Introduction
Der Transkriptionsfaktor Nurr1 und seinen Homologen (Nur77 und Nor1) gehören zu der Kernrezeptorfamilie 4A (NR4A) 1. Sie sind auch Orphanrezeptoren weil ihre endogene Liganden noch nicht identifiziert. Nurr1 wurde erstmals 1992 kloniert, und obwohl bekannt ist, im Gehirn 2 ausgedrückt werden, wurde ihre wesentliche Rolle für die Entwicklung und Wartung von Mittelhirnneuronen mit Dopamin-knockout Maus-Studien 3 offenbart. Außerdem wurde seine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Dopamin-Neuronen im Mittelhirn vor kurzem von einem Knockout-Studie 4 gezeigt. Aufgrund dieser eleganten Studien zeigen Nurr1 kritische Rollen für Dopamin-Neuronen im Mittelhirn, viele nachfolgende Untersuchungen weitgehend auf die Dopamin-Neuronen im Mittelhirn und Dopamin bezogene neurodegenerative Erkrankung konzentriert, Parkinson-Krankheit (PD) 5.
Bemerkenswert ist, Nurr1 nicht nur in den Mittelhirn Dopamin (MDA) Neuronen, sondern auch in di ausgedrücktVers Gehirnbereichen 2, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise funktionelle Rolle in vielen nicht-DA Bereichen, die stark durch neuere Studien zeigen, dass Nurr1 spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Hirnfunktionen unterstützt wird. Beispiele wurde wie Lern gezeigt, dass die Speicher-induzierende Aktivitäten oder andere Hippocampus abhängigen Aufgaben ergeben sich im Hochregulierung von Nurr1-Expression im Hippocampus 6,7. Darüber hinaus nach unten von Nurr1-Expression im Hippocampus Klopf war ausreichend, um das Langzeitgedächtnis und / oder der synaptischen Plastizität 8-11 beeinträchtigen, was stark darauf hinweist, daß Nurr1 spielt verschiedene Rollen in vielen Bereichen des Gehirns. Um somit die zelltypspezifisch und subzellulären Expression Nurr1 weiter zu verstehen, ist es wünschenswert, Nurr1-spezifische Antikörper, die keine Kreuzreaktivität gegenüber seinen Homologen oder Nur77 Nor1 nicht aufweisen, zu verwenden. Dieses Papier beschreibt eine Pre-Adsorption-Protokoll, um Nurr1-spezifische Antikörper vorhanden und zusätzliche Daten, die seine Spezifität zu erzeugen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Die Zusammensetzung aller nachstehend genannten Lösungen können in der Werkstoffe / Zubehör Tabelle gefunden werden.
1. Protein A Säule Reinigung der Antikörper
- Äquilibrieren ein Protein, eine Spin-Säule und alle benötigten Puffer auf Raumtemperatur 15 min vor dem Beginn des Verfahrens.
- Verdünne das Immunserum 1: 1 mit Protein A IgG Bindungspuffer. (5 ml Serum wird empfohlen).
- Klopfen Sie leicht ein Protein, eine Spin-Säule auf der Tischplatte, jede Harz, das in die Kappe eingelegt werden können, zu entfernen. Entfernen Sie die obere Kappe und sanft Snap aus dem Bodenverschluss. Legen Sie die Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube und lassen Speicherlösung ablaufen.
- 5 ml Protein A IgG Bindungspuffer und die Lösung ablaufen.
- Übernehmen Sie die verdünnt Immunserum an die Säule und sammeln Sie die Durchströmung. Für beste Ergebnisse, einen Probenvolumen, das eine Antikörperkonzentration als 80% der Antikörper-bindenden capacit der Spalte enthält wenigery.
- Mit 15 ml Protein A-IgG-Bindungspuffer oder bis die Absorption bei 280 nm unter 0,1 Die Säule.
- 100 l Neutralization Buffer zu fünf markierten Sammelröhrchen.
- 5 ml der IgG Elutionspuffer auf Protein A-Säule und Sammeln Fraktionen von 1 ml in jedes der Rohre mit den 100 ul Neutralisierungspuffer.
- Die Extinktion jeder Fraktion bei 280 nm und Poolfraktionen mit einer Absorption von mehr als 0,5. Halten Sie die vereinigten Fraktionen auf Eis, bis sie zur Dialyse.
- Regenerieren die Säule durch Zugabe von 8 ml IgG Elution Buffer und lassen Sie die Lösung durch die Säule fließen.
- Spülen der Säule mit Protein A IgG Bindungslösung, bis die Laufmittel pH wieder auf 7,4.
- Bewahren Sie die Spalte durch Zugabe von 5 ml-Speicherlösung (0,02% Natriumazid in PBS). Wenn etwa 3 ml bleiben in der Spalte, Kappenboden und befestigen Sie die obere Abdeckung. Bewahren Sie die Spalte bei 4 ° C.
- Bestimmen Sie die Länge of Dialyseschlauch nach der Anleitung des Herstellers erforderlich ist. Unter Verwendung von 16 mm Flachrohrdurchmesser verwenden 5.47 cm Rohrlänge pro ml Lösung, um dialysiert werden. Schneiden Sie den Schlauch und Spülen mit PBS, pH 7,4, für 15 bis 30 min.
- Falten und Clip ein Ende der Dialyseschlauch, überweisen Sie den gepoolten IgG enthaltenden Fraktionen in einen Dialyseschlauch in PBS pH 7,4 ins Gleichgewicht gebracht, und schließen Sie das andere Ende.
- Dialyse bei Raumtemperatur gegen 200 Volumina PBS pH 7,4 für 2 Stunden.
- Ändern die Dialysepuffer (frisch PBS pH 7,4) dialysiert und für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur.
- Ändern Sie den Dialysepuffer (frisches PBS pH 7,4) dialysiert und über Nacht bei 4 ° C.
- Halten Sie die dialysiert Antikörperlösung bei 4 ° C, bis bereit, mit weiteren Reinigungsschritten fortfahren.
- Bewertung der Antikörperkonzentration unter Verwendung seiner Absorption bei 280 nm und der molare Absorptionskoeffizient von Antikörpern bei 280 nm von 210.000 M -1 cm -1 12.
2. Kupplung von LBD Proteine, um die Kopplung Resin Aminolink
- Bereiten Sie zwei Spalten, eine für Nor1 und die andere für Nur77. Folgen Sie dem gleichen Protokoll sowohl Proteinen.
- Aufzutauen, dass das Protein an das Harz auf Eis gekoppelt werden. Bestimmung der Proteinkonzentration unter Verwendung seines molaren Extinktionskoeffizienten und seine Absorption bei 280 nm 12.
- Alternativ können Sie einen Proteinbestimmung Assay wie dem Bicinchoninsäure-Assay 13. Wenn das Protein in einer aminhaltigen Puffer dialysiert oder Pufferaustausch gegen den Kopplungspuffer gelöst. Wenn das Protein in einem geeigneten Puffer (keine freien Amine) verdünnen 4fach in Kopplungspuffer.
- Ein 2-ml Harz für 2 mg Protein. Alle Schritte, die folgen, beziehen sich auf 2 ml Harz in einem 10-ml-Säule. Bis zu 10 mg Protein pro 1 ml Harz (: 1 Aufschlämmung 2 ml 1) verbunden werden.
- Bereiten Sie eine 10 ml-Säule, indem Sie eine Fritte nach unten und läuft PBS pH 7,4 durch. Cap ter Boden der Säule und 2 ml Kopplungspuffer.
- Fügen Sie das gewünschte Volumen an Schlamm (4 ml bis 2 ml Harz zu erhalten) an die Säule, entfernen Sie die Bodenkappe und lassen Sie die Spalte Drain. Spülen der Säule mit einer Gesamtzahl von 6 ml (3 Harz-Bettvolumen) Kopplungspuffer und damit der Säule ablaufen. Nach der Kupplungspuffer entleert, ersetzen Sie die Bodenkappe.
- Hinzuzufügen 2-4 ml Protein in Kupplungspuffer suspendiert, um die Säule (keep ein Aliquot der Proteinlösung, um die Kopplungseffizienz, indem die Proteinkonzentration des Eluats in Schritt 2.11 unter Verwendung von entweder der Absorption bei 280 nm oder die Bicinchoninsäure-Assay zu beurteilen) . Kappe und mischen kopfüber, um eine homogene Lösung zu haben.
- Wiegen Sie eine leere 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zu bewegen, um den Abzug. Sorgfältig über NaCNBH 3 (etwa 0,05 g) in der vorgewogen Rohr. Schließen Sie den Schlauch und wiegen die Röhrchen mit NaCNBH 3. Das Rohr Öffnen Sie nicht außerhalb der Haube.
- Bezogen auf das GewichtNaCNBH 3 in das Rohr übertragen, machen Sie eine 5 M-Lösung durch Zugabe von 1 M NaOH. Das Molekulargewicht des NaCNBH 3 62,84 g deshalb 0,05 g gleich (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 Mol) 7,96 x 10 -4 mol ist. Um eine 5 M Lösung add (7,96 x 10 -4 / 5) 159 ul 1 M NaOH zu machen.
- Messen Sie Gesamtvolumen der Reaktion der Einnahme des Harzvolumen in Betracht. In 10 ul 5 M NaCNBH 3 pro ml Reaktions.
- Zum Beispiel: für einen 4 ml Reaktionsvolumen werden 40 & mgr; l von 5 M NaCNBH 3. 1 ml Harz und 3 ml zugesetztes Protein, das Gesamtvolumen von 4 ml.
- Verschließen Sie die Spalte und Mischen über Kopf. Befestigen Sie die Säule an einem Rohr Rotator und ließ die Reaktion über Nacht weiter bei 4 ° C.
- Am Morgen bringen die Spalte an die chemischen Haube und entfernen Sie die Kappe so etwas Gas gebildet haben sorgfältig. Entleeren Sie die Säule in ein sauberes Röhrchen und speichern Sie das Eluat, das Protein con messentration mit der Absorption bei 280 nm Methode 12 oder die Bicinchoninsäure-Assay und vergleichen ihn mit dem Ausgangsprotein-Konzentration in Schritt 2.6.
- Das Harz wird mit 4 ml Kopplungspuffer und lassen Sie die Spalte Drain.
3. Blocking Verbleibende Seiten
- Mit 4 ml Puffer Abschrecken Waschen des Harzes. Abtropfen lassen und ersetzen Sie die Bodenkappe. 2 ml Puffer und Abschrecken auszusetzen Harzes.
- Beurteilung des gesamten Reaktionsvolumens durch Messung der Harzvolumen und das Abschrecken Puffervolumen dann werden 10 ul 5 M NaCNBH 3 pro ml Reaktionsvolumen.
- Vorsichtig mischen bei Raumtemperatur für 30 min End-Over-End. Nach 30 Minuten bringen Sie die Spalte in der Abzugshaube. Entfernen Sie vorsichtig die obere und dann die untere Kappe und lassen Sie die Spalte Drain in einen Abfallrohr.
- Mit 5 Harzvolumina Waschlösung Die Säule. Überwachen Sie die Waschanlagen für die Anwesenheit von Restproteine durch Messung des Eluats der absorbance bei 280 nm. Entkoppelt Proteine werden durch die hohe Salzkonzentration gewaschen.
- Mit 6 ml entgastem PBS pH 7,4, enthaltend 0,02% Natriumazid Waschen des Harzes. Halten der Säule auf 4 ° C, bis es benötigt.
4. Reinigung von Nurr1 spezifischer Antikörper
- Spülen Sie die Nur77 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie das abgelassen Nur77 LBD gekoppelt Säule in ein neues 15 ml Sammelröhrchen.
- 5 ml Protein A-gereinigten Anti-Nurr1-Antikörpern, die Kappe die Säule und den Platz auf einem Schüttler bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch. Beiseite auf Eis, bis bereit gesetzt, um zum Nor1 LBD gekoppelt Spalte hinzuzufügen.
- Spülen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Säule mit 10 ml PBS pH 7,4 und lassen Sie die Spalte Drain. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und legen Sie die Nor1 LBD gekoppelt Spalte in einem 15 ml-Collection-Tube.
- In den Fluss durch von der Nur77 Putsch LBDLED-Säule vom Säule und auf einem Rotator bei 4 ° C für 1 Stunde. Entfernen Sie die oberen und unteren Kappen und sammeln die Strömung durch.
- Messung der Antikörperkonzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm.
5. ELISA-basierte Analyse von gereinigten Anti-Nurr1 Antikörper
- 100 l Protein (2,5 ug / ml) in die Vertiefungen einer 96 Well-Platte. Wenn die Prüfung 3 verschiedene Proteine wird mit 100 ul Protein 1 die Vertiefungen A1 bis H4 wurden 100 ul Protein 2, die Vertiefungen A5 bis H8 und 100 & mgr; l von Protein 3 zu Vertiefungen A9 bis H12. Die Platte und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
- Zweimaliges Waschen der beschichteten Wells mit 300 ul pro Napf an PBS, pH 7,4 und 300 ul ELISA Blockpuffer an die gesamte Antigen-beschichteten Vertiefungen und inkubiert 2 h bei Raumtemperatur.
- Während die Platte blockiert Vorbereitung eines gewünschten Ausgangsverdünnung von gereinigtem anti-Nurr1-Antikörper (im Bereich von 10 bis 100 ug / ml) im ELISA Blockpuffer.
- Nach 2 Stunden der Sperrung, ersetzen Sie den ELISA-Blockpuffer mit 100 ul frisch ELISA-Blockpuffer in alle Vertiefungen.
- 100 l des verdünnten gereinigten anti-Nurr1 Antikörper in jede Vertiefung in der Reihe A. Seriell verdünnte die Antikörper durch die Übertragung von 100 ul der Lösung von Reihe A zu den Vertiefungen in der Reihe B, gefolgt von Übertragen von 100 ul der Lösung von Reihe zu Reihe B C Fortsetzung auf G. rudern Nach dem Mischen der Lösungen in den Vertiefungen in der Reihe G entsorgen Sie die zusätzliche 100 ul. Wells in Reihe H erhalten nur die ersten 100 l Blocking-Puffer. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- Drei (3) mal mit 300 ul pro Vertiefung von 0,05% Tween 20 waschen Sie die Platte in PBS pH 7,4 und trocknen Sie die Platte, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen.
- 100 l Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG ELISA in Blockpuffer verdünnt (1: 8.000 Verdünnung; der typische Bereich von 1: 5.000 bis 1: 25.000). Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- Waschen Sie die Platte threie (3) mal so in 5.6 beschrieben. Spülen Sie alle Vertiefungen durch mit 300 ul entionisiertem Wasser füllt sie. Tupfen Sie überschüssiges Wasser durch Umdrehen der Platte auf absorbierendes Papier.
- Füge 100 ul 3, 3 ', 5, 5' Tetramethylbenzidin (auf Raumtemperatur erwärmt) in jede Vertiefung und inkubiert 15 bis 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2 NH 2 SO 4.
- Extinktion bei 450 nm subtrahiert Hintergrund bei 650 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Vergleich der Protein A-Säule gereinigt Nurr1-spezifische Antikörper mit Protein A gereinigter anti-Nurr1-Antikörper, gefolgt von Passage durch Nur77 LBD und Nor1 LBD Spalten ist in Figur 1 dar. Wie gezeigt ist ersichtlich, Protein A-gereinigten Nurr1-Antikörper zeigte eine starke Bindungs um Nurr1 LBD. Jedoch zeigte sich auch eine signifikante Bindung an Nur77 LBD und Nor1 LBD. Wenn Protein A-gereinigten Antikörper wurden Nurr1 weiter gegen Nur77 LBD und Nor1 LBD endgültigen affinitätsgereinigtem Nurr1 Antikörper zeigte eine spezifische Bindung an Nurr1 LBD mit einer nicht nachweisbaren Bindung an Nur77 LBD oder Nor1 LBD, was zeigt, dass ihre Kreuzreaktivität gegen Nur77 und Nor1 wurde gereinigt vollständig entfernt.
Diese Spezifität wurde durch Western-Blot-Analyse von Extrakten aus CHO-Zellen mit Expressionsvektoren tragen voller Länge Nurr1, Nor1 oder Nur77 fusioniert, um Tagging Myc-Protein (Abbildung 2) transfiziert demonstriert. Wie erwartet, anti-myc ANTIBodies zeigte, daß jedes Protein voller Länge wurde an seinem erwarteten Molekulargewicht ausgedrückt. In Übereinstimmung mit den ELISA-Ergebnisse, Protein A-gereinigten Nurr1 spezifischen Antikörper robust erkannt voller Länge Nurr1 sondern auch erkannt Nor1 und Nur77 wenn auch weniger effizient. Im Gegensatz dazu hat der vollständig gereinigten Nurr1 Antikörper keine nachweisbare Kreuzreaktivität mit Nor1 und Nur77 aufweisen durch ELISA oder Western-Blot-Analysen.
Schließlich wurde das vollständig gereinigte Nurr1 Antikörper zur immunhistochemischen Analyse von MDA Neuronen eingesetzt. Es ist gut dokumentiert, dass Nurr1, aber nicht die enge Homologen Nor1 und Nur77, ist prominent in Nagetieren und Menschen mDA Neuronen sowohl auf mRNA und Protein-Ebene 14,15 ausgedrückt. Die Verwendung des vollständig gereinigten Antikörpers bestätigt, daß Nurr1 Nurr1 fast ausschließlich im Zellkern von MDA-Neuronen in der Substantia nigra Bereich (Abbildung 3) ausgedrückt.
Figur 1: Vergleich von ELISA Kreuzreaktivitäten des Anti Nurr1 Antikörper vor und nach Reinigung durch Hindurchleiten durch Nur77 und Nor1 LBDs gekoppelten Kolonnen Protein A gereinigte anti-Nurr1-Antikörper (0,156 ug / ml) (a) oder Protein A gereinigte gefolgt. Chromatographie auf Nor1 und Nur77 LBD-gekoppelten Kolonnen Anti Nurr1 Antikörper (0,156 ug / ml) (b) wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 100 ul 2,5 ug / ml von entweder Nurr1 LBD Nor1 LBD oder Nur77 LBD beschichtet wurden. Der ELISA wurde wie im Methodenteil beschrieben durchgeführt.
Figur 2: Der spezifische Nachweis von Volllängen Nurr1 exprimiert in CHO-Zellen mit Hilfe des vollständig gereinigten Nurr1-spezifischen Antikörper voller Länge Nurr1, NOR1 und Nur77 Proteine wurden ausgedrückt als myc markiert.Fusionsproteine in CHO-Zellen und durch Myc-spezifische Antikörper (a), Protein A-gereinigten Nurr1-Antikörper (b) und vollständig gereinigtes Nurr1 Antikörper (c) nachgewiesen. Anti-Actin-Antikörpern für die Proteinbeladungskontrolle (d) verwendet. Jedes Myc-markierten Volllängen-DNA (Molekulargewicht von 65, 66 und 69 kDa für Nurr1, Nur77, NOR1 jeweils) wurden transient in CHO-Zellen transfiziert und die gleiche Menge an Zellextrakte wurden in jede Spur geladen. Spur 1: Negativkontrolle, bestehend aus CHO-Zellen Extrakte mit einem leeren Vektor transfiziert; Spur 2: Myc-Nurr1; Spur 3: Myc-Nur77; Spur 4: Myc-Nor1.
Fig. 3: Das vollständig gereinigte Nurr1-spezifischen Antikörper spezifisch erkennt, Tyrosin-Hydroxylase-positiven Dopaminneuronen Mesencephalon Dopamin-Neuronen in der Substantia nigra sind positiv für Nurr1, da edurch Immunhistochemie unter Verwendung der vollständig gereinigten Nurr1-spezifische Antikörper xamined. Bemerkenswert ist, Nurr1 wurde im Kern MDA Neuronen lokalisiert. TH (Tyrosin-Hydroxylase). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Maßstabsleiste in white box merge ist 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Erfolg dieses Protokoll beruht auf der Verfügbarkeit von reinen Proteinen zur Charakterisierung von Antikörpern gegen ein bestimmtes Mitglied der Proteinfamilie von Interesse angehoben. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Antikörper unter Verwendung von Protein A / G bis zum deutlich festgestellt, dass es signifikante Kreuzreaktivität mittels ELISA und Western-Blotting zu reinigen.
Wie im Text erwähnt, ist es wichtig zu vermeiden, Suspendieren des Proteins (en) werden auf der Säule in einer aminhaltigen Puffer wie Tris- oder Glycin vernetzt. Ferner die optimale Proteinkonzentration für die Vernetzung verwendet werden, müssen empirisch ermittelt werden. Zu viel Protein auf der Säule könnte sterischen Hinderung führen, während zu wenig würde die Effizienz der Adsorption zu reduzieren. Daher ist es eine gute Idee, um die Proteinkonzentrationen im Bereich von 2 bis 10 mg / ml zu testen und die Qualität der resultierenden Antikörper zu bewerten.
Mehrere Faktoren müssen berücksichtigt werden, wenn th werdenTechnik ist nicht auf hochspezifische Antikörper zu erhalten. Dazu gehören: Vernetzung Effizienz, Verlust des immunreaktiven Domäne und vernetzten Protein-Denaturierung. Wie im Protokoll angegeben, Überwachung Vernetzungseffizienz ermöglicht die Bestimmung, die zu viel oder zu wenig Protein, das an der Säule immobilisiert. Wenn Vernetzen unter Verwendung reaktiven Aminen wird zerstören immunoreaktiv Domain (s), Immobilisierung durch die Carbonsäuregruppe oder über Kohlenhydrate aufweisen, sollten berücksichtigt werden.
Es ist wichtig, um die Effizienz des Verfahrens zu überwachen, um hochspezifische Antikörper konsistent zu erhalten. Zur Regenerierung müssen die Spalten der ihnen mit harten Bedingungen (hohe oder niedrige pH) gebunden kreuzreaktive Antikörper entfernt werden. Dies führt zu einer zunehmend höheren Prozentsatz an vernetzter Proteine wirksam denaturiert werden, wodurch die Leistung der Säule.
Die Zugabe von Blockierungsmittel in ELISA und Western Blotting wird allgemein mit einem fairen Niveau der Erfolg eingesetzt. Die in diesem Video beschriebene Ansatz erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit für einen Erfolg und reduziert die Notwendigkeit der Beibehaltung große Mengen der kreuzreaktive Proteine auf der Hand. Da die Reagenzien und Verfahren, um Proteine zu immobilisieren, um Chromatographiemedien weiter zu verbessern, wird dieser Ansatz zur Identifizierung von zirkulierenden transformierten Zellen spezifischen Antikörpern beitragen.
Dieser Ansatz wird durch die Verfügbarkeit von reinen Proteinen beschränkt. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist die Abhängigkeit von der korrekten Faltung bei Verwendung von Proteindomänen. Wenn die Proteindomänen nicht im gesamten Proteinfaltung wie kann der Präadsorption Strategie keine Antikörper, die ohne weiteres identifizieren, die das Protein-Element von Interesse bei der Analyse von Zellen oder Gewebeextrakten erhalten.
Viele Proteine von Interesse gehören zur (Unter-) Familien von Proteinen mit hoher Aminosäure-Sequenzhomologien. Funktionelle Charakterisierung und identifizierung der Verteilung der Proteine sind vielfach auf der Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern gegen jeden Familienmitglied. Die hohe Aminosäurehomologien zwischen Protein Mitglieder der gleichen Familie tragen zu den Schwierigkeiten bei der Erzeugung von hochspezifischen Antikörpern. Mit diesen kreuzreaktive Antikörper oft zu widersprüchlichen Ergebnissen führen.
Ein solches Beispiel ist die orphan nuclear Rezeptor Nurr1, die dem NR4A Familie von Kernrezeptoren mit Nur77 und Nor1 fällt, zusammen. Da diese drei Faktoren gemeinsam einen hohen Grad an Aminosäurehomologie, Antikörper gegen jeden Faktor signifikante Kreuzreaktionen, die genaue Analyse der einzelnen Faktoren behindern.
Mit diesen NR4A Mitglieder als Beispiel, war es möglich, hochspezifische Antikörper Nurr1 frei von Reaktivitäten zu Nor1 oder Nur77 zu generieren. Da die LBDs teilen weniger Homologie als die DNA-Bindungsdomänen wurde die LBD jedes Proteins exprimiert und gereinigt und dann i verwendetmü ssen die Spezifität der anti-Nurr1 Antikörper. Zunächst Antikörper gegen Nurr1 der LBD zeigte bescheidene, aber ein erhebliches Maß an Kreuzreaktivität mit anderen Proteinen, wie durch ELISA untersucht und Western-Blot-Analysen. Allerdings, wenn Protein A-gereinigten Nurr1 Antikörper wurden weiter durch pre-Adsorption gegen kreuzreaktive LBD-Domänen von Nur77 und Nor1 gereinigt, die resultierende Nurr1 Antikörper fanden keine Kreuzreaktivität zeigen, wie durch Western-Blot untersucht und ELISA-Analysen der prominent erkannt Nurr1 -exprimierenden DA-Neuronen im Mittelhirn Gebieten. Die Western-Blot-Daten und ELISA-Analysen eng miteinander überein, was darauf hinweist, dass diese Analysen können sich ergänzen und gegenseitig unterstützen.
Zusammengenommen, wird diese Reinigungsstrategie Antikörper extrem nützlich bei der Erzeugung eines spezifischen Antikörpers, indem die Kreuzreaktivität mit homologen Proteins Mitglieder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
