Introduction
De transcriptiefactor Nurr1 en homologen (Nur77 en Nor1) behoren tot de nucleaire receptor subfamilie 4A (NR4A) 1. Ze zijn ook weesreceptoren omdat hun endogene liganden nog niet zijn geïdentificeerd. Nurr1 werd eerst gekloneerd in 1992 en hoewel bekend is tot expressie in de hersenen 2, werd de essentiële rol voor de ontwikkeling en instandhouding van middenhersenen dopamineneuronen blijkt uit knockout muizen studies 3. Daarnaast werd de belangrijke rol voor het behoud van middenhersenen dopamineneuronen onlangs aangetoond door een conditionele knockout studie 4. Door deze elegante studies tonen Nurr1 kritische rol voor middenhersenen dopamine neuronen, zijn vele verdere studies grotendeels gericht op het dopaminesysteem neuronen en dopamine-gerelateerde neurodegeneratieve stoornis, ziekte van Parkinson (PD) 5.
Met name Nurr1 zich niet alleen in de middenhersenen dopamine (MDA) neuronen, maar ook in divers hersengebieden 2, suggereert dat het functionele rol in veel niet-DA gebieden die sterk wordt ondersteund door recente studies aantonen dat Nurr1 speelt een belangrijke rol in diverse hersenfuncties kan hebben. Voor voorbeelden werd aangetoond dat geheugen inducerende activiteiten zoals leren of andere hippocampus-afhankelijke taken resulteert in opwaartse regulatie van Nurr1 expressie in de hippocampus 6,7. Bovendien neerhalen van Nurr1 expressie in de hippocampus was de houdbaarheid op lange termijn geheugen en / of synaptische plasticiteit 8-11 aantasten, wat sterk suggereert dat Nurr1 speelt diverse rollen in verschillende hersengebieden. Dus, met als doel de celtype-specifieke en subcellulaire expressie van Nurr1, is het wenselijk Nurr1-specifieke antilichamen die geen kruis-reactiviteit vertonen met homologen Nur77 of Nor1 gebruiken. Dit artikel beschrijft een pre-adsorptie protocol om Nurr1-specifieke antilichamen en presenteren aanvullende gegevens toont zijn specificiteit te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: De samenstelling van alle hieronder genoemde oplossingen kunnen worden gevonden in de Materials / Equipment Table.
1. Proteïne A kolom antilichaamzuivering
- Equilibreer een proteïne A-kolom spin en alle benodigde buffers tot kamertemperatuur gedurende 15 min voor het begin van de procedure.
- Verdun het immune serum 1: 1 met Protein A IgG Binding Buffer. (5 ml serum wordt aanbevolen).
- Tik voorzichtig een proteïne een spin-kolom op de bank boven naar elke hars die in de dop kan worden ingediend verjagen. Verwijder de dop en voorzichtig snap de bodem sluiting. Plaats de kolom in een 15 ml collectie buis en laat opslagoplossing uitlekken.
- Voeg 5 ml Proteïne A IgG bindingsbuffer en laat de oplossing uitlekken.
- Breng het verdunde immune serum op de kolom en verzamel de doorstroom. Voor het beste resultaat, voeg een monstervolume dat een concentratie van antilichamen bevat minder dan 80% van de antilichaambinding capacit de kolomy.
- Was de kolom met 15 ml Proteïne A of IgG bindingsbuffer totdat de absorptie bij 280 nm lager is dan 0,1.
- Voeg 100 pl neutralisatiebuffer vijf gemerkte verzamelbuizen.
- Voeg 5 ml IgG Elution Buffer aan de Proteïne A-kolom en het verzamelen van 1 ml fracties in elk van de buizen met de 100 ui Neutralisatie Buffer.
- Meet de absorptie van elke fractie bij 280 nm en een zwembad fracties met een absorptie van meer dan 0,5. Houd de samengevoegde fracties op ijs pas klaar voor dialyse.
- Regeneratie van de kolom door toevoeging van 8 ml IgG Elution Buffer en laat de oplossing door de kolom.
- Spoel de kolom met Proteïne A IgG bindoplossing tot eluens pH weer 7,4.
- Sla de kolom door toevoeging van 5 ml opslagoplossing (0,02% natriumazide in PBS). Bij benadering 3 ml blijven de kolom cap bodem en zet het bovendeksel. Bewaar de kolom bij 4 ° C.
- Bepaal de lengte of dialyseslang naar behoefte volgens de instructies van de fabrikant. Met behulp van 16 mm diameter platte buis gebruiken 5.47 cm van de buis lengte per ml oplossing worden gedialyseerd. Snij de buis en spoelen met PBS pH 7,4 gedurende 15 tot 30 min.
- Vouwen en clip ene uiteinde van de dialyse tubing, breng de samengevoegde IgG-bevattende fracties dialyseslang geëquilibreerd in PBS pH 7,4 en sluit het andere uiteinde.
- Dialyseer bij kamertemperatuur tegen 200 volumina PBS pH 7,4 gedurende 2 uur.
- Wijzig de dialyse buffer (vers PBS pH 7,4) en dialyze nog eens 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Wijzig de dialyse buffer (vers PBS pH 7,4) en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Houd de gedialyseerde antilichaam oplossing bij 4 ° C tot klaar om de vereiste zuiveringsstappen.
- Beoordeel de antilichaamconcentratie met behulp van de absorptie bij 280 nm en de molaire absorptiecoëfficiënt van antilichamen bij 280 nm van 210.000 M -1 cm -1 12.
2. Koppeling van LBD eiwitten AminoLink Coupling Resin
- Bereid twee kolommen, een voor Nor1 en de andere voor Nur77. Volg hetzelfde protocol voor beide eiwitten.
- Ontdooi de eiwitten te koppelen aan de hars op ijs. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt en de absorptie ervan bij 280 nm 12.
- Alternatief, gebruik dan een eiwitbepaling assay zoals de bicinchoninezuur assay 13. Wanneer het eiwit wordt opgelost in een amine bevattende buffer dialyseren of bufferuitwisseling tegen de koppelingsbuffer. Wanneer het eiwit in een geschikte buffer (geen vrije amines) verdunnen 4-voudig in koppelingsbuffer.
- Gebruik 2 ml hars gedurende 2 mg eiwit. Alle stappen die volgen zijn voor 2 ml hars in een kolom 10 ml. Maximaal 10 mg eiwit worden gekoppeld per 1 ml hars (2 ml 1: 1 suspensie).
- Bereid een 10 ml kolom door op een frit op de bodem en actief PBS pH 7,4 doorheen. Cap tHij bodem van de kolom en voeg 2 ml koppelingsbuffer.
- Het gewenste volume van slurry (4 ml tot 2 ml hars) te verkrijgen aan de kolom, de onderste dop en laat de kolom drain. Spoel de kolom met in totaal 6 ml (3 hars-bedvolume) van koppelingsbuffer en laat de kolom uitlekken. Na de koppeling buffer is uitgelekt, vervangt de onderste dop.
- Voeg 2-4 ml eiwit gesuspendeerd in koppelingsbuffer aan de kolom (houd een aliquot van de eiwitoplossing om de koppeling efficiëntie te evalueren door vergelijking van de eiwitconcentratie van het eluaat in stap 2,11 met behulp van de absorptie bij 280 nm of bicinchoninic assay) . Cap en meng uiteinde over uiteinde om een homogene oplossing te hebben.
- Weeg een lege 1,8 ml microcentrifugebuis en te verplaatsen naar de zuurkast. Overdracht NaCNBH3 (ongeveer 0,05 g) voorzichtig in de vooraf gewogen buizen. Sluit de buis en wegen van de buis met NaCNBH3. Laat de buis niet openen buiten de motorkap.
- Gebaseerd op het gewicht vanNaCNBH3 overgebracht naar de buis maakt een 5 M door toevoeging van 1 M NaOH. Het molecuulgewicht van NaCNBH3 is derhalve 62,84 g 0,05 g gelijk is aan (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 mol) 7,96 x 10 -4 mol. Om een 5 M oplossing add (7,96 x 10 -4/5) 159 pi van 1 M NaOH te maken.
- Meet het totale volume van de reactie van het nemen van de hars volume in aanmerking. Voeg 10 pl van 5 M NaCNBH3 per ml reactiemengsel.
- Bijvoorbeeld: voor een 4 ml reactievolume voeg 40 ul 5 M NaCNBH3. Voor 1 ml hars en 3 ml eiwit toegevoegd, het totale volume 4 ml.
- Cap de kolom en meng uiteinde over einde. Bevestig de kolom op een buis rotator en laat de reactie doorgaan gedurende de nacht bij 4 ° C.
- In de ochtend, brengen de kolom aan de chemische motorkap en verwijder voorzichtig de dop zoals sommige gas kan hebben gevormd. Giet de kolom in een schone buis en sla het eluaat om het eiwit con metencentrering met de absorptie bij 280 nm werkwijze 12 of bicinchoninezuur assay en vergelijken met het uitgangsmateriaal eiwitconcentratie in stap 2.6.
- Was de hars met 4 ml koppelingsbuffer en laat de kolom drain.
3. Blokkering Resterende Sites
- Was de hars met 4 ml buffer van quenching. Giet af en vervang de onderste dop. Voeg 2 ml buffer doven en de hars te schorten.
- Het totale reactievolume beoordelen door het meten van het volume hars en het doven buffervolume voeg 10 pl van 5 M NaCNBH3 per ml reactievolume.
- Meng voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 30 min end-over-end. Na 30 min, brengt de kolom in de zuurkast. Verwijder voorzichtig de bovenkant en verwijder de onderste dop en laat de kolom drain in een verspilling buis.
- Was de kolom met 5 hars volumes wasoplossing. Controleer de wast de aanwezigheid van residuele eiwitten door meting abso het eluaat vanrbance bij 280 nm. Ontkoppelde eiwitten uit zijn gewassen door de hoge zoutconcentratie.
- Was de hars met 6 ml ontgast PBS pH 7,4 dat 0,02% natriumazide. Houd de kolom bij 4 ° C totdat het nodig is.
4. Zuivering van specifieke antilichamen Nurr1
- Spoel de Nur77 LBD combinatie kolom met 10 ml PBS pH 7,4 en laat de kolom drain. Cap de bodem van de kolom en plaats de uitgelekte Nur77 LBD gekoppelde kolom in een nieuwe 15 ml verzamelbuis.
- Voeg 5 ml proteïne A gezuiverde anti-Nurr1 antilichamen cap de kolom en plaats op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de bovenste en onderste kappen en laat de stroom door. Gereserveerd op ijs tot klaar om toe te voegen aan de Nor1 LBD gekoppeld kolom.
- Spoel de Nor1 LBD combinatie kolom met 10 ml PBS pH 7,4 en laat de kolom drain. Cap de bodem van de kolom en plaats de Nor1 LBD gekoppelde kolom in een 15 ml verzamelbuis.
- Voeg de doorstroming van het Nur77 LBD coupLED kolom cap de kolom en plaats op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de bovenste en onderste kappen en laat de stroom door.
- Meet de antilichaamconcentratie door meting van de absorptie bij 280 nm.
5. ELISA-gebaseerde analyse van gezuiverde anti-Nurr1 Antibody
- Voeg 100 ul proteïne (2,5 ug / ml) aan de putjes van een 96 putjesplaat. Bij testen 3 verschillende eiwitten, voeg 100 pl proteïne 1 aan putjes A1 H4, 100 pl proteïne 2, putjes A5 H8 en 100 pl proteïne 3 aan putjes A9 tot H12. Bedek de plaat en incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Was de beklede putjes tweemaal met 300 ul per putje van PBS pH 7,4 en voeg 300 ul van ELISA blokkeerbuffer het gehele antigeen beklede putjes en incubeer 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Terwijl de plaat blokkeert stelt een gewenste startpositie verdunning van gezuiverd anti-Nurr1 antilichaam (van 10 tot 100 ug / ml) in ELISA blokkerende buffer.
- Na 2 h blokkering vervangen ELISA blok buffer met 100 pl vers ELISA blokbuffer aan alle putjes.
- Voeg 100 gl verdunde gezuiverde anti-Nurr1 antilichaam aan alle putjes in rij A. In serie verdunde antilichamen door overdracht 100 pi oplossing van rij A in de putjes in rij B, gevolgd door overdracht 100 pi oplossing van rij tot rij B C voortzetting naar G. rij na het mengen van de oplossingen in de putten in rij G gooi de extra 100 ul. Wells in rij H ontvangt alleen de eerste 100 ul van het blokkeren van buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was de plaat drie (3) maal met 300 ui per putje van 0,05% Tween 20 in PBS pH 7,4 en dep de plaat om overmaat wasbuffer te verwijderen.
- Voeg 100 ul van Horse Radish Peroxidase (HRP) geconjugeerd geit anti-konijn IgG verdund in ELISA blok buffer (1: 8000 verdunning; typische bereik is van 1: 5000 tot 1: 25.000). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was de plaat three (3) keer zoals beschreven in 5.6. Spoel alle wells door ze te vullen met 300 pl gedeïoniseerd water. Dep het overtollige water door het omkeren van de plaat op absorberend papier.
- Voeg 100 ul van 3, 3 ', 5, 5' tetramethylbenzidine (verwarmd tot kamertemperatuur) aan alle putjes en incubeer 15-30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Stop de reactie door toevoeging van 50 ui 2 NH 2 SO 4.
- Lees absorptie bij 450 nm af te trekken achtergrond bij 650 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een vergelijking van proteïne A-kolom gezuiverd Nurr1-specifieke antilichamen met proteïne A gezuiverde anti-Nurr1 antilichamen, gevolgd door het door Nur77 LBD en Nor1 LBD kolommen in figuur 1. Zoals blijkt, proteïne-A gezuiverde Nurr1 antilichaam vertoonde een sterke binding om Nurr1 LBD. Toch bleek ook significante binding aan Nur77 LBD en Nor1 LBD. Als eiwit-A gezuiverde Nurr1 antilichamen werden verder gezuiverd met Nur77 LBD en Nor1 LBD, de uiteindelijke affiniteit gezuiverde antilichamen die Nurr1 vertoonden specifieke binding aan Nurr1 LBD met detecteerbare binding aan Nur77 LBD of Nor1 LBD, waaruit blijkt dat de kruisreactiviteit voor Nur77 en Nor1 was volledig verwijderd.
Deze specificiteit werd verder aangetoond door Western blot analyse van uittreksels uit CHO-cel getransfecteerd met expressievectoren dragen volledige lengte Nurr1, Nor1 of Nur77 gefuseerd met MYC tagging eiwit (Figuur 2). Zoals verwacht, anti-myc ANTIBOdies bleek dat elk eiwit van volledige lengte tot expressie werd gebracht op het verwachte molecuulgewicht. In overeenstemming met de ELISA resultaten, eiwit-A gezuiverd Nurr1 specifiek antilichaam robuust gedetecteerd full-length Nurr1 maar ook gedetecteerd Nor1 en Nur77 hoewel minder efficiënt. Daarentegen vertoonde de volledig gezuiverde Nurr1 antilichaam geen detecteerbare kruisreactiviteit voor Nor1 en Nur77 vertonen door ELISA of Western blot analyses.
Tenslotte werd de volledig gezuiverde Nurr1 antistof gebruikt voor immunohistochemische analyse MDA neuronen. Het is goed gedocumenteerd dat Nurr1, maar niet zijn naaste homologen Nor1 en Nur77, is prominent uitgedrukt in knaagdieren en menselijke MDA neuronen zowel mRNA en eiwit niveaus 14,15. Het gebruik van de volledig gezuiverde Nurr1 antilichaam bevestigde dat Nurr1 bijna uitsluitend tot expressie gebracht in de kern van MDA neuronen in de substantia nigra gebied (figuur 3).
Figuur 1: ELISA vergelijking van kruisreactiviteit van anti-Nurr1 antilichamen voor en na zuivering door het door Nur77 en Nor1 LBDs gekoppelde kolommen proteïne A gezuiverde anti-Nurr1 antilichamen (0,156 ug / ml) (a) of eiwit A gezuiverd gevolgd door. chromatografie op Nor1 en Nur77 LBD-gekoppelde kolommen anti-Nurr1 antilichamen (0,156 ug / ml) (b) werden toegevoegd aan wells van 96 well plaat bekleed met 100 pl van 2,5 ug / ml van ofwel Nurr1 LBD, Nor1 LBD of Nur77 LBD. De ELISA werd uitgevoerd zoals beschreven onder methode.
Figuur 2: Specifieke detectie van full-length Nurr1 expressie gebracht in CHO-cellen De volledig gezuiverde Nurr1 antilichaam Full-length Nurr1, Nor1 en Nur77 eiwitten werden als myc gelabeld.fusie-eiwitten in CHO-cellen en gedetecteerd met Myc specifieke antilichamen (a) proteïne-A gezuiverde Nurr1 antilichaam (b), en volledig gezuiverd Nurr1 antilichaam (c). Anti-actine antilichamen voor eiwitten ladingcontrole (d). Elk Myc-tagged volledige lengte DNA (molecuulgewicht van 65, 66 en 69 kDa voor Nurr1, Nur77, Nor1 respectievelijk) werd tijdelijk getransfecteerd in CHO-cellen en evenveel celextracten werden geladen in elke baan. Laan 1: negatieve controle bestaande uit CHO-cellen extracten getransfecteerd met een lege vector; laan 2: Myc-Nurr1; laan 3: Myc-Nur77; laan 4: Myc-Nor1.
Figuur 3:. De volledig gezuiverde Nurr1 antilichaam specifiek tyrosine-hydroxylase-positieve dopamineneuronen detecteert Midbrain dopamine neuronen in de substantia nigra positief voor Nurr1, zoals examined door immunohistochemie De volledig gezuiverde Nurr1-specifieke antilichamen. Met name Nurr1 was gelokaliseerd in de kern MDA neuronen. TH (tyrosine hydroxylase). Schaal bar = 100 micrometer. Schaal bar in witte doos merge is 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het succes van dit protocol is gebaseerd op de beschikbaarheid van zuivere eiwitten voor karakterisering van de antilichamen opgewekt tegen een specifiek lid van de eiwitfamilie plaats. Er is geen noodzaak om de antilichamen onder gebruikmaking van proteïne A / G totdat duidelijk is vastgesteld dat er significante kruisreactiviteit met ELISA en Western blotting zuiveren.
Zoals in de tekst, is het belangrijk om te voorkomen suspenderen het eiwit (en) worden verknoopt aan de kolom in een amine bevattende buffer zoals Tris en glycine. Verder is de optimale concentratie eiwit dat voor verknoping dient empirisch te worden vastgesteld. Teveel eiwit op de kolom kan leiden tot sterische hindering terwijl er te weinig adsorptie efficiëntie zou verminderen. Het is daarom een goed idee om eiwitconcentraties bereik van 2 tot 10 mg / ml getest en de kwaliteit van de verkregen antilichamen te beoordelen.
Verschillende factoren moeten worden overwogen wanneer this techniek niet aan zeer specifieke antilichamen opleveren. Deze omvatten: verknoping efficiency, verlies van immunoreactieve domein en verknoopt eiwitdenaturatie. Zoals in het protocol controle verknopen efficiëntie kan de vaststelling dat te veel of te weinig eiwit wordt geïmmobiliseerd op de kolom. Indien verknoping via reactieve amines wordt verdacht van het vernietigen immunoreactieve domein (en), immobilisatie via carboxylgroep of met koolhydraten worden overwogen.
Het is van belang de doeltreffendheid van de procedure consequent op zeer specifieke antilichamen. Voor regeneratiedoeleinden moeten de kolommen worden ontdaan van de kruisreactieve antilichamen daaraan gebonden via zware omstandigheden (hoge of lage pH). Dit veroorzaakt een steeds hoger percentage verknoopte eiwitten effectief worden gedenatureerd, waardoor de prestaties van de kolom.
De toevoeging van blokkerende middelen in ELISA en Western blotting wordt vaak gebruikt met een redelijke mate van succes. De in deze video beschreven benadering vergroot de kans op succes en vermindert de noodzaak voor het handhaven van grote hoeveelheden van het kruisreactieve eiwitten op kant. Als de reagentia en werkwijzen om eiwitten te immobiliseren aan chromatografie media blijven verbeteren, zal deze benadering bij aan het identificeren van getransformeerde cellen circulerende antilichamen.
Deze benadering is beperkt door de beschikbaarheid van zuivere eiwitten. Een andere beperking van dit protocol is de afhankelijkheid van juiste vouwing bij gebruik eiwitdomeinen. Als de eiwitdomeinen niet als spatel het geheel eiwit, kan de pre-adsorptie strategie geen antilichamen die gemakkelijk kan identificeren eiwit-lid van belang bij het analyseren cel- of weefselextracten verkregen.
Veel eiwitten van belang tot (sub) families van eiwitten met hoge aminozuursequentiehomologieën. Functionele karakterisering en identiteitcatie van de verdeling van eiwitten vaak afhankelijk van de beschikbaarheid van specifieke antilichamen tegen elk familielid. De hoge aminozuren homologieën tussen eiwit leden van dezelfde familie bij aan de problemen bij het genereren van zeer specifieke antilichamen. Met behulp van deze cross-reactieve antilichamen leiden vaak tot tegenstrijdige resultaten.
Een voorbeeld is de wees nucleaire receptoren Nurr1 die aangesloten is NR4A subfamilie van nucleaire receptoren, alsmede Nur77 en Nor1. Aangezien deze drie factoren delen een hoge mate van aminozuur homologie, antilichamen tegen elke factor tonen significante kruis reactiviteiten, die nauwkeurige analyse van elke factor belemmeren.
Met deze NR4A leden als voorbeeld, was het mogelijk zeer specifieke Nurr1 antilichamen zonder reactiviteiten voor Nor1 of Nur77 genereren. Aangezien de LBDs delen homologie lager dan de DNA bindende domeinen, werd de LBD van elk eiwit tot expressie gebracht en gezuiverd en vervolgens gebruikt om improve de specificiteit van de anti-Nurr1 antilichamen. Aanvankelijk antilichamen tegen Nurr1's LBD tentoongesteld bescheiden maar belangrijke niveaus van kruisreactiviteit aan de andere eiwitten, zoals onderzocht door ELISA en Western blot analyses. Echter, wanneer eiwit-A gezuiverde Nurr1 antilichamen verder werden gezuiverd door middel van pre-adsorptie tegen cross-reactieve LBD domeinen van Nur77 en Nor1, de resulterende Nurr1 antilichaam leverde geen kruisreactiviteit laten zien, zoals onderzocht door Western blot en ELISA analyses van prominent gedetecteerd Nurr1 -expressie DA neuronen in de middenhersenen gebieden. De Western blot data en ELISA analyses nauw met elkaar overeenstemmen, wat aangeeft dat deze analyses complementair zijn en elkaar steunen.
Samengevat zal dit antilichaam zuiveringsstrategie zeer nuttig bij het genereren van een specifiek antilichaam door het elimineren van de kruisreactiviteit van homologe eiwitten leden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
