Summary

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Published: October 21, 2015
doi:

Summary

Kraniyofasiyal kemiklerin Hücre organizasyonu uzun öne sürülmüştür ancak doğrudan görüntülenmiştir olmamıştı. Çok spektral hücre etiketleme ve in vivo canlı olarak Görüntüleme Zebra balığı alt çene dinamik hücre davranışı görselleştirme sağlar. Burada, biz detay protokolü Zebrabow transgenik balık işlemek için doğrudan hücre ardalanması ve Meckel kıkırdak kondrosit morfolojik değişiklikleri gözlemek.

Abstract

Omurgalı kraniofasial yapıların geliştirilmesi hücre göçü, çoğalması, yapışma ve farklılaşma hassas koordinasyon gerektirir. Meckel kıkırdağı, birinci farengeal kemer türevinin, bir Desenlendirme kranial nöral krest (CNC) hücrelerin göçünü ve ilerici bölümleme, çoğalmasını ve farklılaştırılmış kondrositlerin organizasyonunu gerektirir. Çeşitli çalışmalar alt çene morfolojilerinden sırasında CNC göç tarif, ama kondrositler Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı organizasyonu gerçekleştirmek nasıl ayrıntıları belirsizliğini korumaktadır. Sox10 kısıtlı ve kimyasal olarak neden olunan Cre rekombinaz aracılı rekombinasyon ve böylece ayrı bir klonal popülasyonları yansıtan progenitör hücrelerin ve bunların soyu bir multi-spektral etiketleme oluşturma farklı floresan protein (RFP, YFP ve CFP) PERMÜTASYON oluşturur. Konfokal zaman atlamalı fotoğraf kullanarak, kıkırdak gözlemlemek mümkündür Behaviya Zebra balığı Meckel kıkırdak gelişimi sırasında.

Çok bantlı cep etiketleme Meckel kondrosit uzantısı göstermek için bilim adamları sağlar. Çene prefigures Meckel kıkırdağı, uzatma aşamasında, kondrositlere onlar organize bir tek hücreli katmanlı satırda yığını olarak uzantısı etkileyecek enterkale. Hücre uzantısı aracılık etmek, bu örgütlü interkalasyon sürecinin başarısızlığı biz çene malformasyonlar gözlemlediğimiz hipoplastik mandibula için hücresel mekanistik açıklama sağlar.

Introduction

Kraniyofasiyal gelişme hücre çoğalması, göç ve farklılaşma 1,2, 3 sürücü karmaşık moleküler, hücresel ve doku etkileşimleri gerektirir. Bu sıkı regüle ve karmaşık bir süreç kraniofasial deformiteler en yaygın doğum anomalileri 1-9 arasında olacak şekilde genetik ve çevresel pertürbasyonlar tabidir. Cerrahi girişimler geliştirme temelini anlamak, kraniofasyal anomaliler için tedavinin temelini kalırken gelecek tedaviler yenilik şarttır. Bu nedenle, yakınsama ve uzatma ve hücre entegrasyonu morfolojilerinden ve mekanizmaları okuyan kraniofasyal iskeletin 1 oluşumuna yepyeni bakış açıları sağlar.

Kranial nöral krest geçirmek ve birinci faringeal kemer çene prefigures Meckel kıkırdağı, oluşturmak için uzatmak, daha sonra eşleştirilmiş formu mandibular süreçler doldurmak. Morphogenesis oMeckel kıkırdağı f yönlü çoğalması, hücre kutuplaşma ve farklılaşma 1,10 üzerinden kondrosit organizasyon gerektirmektedir. Ancak, Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı kondrosit örgütünün karışıklık belirsizliğini koruyor. Dinamik hücre davranışını anlamak gibi hipoplastik mandibula fenotipleri 11 olarak çene boyutu, etkileyen konjenital anomali anlamak için çok önemlidir.

Zebra balığı embriyolar Meckel kıkırdağı morfolojilerinden ayrıntılı çalışma için birçok gelişimsel ve genetik avantajlar sunuyoruz. Onların genetik tractability, şeffaflık, ex vivo ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme 6 hücre hareketi ve organizasyon gözlem için iyi kredi güçlü avantajları vardır. Böyle sox10 olarak soy-tracing araçları kullanarak: kaede transgenik çizgi, biz ve diğerleri embriyonik kraniofasyal iskeletin 1,5 nöral krest kökenlerini tasvir var. Usiubi ile ERT2-Cre: sox10 ng Zebrabow-M transgenik hat, bu Kraniofasiyal gelişimi sırasında hücresel hareketlerin ayrıntılarını keşfetmek için artık mümkün. Zebrabow-M, farklı flüoroforlar ifadesini süren ubikuitin promotörü, Lox sitelerinin 8 tarafından sınırlanan her biri ile tasarlanmış bir transgenik bir çizgidir. Zebrabow-M varsayılan fluorofor RFP ifade Kırmızı. Cre ifade indüksiyon sonrasında Zebrabow-M birleşir inşa ve hücreler embriyo çoklu spektral ifade oluşturarak farklı fluorophores (RFP, OBP ve YFP) birleşimini ifade eder. Farklı yan yana atalarıdır kaynaklandığını hücre popülasyonları klonal etiketli böylece rekombinasyon olaydan sonra etiketli hücrelerden bölmek Tüm kızı hücreleri daha sonra klonal, etiketli. Bu klonlama hücre etiketleme ile klonal çözünürlüğe sahip hücre proliferasyon ve migrasyon (Şekil 1 ve 2) takip edilebilir.

Protocol

Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokol numarası # 2010N000106 altındaki tüm prosedürleri onayladı. Bu değerlendirme ve laboratuvar Animal Care International (AAALAC) rehberlerin Akreditasyon Derneği ile uyumludur. 1. Reaktifler ve Malzeme Hazırlanması 50X E3 embriyo orta 1 L hazırlayın (Tablo 2 bakınız) (Bakınız Tablo 1) ve 1X E3 embriyo orta 1 L hazırlar. 1X E3 1 L pr…

Representative Results

Bütün montaj Alsiyan mavi lekeler Geleneksel kıkırdak görselleştirme gelişmekte Meckel kıkırdağı gözlemleyerek ve yaygın olarak nihai hücresel organizasyonu 12 (Şekil 1A) görselleştirmek için kullanılan çok değerli olmuştur. Ayrıca soy sox10 kullanarak izleme, fazla mesai gelişen kıkırdak analiz etmek için: Kaede transgenik çizgiler, canlı embriyolar 2,12 (Şekil 1B) hücre göçü, yakınsama ve uzatma çalışma sağ…

Discussion

Yukarıdaki birbirini tamamlar açıklandığı gibi alcian mavi ve photoconvertible transgenik hatları kıkırdak ve kemik gelişimi karmaşık sürecini tanımlamak için kullanılır. Ancak, organogenezis sırasında canlı hücre göç ve organizasyon uzun hipotez ve dolaylı olarak gösterdi ama görüntülenmiştir asla edilmiştir. Bir kıkırdak Belirli Cre ile birleştiğinde Zebrabow-M transgen doğru, kemik ve kıkırdak oluşumunda yer, tüm bu olayların eş zamanlı canlı gözlem izin verir. Bu teknik mi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar nazik balık imkan ve çizgilerin mükemmel bakım için Zebrabow-M transgenik çizgi, pDEST vektör için Geoffrey Burns ve Renee Ethier-Daigle paylaştığınız için Alex Schier teşekkür ederiz.

FİNANSMAN:

Biz Çocuklar için Shriners Hastaneleri Çocukları (ECL) ve post-doktora eğitimi bursları için NIDCR RO3DE024490 ve Shriners Hastaneleri cömert fonlama desteği (LR ve YK) için minnettarız.

Materials

Pronase Roche Life Sciences 10165921001 Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0262
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7619
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
4-HydoxyTamoxifen Sigma-Aldrich T176
24 x 60 coverslips Fisher Scientific 12-548-5P
18 x 18 coverslips Fisher Scientific 12-540A
25 x 25 coverslips Fisher Scientific 12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit Life technologies  K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit  Life Technologies K2400-20
pENTR3'-pA Tol2Kit 302
pDEST Gift from Geoffrey Burns labs
Equipments
Bright field microscope 
Fluorescent microscope 
Confocal microscope
Image processing software

References

  1. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
  2. Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
  3. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  4. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
  5. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
  6. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
  7. Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
  8. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  9. Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
  10. Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
  11. Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
  12. Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
  13. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).

Play Video

Cite This Article
Rochard, L. J., Ling, I. T., Kong, Y., Liao, E. C. Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel’s Cartilage. J. Vis. Exp. (104), e52935, doi:10.3791/52935 (2015).

View Video