Introduction
גורם שעתוק Nurr1 וhomologs שלה (Nur77 וNor1) שייכים ל4A קולט הגרעיני תת משפחה (NR4A) 1. הם גם קולטנים יתום כי ligands אנדוגני אינו מזוהים עדיין. Nurr1 היה משובט ראשון בשנת 1992 ולמרות שידוע שבאו לידי ביטוי במוח 2, תפקידה החיוני לפיתוח ותחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון התגלה על ידי מחקרי עכבר נוקאאוט 3. בנוסף, התפקיד החשוב שלה לצורך התחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון הודגם לאחרונה על ידי מחקר בנוקאאוט מותנה 4. בשל מחקרים האלגנטיים אלה מראים התפקידים הקריטיים של Nurr1 לנוירונים דופמין המוח התיכון, מחקרים רבים שלאחר מכן התמקדו במידה רבה בנוירונים דופאמין והפרעה ניוונית של מערכת עצבים הקשורים לדופמין המוח התיכון, מחלת פרקינסון (PD) 5.
יש לציין, Nurr1 מתבטא לא רק בתאי עצב דופמין המוח התיכון (מד"א), אלא גם בdiאזורים במוח פסוק 2, מה שמרמז שאולי יש לו תפקידים פונקציונליים בתחומים רבים שאינו התובע, אשר נתמך במידה רבה על ידי יותר מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי Nurr1 משחק תפקידים חשובים בתפקודי מוח שונים. לדוגמאות, זה הוצג פעילויות התרמה-זיכרון שכגון למידה, או משימות היפוקמפוס תלוי אחרות לגרום לעד-רגולציה של ביטוי Nurr1 ב6,7 היפוקמפוס. בנוסף, להפיל את ביטוי Nurr1 בהיפוקמפוס היה מספיק כדי לפגוע בזיכרון לטווח ארוך ו / או פלסטיות הסינפטית 8-11, חזק המצביע על כך Nurr1 משחק תפקידים מגוונים באזורי מוח רבים. לכן, כדי להבין את ביטוי תאים מסוג ספציפי וsubcellular של Nurr1 נוסף, רצוי להשתמש נוגדני Nurr1 ספציפי, שאינו מפגינים כל תגובה צולבת לhomologs Nur77 או Nor1. מאמר זה מתאר פרוטוקול מראש ספיחה לייצר נוגדני Nurr1 ספציפי ונתונים נוספים מראים הנוכחיים הספציפי שלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ניתן למצוא ההרכב של כל הפתרונות שהובאו להלן בטבלת חומרים / ציוד.
1. חלבון טור נוגדן טיהור
- לאזן חלבון טור ספין וכל מאגרים הנדרשים לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות לפני תחילת ההליך.
- לדלל את הסרום חיסוני 1: 1 עם החלבון IgG כריכת מאגר. (5 מיליליטר של סרום מומלץ).
- לטפוח בעדינות חלבון טור ספין על גבי הספסל כדי לסלק כל שרף שעשוי להיות תקוע בפקק. הסר את המכסה העליון ועדינות להצמיד את הסגירה התחתונה. מניחים את הטור בצינור איסוף 15 מ"ל ולאפשר פתרון אחסון לניקוז.
- הוסף 5 מיליליטר של החלבון IgG כריכת הצפת ולאפשר הפתרון לניקוז.
- החל הסרום חיסוני המדולל לעמודה ולאסוף את הזרימה דרך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להוסיף נפח דגימה המכיל ריכוז של נוגדנים פחות מ -80% מcapacit מחייב הנוגדן של העמודהy.
- לשטוף את העמודה עם 15 מיליליטר של החלבון IgG כריכת הצפת או עד הספיגה ב 280 ננומטר היא מתחת 0.1.
- להוסיף ניטרול הצפת 100 μl לחמישה צינורות אוסף שכותרתו.
- הוסף 5 מיליליטר של IgG הצפת elution לחלבון עמודה ולאסוף שברי 1 מיליליטר בכל אחד מהצינורות המכילים ניטרול הצפת 100 μl.
- מדוד את הספיגה של כל חלק ב280 ננומטר ברים ובריכה עם הספיגה גבוהה מ -0.5. שמור את השברים ונקווה על קרח עד מוכן לדיאליזה.
- להתחדש העמודה על ידי הוספת 8 מיליליטר של IgG הצפת elution ולאפשר הפתרון לזרום דרך העמודה.
- יש לשטוף את הטור עם פתרון כריכת החלבון IgG עד תשואות pH eluent 7.4.
- אחסן את העמודה על ידי הוספת 5 מיליליטר של פתרון אחסון (0.02% אזיד הנתרן PBS). כאשר 3 מיליליטר כ יישאר בעמודה, התחתונה הכובע ולאבטח את המכסה העליון. אחסן את הטור ב 4 מעלות צלזיוס.
- לקבוע את אורך oצורך צינורות דיאליזה ו בהתאם להוראות היצרן. שימוש בצינורות בקוטר 16 מ"מ שטוח להשתמש 5.47 סנטימטר של אורך צינור לכל מיליליטר של פתרון לדיאליזה. חותך את צינורות ולשטוף עם pH 7.4 PBS במשך 15 עד 30 דקות.
- מקפלים וקליפ קצה אחד של צינור הדיאליזה, להעביר IgG נקווה שמכיל שברים לצינורות דיאליזה equilibrated בpH 7.4 PBS ולסגור את הקצה השני.
- Dialyze בטמפרטורת חדר נגד 200 כרכים של pH 7.4 PBS עבור שעה 2.
- לשנות את חיץ הדיאליזה (PBS pH הטרי 7.4) ודיאליזה לעוד 2 שעות בטמפרטורת חדר.
- לשנות את חיץ הדיאליזה (PBS pH הטרי 7.4) ודיאליזת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- שמור את פתרון נוגדן dialyzed על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך בצעדי טיהור נוספים.
- להעריך את ריכוז הנוגדנים באמצעות הספיגה שלה ב 280 ננומטר ומקדם ספיגה הטוחנות של נוגדנים ב 280 ננומטר של 210,000 M -1 סנטימטר -1 12.
2. צימוד של החלבונים LBD לAminoLink צימוד שרף
- הכן שתי עמודות, אחת לNor1 ואחר לNur77. בצע את אותו הפרוטוקול לשני החלבונים.
- להפשיר את החלבון שמצמיד את השרף על קרח. קבע את ריכוז החלבון באמצעות מקדמה טוחנת הכחדה והספיגה שלה ב 280 ננומטר 12.
- לחלופין, להשתמש assay נחישות חלבון כגון assay חומצת bicinchoninic 13. אם החלבון הוא מומס בחילופי dialyze חיץ המכיל אמין או חיץ נגד הצפת זיווגים. אם החלבון הוא בחיץ מתאים (לא אמינים חינם) לדלל אותו פי 4 בצימוד מאגר.
- השתמש 2 מיליליטר של שרף עבור 2 מ"ג של חלבון. כל השלבים הבאים הם עבור שרף 2 מיליליטר בעמודת 10 מיליליטר. עד 10 מ"ג של חלבון יכול להיות מקושר לכל 1 מיליליטר של שרף (2 מיליליטר של 1: 1 תרחיף).
- הכן עמודת 10 מיליליטר על ידי לחיצת frit לתחתית ופועל PBS pH 7.4 דרכו. כובע לאהוא חלק תחתון של העמודה ולהוסיף 2 מיליליטר של צימוד מאגר.
- הוסף את הנפח הרצוי של תרחיף (4 מיליליטר להשיג 2 מיליליטר של שרף) לעמודה, להסיר את הכובע התחתון ולתת לטמיון הטור. יש לשטוף את העמודה עם סך של 6 מיליליטר (3 שרף-מיטת נפח) של צימוד מאגר ולאפשר לטור לניקוז. לאחר חיץ הצימוד נקז, להחליף את הכובע התחתון.
- להוסיף 2-4 מיליליטר של החלבון התלוי בצימוד מאגר לעמודה (לשמור aliquot של פתרון החלבון כדי להעריך את יעילות הצימוד על ידי השוואת ריכוז החלבון של eluate בשלב 2.11 או באמצעות הספיגה ב 280 ננומטר או assay bicinchoninic) . כובע ולערבב סוף על הסוף יש פתרון הומוגני.
- שוקל צינור microcentrifuge 1.8 מיליליטר ריק ולעבור למנדף. להעביר NaCNBH 3 (על 0.05 ז) בזהירות בצינור-שקל מראש. סגור את הצינור ולשקול את הצינור המכיל NaCNBH 3. אל תפתחו את הצינור מחוץ למכסת המנוע.
- בהתבסס על המשקל שלNaCNBH 3 הועבר לתוך הצינור, להפוך את פתרון 5 M על ידי הוספת 1 M NaOH. המשקל המולקולרי של NaCNBH 3 הוא 62.84 גרם לכן 0.05 גרם שווה (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 -4 שומות) 7.96 x 10 -4 שומות. כדי להפוך 5 M להוסיף פתרון (7.96 x 10 -4 / 5) 159 μl של 1 M NaOH.
- למדוד הנפח הכולל של התגובה לוקח את שרף הנפח בחשבון. הוסף 10 μl 5 M NaCNBH 3 לכל מיליליטר של תגובה.
- לדוגמא: עבור 4 מיליליטר נפח תגובה להוסיף 40 μl 5 M NaCNBH 3. ל1 מיליליטר של שרף ושל 3 מיליליטר חלבון הוסיף, הנפח הכולל הוא 4 מיליליטר.
- מכסה את הטור ולערבב סוף על הסוף. אבטח את הטור על הכתף צינור ולתת את התגובה להמשיך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- בבוקר, להביא את הטור למכסת המנוע הכימי ובזהירות להסיר את הכובע כמו כמה גז ייתכן שנוצר. מסננים את העמודה לתוך צינור נקי ולשמור eluate למדוד את קון החלבוןcentration באמצעות הספיגה ב שיטת ננומטר 280 12 או assay חומצת bicinchoninic ולהשוות אותו עם ריכוז החלבון מתחיל בצעד 2.6.
- לשטוף את השרף עם 4 מיליליטר של צימוד הצפת ולתת לטמיון הטור.
3. אתרי חסימה נותרה
- לשטוף את השרף עם 4 מיליליטר של חיץ מרווה. מסננים ולהחליף את הכובע התחתון. הוסף 2 מיליליטר של חיץ מרווה ולהשעות את השרף.
- להעריך את סך נפח תגובה על ידי מדידת נפח השרף ומרווית חיץ הנפח ולאחר מכן להוסיף 10 μl 5 M NaCNBH 3 לכל מיליליטר של נפח תגובה.
- מערבבים בעדינות בטמפרטורת חדר למשך 30 סוף-על-קצה דק '. לאחר 30 דקות, להביא את הטור במנדף. מוציא בזהירות את החלק העליון ולאחר מכן להסיר את הכובע התחתון ולתת לטמיון העמודה לתוך צינור פסולת.
- לשטוף את העמודה עם 5 כרכי שרף של פתרון לשטוף. צג שוטף לנוכחות של חלבונים שיורית על ידי מדידת abso של eluaterbance ב 280 ננומטר. חלבוני נחק נשטפים החוצה על ידי ריכוז מלח הגבוה.
- לשטוף את השרף עם 6 מיליליטר של 7.4 אזיד degassed PBS pH מכיל 0.02% נתרן. שמור את הטור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
4. טיהור של נוגדנים ספציפיים Nurr1
- יש לשטוף את הטור בשילוב Nur77 LBD עם 10 מיליליטר של PBS pH 7.4 ולתת לטמיון הטור. מכסה את החלק התחתון של העמודה ולמקם את טור Nur77 LBD סחוט בשילוב בצינור איסוף 15 מיליליטר חדש.
- הוסף 5 מיליליטר של חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים, מכסה את הטור ומקום על הכתף ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את המכסים העליונים ותחתונים ולאסוף את הזרימה דרך. מניח בצד על קרח עד מוכן להוסיף לעמודה בשילוב Nor1 LBD.
- יש לשטוף את הטור בשילוב Nor1 LBD עם 10 מיליליטר של PBS pH 7.4 ולתת לטמיון הטור. מכסה את החלק התחתון של העמודה ולמקם את LBD Nor1 טור בשילוב בצינור איסוף 15 מיליליטר.
- הוסף את הזרימה דרך מהפיכת Nur77 LBDטור הוביל, מכסה את הטור ומקום על הכתף על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את המכסים העליונים ותחתונים ולאסוף את הזרימה דרך.
- למדוד את ריכוז נוגדנים על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר.
ניתוח של מזוקקים אנטי-Nurr1 נוגדנים מבוסס ELISA 5.
- להוסיף חלבון 100 μl (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) לבארות של צלחת גם 96. אם בודק 3 חלבונים שונים, להוסיף חלבון 1 100 μl לA1 בארות לH4, של חלבון 2 100 μl, לA5 בארות לH8 ושל חלבון 3 100 μl לA9 בארות לH12. מכסה את הצלחת ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הבארות מצופים פעמיים עם 300 μl לכל גם של PBS pH 7.4 ולהוסיף 300 μl של חיץ חסימת ELISA לבארות אנטיגן כל מצופות דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר.
- בעוד הצלחת חוסמת להכין רצוי דילול החל מנוגדן אנטי Nurr1 מטוהר (החל 10-100 מיקרוגרם / מיליליטר) במאגר חסימת ELISA.
- לאחר 2 שעות של חסימה, להחליף את חיץ בלוק ELISA עם של חיץ לחסום ELISA טרי 100 μl לכל הבארות.
- הוסף לדילול נוגדן אנטי Nurr1 מטוהר 100 μl לכל הבארות בא השורה סדרו לדלל את הנוגדנים על ידי העברה של פתרון 100 μl משורה לבארות בשורת B ואחרי העברה של פתרון 100 μl מהשורה B לחתור C ממשיך עד לשורה ג 'לאחר ערבוב הפתרונות בבארות בשורת G להשליך 100 μl הנוסף. ולס בשורת H לקבל רק של חיץ חסימת 100 μl הראשוני. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
- לשטוף את הצלחת שלוש (3) פעמים עם 300 μl לכל גם של 0.05% Tween 20 בPBS pH 7.4 ולמחוק את הצלחת כדי להסיר חיץ לשטוף עודף.
- הוסף לסוסי צנון Peroxidase (HRP) IgG נגד הארנב עיזים מצומדות מדולל במאגר בלוק ELISA 100 μl (1: 8,000 דילול; מגוון הטיפוסי הוא בין 1: 5000 עד 1: 25,000). דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
- שטוף את ה הצלחתרי (3) פעמים כמתואר ב5.6. יש לשטוף את כל הבארות על ידי מילוי אותם עם 300 μl מים ללא יונים. כתם מים עודפים על ידי היפוך לצלחת על נייר סופג.
- להוסיף 3 100 μl, 3 ', 5, 5' tetramethylbenzidine (חימם לטמפרטורת חדר) לכל בארות דגירה 15 עד 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר.
- לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl של 2 NH 2 SO 4.
- קראו הספיגה ב 450 ננומטר הפחתת רקע ב 650 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השוואה של חלבון נוגדני Nurr1 ספציפי עמודה מטוהרת עם חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים ואחרי המעבר בNur77 LBD וNor1 LBD עמודות מוצגים באיור 1. כפי שניתן לראות, מטוהר נוגדן Nurr1 חלבון הציגה חזק מחייבת לNurr1 LBD. עם זאת, הוא גם הוכיח משמעותי מחייב Nur77 LBD וNor1 LBD. כאשר נוגדני Nurr1-מטוהר חלבון היו מטוהרים נוסף נגד Nur77 LBD וNor1 LBD, הזיקה הסופית מטוהרת נוגדני Nurr1 הציגו ספציפיים מחייבים Nurr1 LBD עם גילוי מחייב לNur77 LBD או Nor1 LBD, הוכחה כי התגובה הצולבת שלו לNur77 וNor1 הייתה הוסר לחלוטין.
הספציפיות זה לידי ביטוי נוסף בניתוח כתם המערבי של תמציות מתא CHO transfected עם וקטורי ביטוי בספרים באורך מלא Nurr1, Nor1, או Nur77 התמזג MYC תיוג חלבון (איור 2). כantib הצפוי, אנטי-mycodies גילה כי כל חלבון באורך מלא בא לידי ביטוי במשקל המולקולרי הצפוי שלה. בהסכם עם תוצאות ELISA, מטוהר נוגדן ספציפי חלבון Nurr1 חסונה זוהה באורך מלא Nurr1 אלא גם זוהו Nor1 וNur77 אם כי פחות ביעילות. לעומת זאת, נוגדן Nurr1 המטוהר לחלוטין לא הציג כל תגובה צולבת לזיהוי ולNor1 Nur77 ידי ELISA או כתם מערבי ניתוחים.
לבסוף, נוגדן Nurr1 המטוהר לחלוטין שימש לניתוח immunohistochemical של נוירונים מד"א. זה מתועד היטב כי Nurr1, אבל לא homologs הקרוב Nor1 וNur77, בא לידי ביטוי באופן בולט במכרסמים ונוירונים מד"א אדם בשני mRNA ורמות חלבון 14,15. השימוש בנוגדן Nurr1 מטוהר לחלוטין אישר כי Nurr1 מתבטא כמעט באופן בלעדי בגרעין של תאי עצב מד"א באזור nigra substantia (איור 3).
איור 1: השוואת ELISA של צלב reactivities-של נוגדנים נגד Nurr1 לפני ואחרי הטיהור על ידי מעבר דרך LBDs Nur77 וNor1 עמודות בשילוב חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים (0.156 מיקרוגרם / מיליליטר) (א) או חלבון מטוהר ואחריו. כרומטוגרפיה על עמודות מצמידות LBD Nor1 וNur77 נוגדנים נגד Nurr1 (0.156 מיקרוגרם / מיליליטר) (ב) נוספו לבארות של 96 צלחת גם מצופות של 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר של או Nurr1 LBD, Nor1 LBD או Nur77 LBD 100 μl. ELISA בוצע כפי שתואר בסעיף השיטה.
איור 2: זיהוי ספציפי של אורך מלא Nurr1 לידי ביטוי בתאי CHO באמצעות הנוגדן ספציפי Nurr1 המטוהר באופן מלא באורך מלא Nurr1, חלבוני Nor1, וNur77 באו לידי ביטוי כmyc מתויג.חלבוני היתוך בתאי CHO וזוהה על ידי נוגדנים ספציפיים Myc (א), מטוהר נוגדן Nurr1 חלבון (ב), ונוגדן מטוהר לחלוטין Nurr1 (ג). נוגדנים נגד אקטין משמשים לבקרת טעינת חלבון (ד). כל DNA מתויג Myc באורך מלא (משקל מולקולרי של 65, 66, ו -69 kDa לNurr1, Nur77, Nor1, בהתאמה) היה transfected זמני לתאי CHO ואת אותה הכמות של תמציות תא הועמסה בכל מסלול. ליין 1: שליטה שלילית בהיקף של תאי תמציות CHO transfected עם וקטור ריק; מסלול 2: myc-Nurr1; מסלול 3: myc-Nur77; מסלול 4: myc-Nor1.
איור 3:. נוגדן Nurr1 הספציפי המטוהר לחלוטין במיוחד מזהה נוירונים דופאמין טירוזין-hydroxylase חיובי נוירונים דופמין מוח תיכונים בnigra substantia הם חיוביים לNurr1, כמו דוארxamined ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות הנוגדנים ספציפיים Nurr1 המטוהרים באופן מלא. יש לציין, Nurr1 היה מקומי בגרעין של תאי עצב מד"א. TH (hydroxylase טירוזין). בר סולם = 100 מיקרומטר. בר סולם במיזוג קופסא לבן הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמכת על הזמינות של חלבונים טהורים לאפיון הנוגדנים שהועלו נגד חבר ספציפי של משפחת החלבון של עניין. אין צורך לטהר את הנוגדנים באמצעות חלבון / G עד שברור נקבע כי יש reactivities הצולב משמעותי על ידי ELISA ומערבי סופג.
כאמור בטקסט, חשוב להימנע מהשעיית החלבון (ים) להיות בין-צמוד לטור במאגר המכיל אמין כמו טריס או גליצין. יתר על כן ריכוז החלבון האופטימלי המשמש לcross-linking צריך להיקבע באופן אמפירי. יותר מדי חלבון בעמודה עלול לגרום להפרעה סטרית בעוד מעט מדי תפחית את היעילות של ספיחה. לכן, זה רעיון טוב כדי לבדוק את ריכוזי חלבון הנעים 2-10 מ"ג / מיליליטר ולהעריך את האיכות של הנוגדנים וכתוצאה מכך.
מספר גורמים יש לקחת בחשבון כאשר ההוא טכניקה לא מצליחה להניב נוגדנים ספציפיים מאוד. אלה כוללים: יעילות cross-linking, אובדן תחום immunoreactive, וdenaturation חלבון צולבים. כאמור בפרוטוקול, ניטור יעילות צולבת קישור מאפשר הקביעה כי יותר מדי או מעט מדי חלבון הוא להיות משותק בטור. אם באמצעות אמינים תגובת הקישור צולבים חשוד בהשמדת תחום immunoreactive (ים), קיבוע באמצעות הקבוצה קרבוקסיליות או באמצעות פחמימות צריכים להיחשב.
חשוב לעקוב אחר היעילות של ההליך להניב באופן עקבי נוגדנים ספציפיים מאוד. למטרות התחדשות, העמודות חייבת להיות חשופה של נוגדני צלב-reactive קשורים אליהם באמצעות תנאים קשים (pH גבוה או נמוך). זה גורם לשיעור גבוה יותר של חלבונים צולבים להיות מפוגל ביעילות, הפחתת ביצועי העמודה.
התוספת של סוכני חסימה בELISA וWesteסופג rn משמש בדרך כלל עם רמת הצלחה של הוגנת. עם זאת, הגישה שתוארה בסרט הזה מגדילה את ההסתברות להצלחה של ומפחיתה את הצורך בשמירה על כמויות גדולות של חלבוני חוצי התגובה על ידו. כחומרים כימיים ושיטות כדי לשתק חלבונים לכרומטוגרפיה תקשורת לשמור על שיפור, גישה זו תתרום לזיהוי של מחזור תאים הפכו נוגדנים ספציפיים.
גישה זו היא מוגבלת על ידי הזמינות של חלבונים טהורים. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא התלות בקיפול נכון בעת שימוש בתחומי חלבון. אם תחומים החלבון לא לקפל כמו בכל החלבון, האסטרטגיה מראש הספיחה לא עשויה להניב נוגדנים שיכולים בקלות לזהות את חבר החלבון של עניין בעת ניתוח תמציות תא או רקמה.
חלבונים של אינטרסים רבים שייכים למשפחות (תת) של חלבונים עם הומולוגיות רצף חומצות אמינו הגבוה. אפיון וiDEN פונקציונלייםtification של ההפצה של חלבונים לעתים קרובות מסתמך על הזמינות של נוגדנים ספציפיים של כל בן משפחה נגד. הומולוגיות חומצת אמינו הגבוה בין חברי חלבון באותה המשפחה תורמות לקשיים ביצירת נוגדנים ספציפיים מאוד. באמצעות נוגדני צלב-reactive אלה לעתים קרובות להוביל לתוצאות סותרות.
דוגמא אחת לכך היא Nurr1 קולט הגרעיני היתום ששייך לתת משפחת NR4A של קולטנים גרעיניים, יחד עם Nur77 וNor1. מאז שלושת הגורמים הללו חולקים רמה גבוהה של הומולוגיה חומצת אמינו, נוגדנים נגד כל גורם להראות reactivities צלב משמעותי, שיפגע בניתוח מדויק של כל אחד מגורמים.
באמצעות חברי NR4A אלה כדוגמא, אפשר היה ליצור נוגדני Nurr1 מאוד ספציפיים ללא reactivities לNor1 או Nur77. מאז LBDs לשתף פחות הומולוגיה מתחומי DNA המחייבים, LBD של כל חלבון בא לידי ביטוי ומטוהר ולאחר מכן השתמש כדי שmprove את הספציפיות של הנוגדנים נגד Nurr1. בתחילה, נוגדנים נגד LBD של Nurr1 הציגו רמות צנועות אך משמעותיות של תגובתיות צולבת לחלבונים האחרים, כנבדקו על ידי ELISA וכתם מערבי הניתוחים. עם זאת, כאשר נוגדני Nurr1-מטוהר חלבון היו מטוהרים נוספים דרך מראש ספיחה נגד תחומים LBD צלב-reactive של Nur77 וNor1, נוגדן Nurr1 וכתוצאה מכך לא הראה שום תגובתיות צולבת, כנבדק על ידי כתם מערבי וELISA הניתוחים של Nurr1 זוהה בהבלטה -expressing נוירונים תובע באזורי המוח התיכון. נתונים הכתם המערביים וELISA ניתוחים מסכימים באופן הדוק אחד עם השני, מצביעים על כך שניתוחים אלו יכולים להיות משלימים ולתמוך זה בזה.
יחדיו, אסטרטגית טיהור נוגדן זה תהיה מאוד שימושי ביצירת נוגדנים ספציפיים על ידי ביטול תגובתיות הצולבת לחברי חלבון הומולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
