазь с антибиотиком, чтобы предотвратить инфекцию. Попутчики глаза могут быть поданы как внутреннего контроля для электрофизиологии записей.
- Поместите животных на площадку потепления, чтобы оправиться от наркоза.
3. Запись ВЭП
- Обезболить животное и подготовить кожу 1.1 и 1.2.
Примечание: более низкие дозы анестетиков могут быть использованы для электрофизиологического RECOВИДЕОЗАПИСЬ (кетамин 40 мг / кг и медетомидин 0,25 мг / кг). - Поместите крысу в темной комнате и дайте ему адаптироваться к темноте в течение 5 - 30 мин. В некоторых случаях крысы могут быть соответственно адаптируются к темноте O / N для скотопического или света, адаптированной для дневного ЗВП записей 8.
- Поддержание температуры тела при 37 ± 0,5 ° С по homoeothermic системы офсетного с ректального термометра зонда.
- Разбавить учеников с 1,0% тропикамид глазные капли. Откройте кожу над черепом, чтобы получить доступ к предварительно помещают в точке винтовых электродов.
- Подключите болт на противоположной зрительной коры вынужденного глаза и опорного винта к усилителю. Вставка игольчатым электродом в хвост, как на землю. Измерьте и поддерживать импеданса электрода ниже 5 кОм.
- Поместите мини-Ganzfeld стимулятор непосредственно на кожу вокруг век, чтобы обеспечить превосходную изоляцию глаз 7. Освещение стимулятора необходимо калибровать заранеепо фотометр.
- Доставка фотостимуляция через световых вспышек в 100 раз при частоте 1 Гц, с низким и высоких настройках полосовой фильтр на 1 и 100 Гц, соответственно. Частота дискретизации сигнала на 5 кГц.
Примечание: сигналы должны быть выбраны по крайней мере, около 250 - 300 Гц, чтобы гарантировать, что более, что два образца, собранные в ходе каждого цикла. - Шовный кожу назад и держать животных на площадку потепления, чтобы оправиться от наркоза. Запись может быть повторно записана на отдельных животных, чтобы контролировать функциональные изменения в течение определенного периода времени.
- В конечной точке, управлять передозировки инъекции пентобарбитона натрия (100 мг / кг, внутрибрюшинно), чтобы усыпить животное. Подтвердите эвтаназию по сердца, остановка дыхания и снижения температуры тела.
4. Подготовка ткани и гистологии
- Удалить зрительные нервы от эвтаназии животных под микроскопом и фиксировать ткани в 1% параформальдегидом O / N. <LI> Вымойте ткань тщательно физиологическим раствором. Лечить ткани в автоматическом процессора ткани и вставлять в парафин. Срезанные секции (5 - 10 мкм) с использованием роторного микротома.
- Инкубируйте разделы в 0,1% растворе быстрого голубого, такие как Luxol (в 95% этаноле) O / N при 56 ° С. Различают разделы в 0,05% карбоната лития в течение 30 сек, а затем 70% -ным этанолом в течение еще 30 сек. Наконец, контрастное в 0,1% -ном растворе крезил фиолетовым в течение 30 сек перед установкой секций. Используйте быстрый синий окрашивание для выявления миелин в зрительном нерве 5.
Примечание: Для иммуногистохимического исследования, исправить ткани в 1% параформальдегида, промывают солевым раствором и инкубировать с 30% сахарозы O / N. Вставить ткани в ОСТ вложение среды и сделать криосрезы помощью криостата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воспроизводимые Сессионные ЗВП следы показано на рисунке 1, и значительная задержка в N1 ожидания можно увидеть после зрительного нерва инъекции. Частичные зрительного нерва поражений демиелинизации можно наблюдать на гистологических срезах с помощью Luxol быстрый синий окрашивание 5. Рисунок 2 показывает характерный участок с небольшим фокусным демиелинизированные поражения в центре зрительного нерва. Обратите внимание, что сечение не представляют общий объем поражения. Демиелинизированные площадь может быть измерена на каждом последовательном поперечного сечения нерва, чтобы вывести объем поражения с помощью трехмерной реконструкции. Мы показали сильную корреляцию между задержкой задержки и объема поражения, используя эту модель в наших предыдущих исследованиях и не было ВЭП задержка задержка в засоленных впрыском управления 5.
Считается, что первые компоненты VEP следующие флэш освещения являются более стабильными 7 5. Следовательно, мы рекомендуем Задержка N1 должны быть использованы для анализа данных и для продольной мониторинга ВЭП в оценке воздействия remyelinating лечения. Амплитуда ЗВП, хотя более изменчивым по сравнению с задержкой, больше свидетельствует о функции аксонов в зрительном нерве 6. Электроэнцефалограмма основе масштабирования можно считать для амплитудного анализа 9.
Рисунок 1. ВЭП задержка после инъекции зрительного нерва. Представитель ВЭП следы от индивидуальной крысы до и 2 дня после зрительного нерва микроинъекции (0,8 мкл лизолецитину). ЗВП записи были повторены на каждый день (Внутрисессионные следы шоун в тот же цвет), чтобы продемонстрировать воспроизводимость этого протокола записи ВЭП. (Вертикальный масштаб бар: 10 мкВ; горизонтальная шкала бар: 10 мс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Демиелинизация в зрительном нерве. Представитель сечение зрительного нерва от крыс после лизолецитин микроинъекции. Компонент миелин окрашивали синим с помощью Luxol быстрый синий. Небольшой фокусное поражение демиелинизации можно видеть в центре секции. Демиелинизированные площадь может быть измерена на продольных серийных поперечных сечений для оценки объема поражения в трехмерном масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано глазной научно-исследовательского института Австралии (Ория). Мы благодарим профессора Альгис Vingrys и Д-р Бэнг Буй, Университет Мельбурна, для первоначально помогает нам развивать записи технику ВЭП.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
