Introduction
Transkripsiyon faktörü Nurr1 ve homologları (Nur77 ve Nor1), nükleer reseptör alt ailesi 4A (NR4A) 1 aittir. Onların endojen ligandlar henüz tespit edilmemiş çünkü onlar da yetim reseptörler vardır. Nurr1 ilk olarak 1992 klonlandı ve bilinen, ancak beyin 2'de belirtildiği üzere, geliştirme ve orta beyin dopamin nöronlarının bakımı için de önemli bir rolü nakavt fare çalışmaları 3 konuldu. Buna ek olarak, orta beyin dopamin nöronlarının bakım için çok önemli bir rol son şartlı bir nakavt çalışma 4 ile gösterilmiştir. Nedeniyle orta beyin dopamin nöronları için Nurr1 en kritik roller gösteren bu zarif çalışmalara, birçok sonraki çalışmalarda büyük ölçüde dopamin nöronları ve dopamin ile ilişkili nörodejeneratif bozukluk orta beyin odaklanmıştır, Parkinson hastalığı (PH) 5.
Özellikle, Nurr1 orta beyin dopamin (MDA) nöronlarda, aynı zamanda di sadece ifade edilirşiddetle Nurr1 çeşitli beyin fonksiyonlarında önemli rol oynadığını gösteren daha yeni çalışmalar tarafından desteklenmektedir olmayan birçok DA alanlarda işlevsel rollere sahip olabileceğini düşündüren ayet beyin bölgelerinin 2. Örnekler için, bu gibi öğrenme gibi bellek indükleyici aktiviteleri gösterilir, ya da diğer hipokampus bağımlı görevler yukarı regülasyonu hipokampus 6,7 Nurr1 ifade ile sonuçlanır. Buna ek olarak, aşağı hipokampus Nurr1 ifade vurmak şiddetle Nurr1 birçok beyin bölgelerindeki çeşitli roller oynadığını düşündüren, uzun süreli hafızayı ve / veya sinaptik plastisite 8-11 zarar için yeterli oldu. Bu nedenle, daha Nurr1 hücre-tipi-spesifik ve hücre içi ifade anlamak için, onun homologları ya da Nur77 Nor1 herhangi bir çapraz reaktivite sergilemez Nurr1 özgü antikorları kullanmak için tercih edilir. Bu kağıt özgüllüğü gösteren Nurr1 özgü antikorlar ve bu ek verileri oluşturmak için bir ön-adsorpsiyonu protokolü tarif eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıda belirtilen tüm çözümlerin kompozisyon Malzemeleri / Ekipman Tablo bulunabilir.
1. Protein A Sütun Antikor Arıtma
- Bir protein A spin kolon ve önceki işleme başlamadan 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar gerekli tüm tamponları dengelenmesi.
- Bağışıklık serumu 1 seyreltin: 1 Protein A IgG Bağlama Tamponu ile. (Serum 5 mi tavsiye edilir).
- Yavaşça kapağı açılmış olabilecek reçineyi çıkarmak için bir proteine tezgah üstünde bir spin kolon dokunun. Üst kapağı çıkarın ve yavaşça alt kapatma koparmak. 15 ml toplama tüpüne sütun yerleştirin ve depolama çözümü süzülmesini bekleyin.
- Bağlama Tamponu Protein A IgG 5 ml ilave edilir ve çözelti, kurumasına izin verin.
- Sütuna seyreltilmiş bağışıklık serumu uygulayın ve flow-through toplamak. En iyi sonuçlar için, sütunun antikor-bağlanma capacit% 80 daha az bir antikor konsantrasyonunu içeren bir örnek hacim eklemeky.
- Bağlama Tamponu Protein A IgG, 15 ml ya da 280 nm'de absorbans aşağıdaki 0.1 kadar sütun yıkayın.
- Beş etiketli toplama tüplerine Nötralizasyon Tamponu 100 ul ekleyin.
- Protein A sütun IgG Elüsyon Tamponu 5 ml ilave edilir ve Nötralizasyon tampon 100 ul ihtiva eden tüplerin her biri, 1 ml'lik fraksiyonların toplanması.
- 0.5'den daha büyük olan bir absorbans 280 nm ve havuz fraksiyonlar her fraksiyondan absorbansı ölçülür. Diyaliz için hazır olana kadar buz üzerinde Bir araya toplanan fraksiyonlar tutun.
- IgG Elüsyon Tamponu 8 ml ekleyerek sütun yeniden oluşturun ve çözelti sütun üzerinden akmasına izin verir.
- 7.4'e yıkama sıvısı, pH dönene kadar Protein A IgG bağlanma solüsyonu ile sütun durulayın.
- Depolama çözeltisi 5 ml (PBS içinde% 0.02 sodyum azid) eklenerek sütun saklayın. Yaklaşık 3 ml sütun, kapak altındaki kalır ve üst kapağı emniyete zaman. 4 ° C 'de sütun saklayın.
- Uzunluk o belirleyinf Diyaliz tübü, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerekli. 16 mm, düz çaplı boru çözeltinin ml'si başına boru uzunluğunun 5.47 cm kullanımı kullanılarak diyaliz edilmesi. Boru kesme ve 15-30 dakika boyunca PBS pH 7.4 ile yıkayın.
- Katlama ve diyaliz hortumun bir ucunu klip, PBS pH 7.4 içinde dengelenmiş diyaliz tüp içeren fraksiyonlar bir araya toplanmış IgG aktarmak ve diğer ucu kapatın.
- 2 saat süre ile, PBS, pH 7.4, 200 hacmine karşı oda sıcaklığında Dialyze.
- Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve oda sıcaklığında başka bir 2 saat boyunca diyaliz.
- Diyaliz tamponu (taze PBS pH 7.4) değiştirin ve 4 ° C'de gece boyunca diyaliz.
- Daha fazla saflaştırma adımları ile devam etmek için hazır olana kadar 4 ° C'de diyaliz edilir antikor çözüm tutun.
- 280 nm'de absorbans kullanılarak antikor konsantrasyonuna ve 210,000 M-1 cm-1 12 ve 280 nm 'de antikor Molar soğurma katsayısı değerlendirin.
LBD Proteinlerin 2. Bağlantı Bağlantı Reçine AminoLink için
- Iki sütun, Nor1 diğeri Nur77 diğer hazırlayın. Her iki protein için de aynı protokol takip edin.
- Protein çözülme buz üzerinde reçineye bağlanmak üzere. Onun moler sönüm katsayısı ve 280 mil 12, emiciliğinin kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
- Alternatif olarak, bu bisinkoninik asit yöntemi 13 gibi bir protein tayini testi kullanılır. Protein bağlama tamponuna karşı bir amin-içeren tampon diyaliz ya da tampon alışverişi içinde eritildi edin. Protein, Uygun bir tampon maddesi içinde (serbest aminler) ise bu, bağlayıcı tampon içinde 4 kat seyreltilir.
- Protein 2 mg reçine 2 ml kullanın. Izleyen tüm adımlar 10 mi sütununda 2 mi reçine içindir. Protein 10 mg kadar reçine, 1 ml (1: bulamacın 1 2 ml) başına bağlanabilir.
- Altına bir cam hamuru bastırıyor ve içinden PBS pH 7.4 çalıştırarak bir 10 ml sütun hazırlayın. Cap tO kolonun alt ve Kaplin Tampon 2 ml ekleyin.
- , Kolona (reçine 2 ml elde etmek için 4 ml) çamurun istenen hacim ekleme alt kapağı çıkarın ve sütun drenaj sağlar. Bağlayıcı tampon içinde 6 ml (3 reçine yatak hacmi) 'in bir toplam sütun durulayın ve sütun boşalmasını sağlar. Kavrama tampon süzüldükten sonra, alt kapağı değiştirin.
- (280 nm'de emicilik ya bisinkoninik deneyi kullanarak adım 2.11 elüatın protein konsantrasyonu karşılaştırarak bağlanma verimliliğini değerlendirmek için protein çözeltisi bir kısım devam) kolonuna bağlayıcı tampon içinde süspansiyon haline getirilmiş protein, 2-4 ml ekleyin . Cap ve homojen bir çözüm var uca üzerine sonunu karıştırın.
- Boş 1.8 ml'lik ependorf tüp tartılır ve davlumbaz taşımak. Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış bir tüp içinde NaCNBH3 (yaklaşık 0.05 g) aktarın. Tüp kapatılır ve NaCNBH3 içeren tüp tartın. Kaput dışında tüp açmayın.
- Ağırlığına göreNaCNBH3, tüpüne aktarıldı, 1 M NaOH ilave edilerek 5 M bir solüsyon yapmak. NaCNBH3 moleküler ağırlığı 62.84 gr, bu nedenle 0.05 g (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 -4 mol) 7.96 x 10 -4 mol eşit olmasıdır. 5 M solüsyonu (7.96 x 10 -4/5), 1 M NaOH ile 159 ul yapmak için.
- Reaksiyonun toplam hacmi dikkate reçine hacmi alarak ölçün. Reaksiyonun, ml başına 5 M NaCNBH3 10 ul ekle.
- Örnek: Bir 4 ml reaksiyon hacmi için 5 M NaCNBH3 40 ul ekle. Reçine 1 ml ilave protein, 3 ml için, toplam hacim 4 ml'dir.
- Sütun Cap ve sonunda üzerinde sonunu karıştırın. Bir tüp döndürücü sütun Güvenli ve reaksiyon 4 ° C'de gece boyunca devam edelim.
- Sabah, kimyasal kaput sütun getirmek ve dikkatli bir gaz oluşmuş olabilir gibi kapağı çıkarın. Temiz bir tüp içine sütun boşaltın ve protein con ölçmek için eluatı kaydetmek280 nm yöntemiyle 12 absorbans veya bisinkoninik asit deneyi ve adım 2.6 başlayarak protein konsantrasyonu ile karşılaştırmak kullanarak santrasyonu.
- Kavrama 4 ml tampon ile reçinenin yıkanır ve sütun süzdürülür.
3. Engelleme Kalan Siteler
- Tampon söndürülmesi 4 ml reçine yıkanır. Drenaj ve alt kapağını kapatın. Tampon söndürülmesi 2 ml ekleyin ve reçine askıya.
- Reçine hacmi ve söndürme tampon hacmi daha sonra reaksiyon hacmi ml başına 5 M NaCNBH3 10 ul ekleyin ölçerek toplam reaksiyon hacmi değerlendirin.
- 30 dakika ucu-üzerinde-sonu boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın. 30 dakika sonra, davlumbaz sütun getir. Dikkatle üst kaldırmak ve daha sonra alt kapağı çıkarın ve bir atık tüp içine sütun tahliye edelim.
- Yıkama çözeltisi 5 reçine hacimleri ile sütun yıkayın. Taşıma ürününden en abso ölçülmesiyle bakiye proteinlerinin varlığı için yıkama Monitör280 nm'de rbance. Kuplajsız proteinler yüksek tuz konsantrasyonu ile yıkanır.
- Gazı alınmış, PBS, pH 7.4,% 0.02 sodyum azid, 6 ml reçine yıkanır. Gerekli olana kadar, 4 ° C 'de sütun tutun.
Nurr1 Özgü Antikorlar 4. saflaştırılması
- PBS pH 7.4 10 ml Nur77 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt Cap ve yeni bir 15 ml toplama tüpü drene Nur77 LBD birleştiğinde sütun yerleştirin.
- Protein 5 ml saflaştırılmış bir anti-Nurr1 antikor ekleyin 1 saat boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak. Nor1 LBD birleştiğinde sütuna eklemek için hazır olana kadar buz üzerinde bir kenara koyun.
- PBS pH 7.4 10 ml Nor1 LBD bağlanmış sütun durulayın ve sütun süzdürülür. Sütunun alt kapağı ve bir 15 ml'lik bir toplama tüpü içinde Nor1 LBD bağlanmış sütun yerleştirin.
- Nur77 LBD darbeden akışını yoluyla Ekleyol kolon, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde sütun ve yer kap. Üst ve alt kapaklarını çıkarın ve akışı toplamak.
- 280 nm'de absorbans ölçümü ile antikor konsantrasyonu ölçümü.
Saf Anti-Nurr1 Antikor 5. ELISA-tabanlı Analiz
- 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına protein, 100 ul (2.5 ug / ml) ilave et. 3 farklı protein test için, H4 Wells A1, H8 Wells A5 proteinin 2, 100 ul, ve H12 kuyu A9 proteinin 3 100 ul proteinin 1. 100 ul ilave edin. Plaka Kapak ve 4 ° C'de bir gece inkübe edin.
- PBS pH 7.4, oyuk başına 300 ul iki kez kaplanmış oyuklarına yıkayın ve tüm antijen kaplı oyuklara ELISA Bloke edici tamponun 300 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe et.
- Plakası saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorun arzu edilen çıkış seyreltme hazırlanması bloke edilirken ELISA bloke tamponu içinde (10 ile 100 ug / ml arasında değişen).
- Engelleme 2 saat sonra, tüm oyuklara taze ELISA blok tamponunda 100 ul ELISA blok tamponu değiştirin.
- Seri olarak C satır satır B çözeltisinin 100 ul aktarma ardından satır B çukurlara satır A çözeltisi 100 ul aktarma ile antikorları seyreltik satır A'da tüm oyuklara seyreltildi saflaştırılmış anti-Nurr1 antikoru 100 ul ekle aşağı doğru devam G ekstra 100 ul atmak aralıksız kuyularda çözüm karıştırıldıktan sonra G. satır. Satır H Wells, sadece tampon engelleme ilk 100 ul alırsınız. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- PBS pH 7.4 plaka,% 0,05 Tween 20, oyuk başına 300 ul olan üç (3) defa yıkayın ve fazla yıkama tamponu çıkması için plakayı blot.
- Yaban turpu peroksidazı (HRP), ELISA Blok tamponu içinde seyreltilmiş biyotinle konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG, 100 ul ekle (1: 8000 seyreltme, tipik bir aralığı, 1: 25,000: 5,000 ile 1 arası). 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- Plaka th yıkayınREE (3) defa 5.6 de tarif edildiği gibi. Iyonu giderilmiş su, 300 ul ile doldurarak her kuyu durulayın. Emici kağıt üzerine plakayı baş aşağı çevirerek fazla suyu kurulayın.
- Tüm oyuklara tetrametilbenzidin (oda sıcaklığına kadar ılıtıldı) 3 100 ul, 3 '5, 5', ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 karanlıkta 30 dakika için inkübe edilir.
- SO 4 NH2 2 50 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
- 650 nm 'de bir arka plan çıkarılması 450 nm'de absorbansı okumak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein bir karşılaştırması Nur77 LBD ve Nor1 LBD sütunları boyunca geçirilerek ve ardından bir saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorları görülebilir Şekil 1. As gösterilmiştir, Protein A sütun saf hale Nurr1-spesifik antikorlar, protein-A saf hale Nurr1 antikor güçlü bir bağlanma sergilemiştir Nurr1 LBD'sine. Bununla birlikte, aynı zamanda Nur77 LBD ve Nor1 LBD bağlanmasını belirgin göstermiştir. Protein A saflaştırılmış Nurr1 antikorlar ayrıca Nur77 LBD ve Nor1 LBD, Nurr1 antikorları Nur77 ve Nor1 olan çapraz reaktivite olduğu gösteren, Nur77 LBD veya Nor1 LBD bağlanma saptanamaz ile Nurr1 LBD bağlanabilen spesifik sergilenen saflaştırılmış nihai afinite karşı saflaştırılmıştır zaman tamamen kaldırıldı.
Bu özgüllüğü, bundan başka, tam uzunlukta Nurr1, Nor1 veya Nur77 Protein (Şekil 2) etiketleme myc erimiş taşıyan ekspresyon vektörleri ile transfekte edilmiş CHO hücre ekstrelerinin Western blot analizi ile gösterilmiştir. Beklenen, anti myc antib olarakkuruluşları da her bir tam boyda bir protein beklenen molekül ağırlığı ile ifade edildiğini ortaya çıkarmıştır. ELISA sonuçları ile uyumlu olarak, Protein A saflaştırılmış Nurr1 özgü antikor sağlam tam uzunlukta Nurr1 tespit değil, aynı zamanda daha az etkin olsa da Nor1 ve Nur77 tespit edildi. Buna karşılık, tamamen saflaştırılmış Nurr1 ELISA ile, Nor1 ve Nur77 herhangi bir tespit edilebilir çapraz reaktivite göstermemiştir veya Western blot analizleri.
Son olarak, tamamen saflaştırılmış Nurr1 antikor MDA nöronların immünohistokimyasal analizi için kullanılmıştır. O iyi ki Nurr1 belgelenmiştir, ancak yakın homologlan Nor1 ve Nur77, belirgin kemirgen ve mRNA hem de insan MDA nöronlar ve protein düzeylerinde 14,15 olarak ifade edilir değil. Tam saflaştınldı Nurr1 antikorun kullanımı Nurr1 hemen hemen tamamen, substantia nigra alanında MDA nöronlar (Şekil 3) çekirdeğinde ifade olduğunu doğruladı.
Şekil 1:. Önce ve Nur77 ve Nor1 LBDs geçirilerek saflaştırma bağlanmış kolonlar protein A saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorları (0.156 ug / ml) sonra, (a) ya da protein A takip saflaştırılmış anti-Nurr1 antikorların çapraz reaktivite ELISA karşılaştırması Nor1 ve Nur77 LBD-bağlanmış sütunlara kromatografisi, anti-Nurr1 antikorları (0.156 ug / ml), (b) Nurr1 LBD, Nor1 LBD veya Nur77 LBD da 2.5 ug / ml 100 ul ile kaplanmış 96 kuyulu plakanın kuyularına eklendi. Yöntemi bölümünde tarif edildiği gibi ELISA gerçekleştirilmiştir.
Şekil 2:., Tam uzunlukta Nurr1 spesifik saptama tamamen saflaştırılmış Nurr1 özel bir antikor kullanılarak CHO hücrelerinde ifade edilen myc etiketli gibi tam uzunlukta Nurr1, Nor1 ve Nur77 proteinleri olarak ifade edildifüzyon proteinleri, CHO hücrelerinde ve myc spesifik antikorlar (a) protein-A saf hale Nurr1 antikor, (b), ve tam saflaştırılmış Nurr1 antikor (C) ile tespit edildi. Protein yükleme kontrolü (d) için kullanılan anti-aktin antikor. Her bir Myc-etiketli tam uzunlukta DNA (65, 66 arasında bir moleküler ağırlığı ve Nurr1 sırasıyla Nur77, Nor1, 69 kDa) CHO hücreleri içine geçici olarak transfekte edilmiş hücre ekstrelerinin, aynı miktarda, her bir şeride yüklendi. Şerit 1: Boş vektör ile transfekte edilmiş CHO hücreleri ekstreleri oluşan negatif kontrol; şerit 2: Myc-Nurr1; kuşak 3: Myc-Nur77; şerit 4: Myc-Nor1.
Şekil 3:. Substantia nigra tamamen saflaştırılmış Nurr1 özgü antikor spesifik tirosin-hidroksilaz-pozitif dopamin nöronları tespit Orta beyin dopamin nöronları e kadar, Nurr1 için pozitiftamamen saflaştırılmış Nurr1-spesifik antikorlar kullanılarak immünohistokimya ile haller işlendi. Özellikle, Nurr1 MDA nöronların çekirdeğinde lokalize idi. TH (tirosin hidroksilaz). Ölçek çubuğu = 100 mikron. Beyaz kutu birleştirme Ölçek çubuğu 10 mikron olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün bir başarı ilgili protein ailesinin belirli bir üye karşı üretilen antikorların karakterizasyonu için, saf proteinler mevcudiyetine dayanır. Bu açık bir şekilde ELISA ve Western blot analizi ile önemli çapraz reaktivite olduğu kurulana kadar protein A / G kullanılarak antikorları saflaştırmak için bir ihtiyaç vardır.
Metinde belirtildiği gibi, bu tür Tris ya da glisin gibi bir amin-ihtiva eden tampon maddesi içinde sütuna çapraz bağlanmış olduğu protein (ler) süspansiyona önlemek için önemlidir. Ayrıca çapraz bağlantısı için kullanılan uygun protein konsantrasyonu deneysel olarak tespit edilmelidir. Çok az adsorpsiyon etkinliğini azaltacaktır ise çok kolonu üzerinde daha fazla protein sterik engelleme ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, iyi bir fikir 2 ila 10 mg / ml arasında değişen bir protein konsantrasyonunu test etmek ve elde edilen antikorlar kalitesini değerlendirmek için.
Çeşitli faktörler, TH düşünülmelidirtekniği son derece spesifik antikorların verim başarısız olduğunu. Bu yöntemler şunlardır: çapraz bağlama verimliliği, immünoreaktif etki kaybı, ve çapraz bağlanmış protein denatürasyonu. Protokolde belirtildiği gibi, çok fazla ya da çok az bir protein kolonu üzerinde hareketsiz kılınmış olan belirlenmesi çapraz bağlama verimliliği sağlar izlenmesi. Çapraz bağlama reaktif aminler kullanılarak karboksilik grubu yoluyla ya da karbonhidrat ile immunoreaktif etki (ler), hareketsiz hale yok olduğundan şüpheleniliyorsa dikkate alınmalıdır.
O sürekli yüksek spesifik antikorların elde etmek için prosedürün etkinliğini izlemek için önemlidir. Yenilenmesi amacıyla, sütun bunların sert koşullar (yüksek ya da düşük pH) ile bağlı olan çapraz-reaktif antikorlar olmayan olmalıdır. Bu çapraz bağlı proteinlerin giderek daha yüksek bir yüzdesi etkin kolon performansını azaltan denatüre neden olur.
ELISA ve Weste bloke ajanların eklenmesirn blot yaygın bir başarı adil seviyede kullanılır. Bununla birlikte, bu video açıklanan yaklaşım, başarı olasılığını arttırır ve yandan çapraz-reaktif proteinin büyük miktarlarda muhafaza ihtiyacını azaltır. Reaktifler ve yöntemler ortam geliştirmeye devam kromatografiye proteinleri hareketsiz hale getirmek için, bu yaklaşım, transforme edilmiş hücreler, spesifik antikorların dolaşım belirlenmesine yardımcı olacaktır.
Bu yaklaşım, saf proteinlerin mevcudiyeti ile sınırlıdır. Bu protokolün diğer kısıtlılığı doğru katlanması bağımlılığı protein etki kullanıyor. Protein alanları, doğal protein olarak katı yoksa, ön adsorpsiyon stratejisi hücre veya doku ekstraktları analiz edildiğinde kolayca ilgili protein elemanını belirleyebilir antikorları vermeyebilir.
Çıkarlarının çoğu protein yüksek amino asit dizisi benzerliklerin proteinlerin (alt) ailelere aittir. Fonksiyonel karakterizasyonu ve kimlikleriniProteinlerin dağılımı ldirimi genellikle her bir aile üyesine karşı spesifik antikorların mevcudiyeti güveniyor. aynı aile protein üyeleri arasındaki yüksek amino asit homolojileri oldukça spesifik antikorların üretilmesi zorluğu katkıda bulunur. Bu çapraz-reaktif olan antikorları kullanılması genellikle çelişkili sonuçlar yol açar.
Bu tür bir örnek, Nur77 ve Nor1 ile birlikte, nükleer reseptörlerin NR4A alt ailesine ait olan öksüz nükleer reseptör Nurr1 olup. Bu üç faktör amino asit homolojisi yüksek derecede paylaşan için, her faktörüne karşı antikorlar, her faktörün hassas analiz engelleyen önemli çapraz reaktiviteleri göstermektedir.
Bir örnek olarak, bu NR4A üye kullanarak, Nor1 ya Nur77 için reaktivitelerinin oldukça spesifik Nurr1 antikorlar serbest üretmek mümkün olmuştur. LBDs DNA bağlama alanları daha az homoloji paylaştığı için, her bir proteinin LBD ifade edilir ve arıtılır ve daha sonra i için kullanılanAnti-Nurr1 antikorların spesifitesini mprove. ELISA ile incelenmiş ve Western Blot analizleri Başlangıçta, Nurr1 en LBD karşı antikorlar, diğer proteinlere çapraz reaktivite mütevazı ama önemli seviyelerde sergiledi. Protein A saflaştırılmış Nurr1 antikorlar ayrıca Nur77 ve Nor1 çapraz reaktif LBD etki karşısında önceden adsorpsiyon yoluyla saflaştınldı, ancak elde edilen Nurr1 antikor Western blot tarafından incelenmiştir gibi herhangi bir çapraz reaktivite göstermedi ELISA belirgin tespit Nurr1 analizi orta beyin alanlarında DA nöronlar -expressing. Western Blot veriler ve ELISA yakından bu analizler tamamlayıcı nitelikte ve birbirlerine destek olduğunu belirten, birbirleri ile anlaşmak analizleri.
Birlikte ele alındığında, bu antikor saflaştırma stratejisi homolog protein üyelerine çapraz reaktivite ortadan kaldırarak, belirli bir antikorun üretilmesi son derece faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
