Introduction
O factor de transcrição e os seus homólogos de Nurr1 (Nur77 e NOR1) pertencem à subfamília de receptores nucleares 4A (NR4A) 1. Eles também são receptores órfãos porque seus ligantes endógenos ainda não foram identificados. Nurr1 foi primeiro clonado em 1992 e, embora conhecido por ser expresso no cérebro 2, o seu papel essencial para o desenvolvimento e manutenção de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo foi revelado por estudos de ratinho knockout 3. Além disso, o seu importante papel para a manutenção dos neurônios de dopamina do mesencéfalo foi recentemente demonstrado por um estudo nocaute condicional 4. Devido a estes estudos elegantes mostrando papéis críticos do Nurr1 para os neurônios de dopamina do mesencéfalo, muitos estudos subsequentes em grande parte focado no neurônios de dopamina e de doenças neurodegenerativas relacionadas com a dopamina do mesencéfalo, doença de Parkinson (DP) 5.
Notavelmente, Nurr1 se expressa não apenas nos neurônios de dopamina do mesencéfalo (MDA), mas também em diáreas cerebrais verso 2, sugerindo que ele pode ter papéis funcionais em muitas áreas não-Da, que é fortemente apoiada por estudos mais recentes que mostram que Nurr1 desempenha papéis importantes em várias funções cerebrais. Por exemplo, demonstrou-se que as actividades de memória induzir tal como a aprendizagem, ou outras tarefas hipocampo-dependentes resultar em aumento da regulação da expressão no hipocampo Nurr1 6,7. Além disso, derrubar Nurr1 de expressão no hipocampo foi suficiente para prejudicar a memória a longo prazo e / ou a plasticidade sináptica 8-11, sugerindo fortemente que Nurr1 desempenha diversos papéis em muitas áreas do cérebro. Assim, para melhor compreender a expressão específica do tipo celular e subcelular de Nurr1, é desejável a utilização de anticorpos específicos de Nurr1, que não apresentam qualquer reactividade cruzada com os seus homólogos Nur77 ou NOR1. Este documento descreve um protocolo de pré-adsorção para gerar anticorpos específicos de Nurr1 e apresentar dados adicionais mostrando a sua especificidade.
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Protocol
Nota: A composição de todas as soluções a seguir indicadas podem ser encontrados na Tabela Materiais / Equipamento.
1. Proteína A coluna de anticorpo Purificação
- Equilibrar a coluna de proteína A rotação e todos os tampões necessários à temperatura ambiente durante 15 min antes de iniciar o procedimento.
- Diluir o soro imune 1: 1 com a proteína A de IgG Binding Buffer. (5 ml de soro é recomendado).
- Bata levemente uma coluna de proteína rodada na bancada para desalojar qualquer resina que pode ser apresentado na tampa. Remova a tampa superior e encaixe delicadamente fora do fecho da parte inferior. Inserir a coluna no tubo de recolha de 15 ml de solução de armazenamento e permitir o seu escoamento.
- Adicionar 5 ml de Proteína A IgG tampão de ligação e permitir que a solução escorra.
- Aplicar o soro imune diluído para a coluna e recolher o fluxo de passagem. Para melhores resultados, adicionar um volume de amostra que contém uma concentração de anticorpos menos de 80% da ligação do anticorpo-capacit da colunay.
- Lava-se a coluna com 15 ml de Proteína A IgG Binding Buffer ou até a absorvância a 280 nm é inferior a 0,1.
- Adicione 100 ml de Neutralização Buffer para cinco tubos de coleta marcadas.
- Adicionar 5 ml de tampão de eluição de IgG ao da Proteína A coluna e recolher fracções de 1 ml em cada um dos tubos contendo 100 ul de tampão de neutralização.
- Medir a absorção de cada fração de 280 fracções nm e piscina com uma absorvância superior a 0,5. Mantenha as fracções reunidas em gelo até estar pronto para diálise.
- Regenerar a coluna por adição de 8 ml de tampão de eluição de IgG e permitir que a solução flui através da coluna.
- Lavar a coluna com solução de ligação a IgG da Proteína A, até os retornos eluente de pH para 7,4.
- Armazenar a coluna através da adição de 5 ml de solução de armazenamento (azida de sódio a 0,02% em PBS). Quando cerca de 3 ml permanecem na coluna, tampa inferior e prenda a tampa superior. Armazenar a coluna a 4 ° C.
- Determinar o comprimento Of tubagem de diálise necessária de acordo com as instruções do fabricante. Usando tubagem plana 16 milímetros de diâmetro utilizar 5,47 centímetro de comprimento do tubo por ml de solução a ser dialisado. Cortar o tubo e enxaguar com PBS pH 7,4 durante 15 a 30 min.
- Dobrar e cortar uma extremidade do tubo de diálise, a transferência de IgG reunida continha as fracções para tubo de diálise equilibrada em PBS pH 7,4 e fechar a outra extremidade.
- Dialisar à temperatura ambiente contra 200 volumes de PBS, pH 7,4 durante 2 horas.
- Mudar o tampão de diálise (PBS fresco pH 7,4) e dializar durante mais 2 horas à temperatura ambiente.
- Mudar o tampão de diálise (PBS fresco pH 7,4) e diálise durante a noite a 4 ° C.
- Manter a solução de anticorpo dialisado a 4 ° C até estar pronto para prosseguir com outros passos de purificação.
- Avaliar a concentração de anticorpo utilizando a sua absorvância a 280 nm, e o coeficiente de absorção molar de anticorpos a 280 nm de 210,000 M-1 cm-1 12.
2. Acoplamento de proteínas LBD para Aminolink Resina Acoplamento
- Prepare duas colunas, uma para a outra e NOR1 para Nur77. Seguir o mesmo protocolo para ambas as proteínas.
- Descongelar a proteína a ser acoplada à resina em gelo. Determinar a concentração de proteína utilizando o seu coeficiente de extinção molar e a sua absorvância a 280 nm de 12.
- Em alternativa, usar um ensaio de determinação de proteínas, tais como o ensaio de ácido bicinconínico 13. Se a proteína é dissolvida num tampão de diálise de troca contendo amina ou tampão contra a atrelagem. Se a proteína é de um tampão adequado (não há aminas livres) dilua 4 vezes em tampão de acoplamento.
- Utilizar 2 ml de resina por 2 mg de proteína. Todos os passos que se seguem são para a resina de 2 ml numa coluna de 10 ml. Até 10 mg de proteína pode ser ligado por 1 ml de resina (2 ml de 1: 1) pasta.
- Prepara-se uma coluna de 10 ml por meio de uma frita de empurrar para o fundo e rodando PBS pH 7,4 através dele. Cap tele parte inferior da coluna e adicionar 2 ml de tampão de acoplamento.
- Adicionar o volume pretendido de suspensão (4 ml para se obter 2 ml de resina) para a coluna, remover a tampa de fundo e deixar a coluna de drenagem. Lavar a coluna com um total de 6 ml (volume de leito de resina 3) de atrelagem e permite que a coluna para drenar. Depois que o tampão de acoplamento tenha escorrido, recoloque a tampa inferior.
- Adicionar 2-4 ml de proteína suspensa em tampão de acoplamento para a coluna (manter-se uma alíquota da solução de proteína para avaliar a eficiência de acoplamento por comparação da concentração de proteína do eluato na etapa 2.11 usando a absorvância a 280 nm ou o ensaio de ácido bicinconínico) . Tampa e misture sobre a extremidade final para ter uma solução homogénea.
- Pesar um tubo de microcentrífuga de 1,8 ml vazio e passar para a capela. Transferir cuidadosamente NaCNBH3 (cerca de 0,05 g) no tubo pré-pesado. Fechar o tubo e pesar o tubo contendo NaCNBH3. Não abra o tubo fora do capô.
- Com base no peso deNaCNBH3 transferida para o tubo, fazer uma solução 5 M por adição de NaOH 1 M. O peso molecular de NaCNBH3, por conseguinte, é 62,84 g 0,05 g é igual a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 mol) 7,96 x 10 -4 mol. Para fazer uma solução 5 M de suplemento (7,96 x 10 -4 / 5) 159 ul de NaOH 1 M.
- Medir o volume total da reacção de tomar o volume de resina em consideração. Adicionar 10 ul de 5 M NaCNBH3 por ml de reacção.
- Por exemplo: para um volume de reacção 4 ml de adicionar 40 ul de 5 M de NaCNBH3. Para 1 mL de resina e 3 ml de proteína adicionado, o volume total é de 4 ml.
- Tampe a coluna e misturar sobre a extremidade final. Fixar a coluna num rotor tubo e deixar a reacção prosseguir durante a noite a 4 ° C.
- Na parte da manhã, trazer a coluna para a capa química e retire cuidadosamente a tampa como um pouco de gás pode ter se formado. Drenar a coluna para um tubo limpo e guardar o eluato para medir a proteína concentração usando a absorvância a 280 nm, método 12 ou o ensaio de ácido bicinconínico e compará-la com a concentração de proteínas a partir de passo 2.6.
- Lavou-se a resina com 4 ml de tampão de acoplamento e deixar a coluna de drenagem.
3. Bloqueio restante Sites
- Lavou-se a resina com 4 ml de tampão de têmpera. Escorra e coloque a tampa inferior. Adicionar 2 ml de tampão de têmpera e suspender a resina.
- Avaliar o volume total da reacção por medição do volume de resina e do volume de tampão de têmpera, em seguida, adicionar 10 ul de 5 M de NaCNBH3 por ml de volume de reacção.
- Misturar suavemente à temperatura ambiente durante 30 min-extremidade sobre extremidade. Depois de 30 minutos, trazer a coluna no exaustor de fumos. Remova cuidadosamente a parte superior e, em seguida, retire a tampa do fundo e deixar o dreno coluna em um tubo de resíduos.
- Lavar a coluna com 5 volumes de resina de solução de lavagem. Monitorizar as lavagens para a presença de proteínas residuais medindo abso do eluatorbance a 280 nm. Proteínas desacoplados são lavados para fora pela concentração elevada de sal.
- Lavou-se a resina com 6 ml de PBS desgaseificado pH 7,4 contendo azida de sódio a 0,02%. Manter a coluna a 4 ° C até ser necessário.
4. Purificação de anticorpos específicos Nurr1
- Lavar a coluna acoplada Nur77 LBD com 10 ml de PBS pH 7,4 e deixa a coluna de drenagem. Tapar o fundo da coluna e colocar a coluna acoplada Nur77 LBD drenada em 15 ml de um novo tubo de recolha.
- Adicionam-se 5 ml de proteína A anticorpos anti-Nurr1 purificados, tampão da coluna e lugar num agitador rotativo a 4 ° C durante 1 h. Remova as tampas superior e inferior e recolher o fluxo através. Separe em gelo até estar pronto para adicionar à coluna acoplada NOR1 LBD.
- Lavar a coluna acoplada NOR1 LBD com 10 ml de PBS pH 7,4 e deixa a coluna de drenagem. Tapar o fundo da coluna e colocar o NOR1 LBD coluna acoplada em um tubo de recolha de 15 ml.
- Adicionar o fluxo através do golpe Nur77 LBDlevou coluna, tampão da coluna e lugar num agitador rotativo a 4 ° C durante 1 hora. Remova as tampas superior e inferior e recolher o fluxo através.
- Medir a concentração de anticorpos através da medição da absorvância a 280 nm.
Análise baseada em ELISA de 5. purificada Anticorpo Anti-Nurr1
- Adicionar 100 ul de proteína (2,5 ug / ml) aos poços de uma placa de 96 poços. Se testar três diferentes proteínas, adicione 100 ml de proteína de 1 a poços A1 a H4, 100 l de proteína 2, a Wells A5 para H8 e 100 l de proteína 3 a poços A9 para H12. Cobrir a placa e incubar durante a noite a 4 ° C.
- Lavar os poços revestidos duas vezes com 300 ul por poço de PBS, pH 7,4 e adicionar 300 ul de tampão de bloqueio de ELISA para os antigénios inteiros poços revestidos e incubar 2 horas à temperatura ambiente.
- Enquanto o prato está a bloquear preparar uma diluição de partida desejado purificado do anticorpo anti-Nurr1 (variando de 10 a 100 ug / ml) em tampão de bloqueamento de ELISA.
- Após 2 horas de bloqueio, substitua o buffer do bloco de ELISA com 100 ul de tampão de bloqueio fresco ELISA para todos os poços.
- Adiciona-se 100 ul de anticorpo purificado anti-Nurr1 diluída a todos os poços em linha em série A. diluir os anticorpos por transferência de 100 ul de solução da linha A para a linha B em poços seguidos por transferência de 100 ul de solução de linha B para a linha C continuando até a linha G. Depois de misturar as soluções em poços na fileira G descartar as extra de 100 mL. Wells em linha H só recebem os primeiros 100 ml de tampão de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lava-se a placa três (3) vezes com 300 ul por cavidade de 0,05% de Tween 20 em PBS pH 7,4 e seque a placa para remover o excesso de tampão de lavagem.
- Adicionar 100 ul de peroxidase de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de coelho diluído em tampão de bloqueio de ELISA (1: 8000 de diluição, a gama típica é de 1: 5000 a 1: 25.000). Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lavar as th placaree (3) vezes, como descrito em 5.6. Lave todos os poços, preenchendo-os com 300 mL de água deionizada. Remova o excesso de água invertendo a placa sobre papel absorvente.
- Adicionar 100 ul de 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbenzidina (aquecida até à temperatura ambiente) a todos os poços e incubar 15 a 30 min no escuro à temperatura ambiente.
- Parar a reacção por adição de 50 ul de 2 NH 2 SO 4.
- Ler a absorvância a 450 nm subtraindo fundo a 650 nm.
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Representative Results
Uma comparação da coluna de proteína A purificada anticorpos específicos para a proteína A Nurr1 com anticorpos anti-Nurr1 purificados seguido por passagem através de colunas Nur77 LBD e NOR1 LBD é mostrado na Figura 1. Tal como pode ser visto, Proteína-A purificada Nurr1 anticorpo exibiram uma forte ligação para Nurr1 LBD. No entanto, também mostraram ligação significativa a Nur77 LBD e NOR1 LBD. Quando os anticorpos Nurr1-A proteína purificada foram ainda purificados contra Nur77 LBD e NOR1 LBD, a afinidade de anticorpos purificados finais Nurr1 exibiu ligação específica a Nurr1 LBD com ligação não detectável a Nur77 LBD ou NOR1 LBD, demonstrando que a sua reactividade cruzada com Nur77 e foi NOR1 completamente removido.
Esta especificidade foi ainda demonstrada através de análise Western blot de extractos a partir de células CHO transfectadas com vectores de expressão que transportam comprimento completo Nurr1, NOR1, ou Nur77 fundido a marcação da proteína Myc (Figura 2). Como esperado, ANTIB anti-mycodies revelou que cada uma das proteínas de comprimento completo foi expressa no seu peso molecular esperado. De acordo com os resultados de ELISA, Proteína-A purificada Nurr1 anticorpo específico robustamente detectado de comprimento completo mas também detectada Nurr1 NOR1 e Nur77 embora menos eficientemente. Em contraste, o anticorpo Nurr1 totalmente purificada não exibiram qualquer reactividade cruzada detectável com NOR1 e Nur77 por ELISA ou análise de transferência de Western.
Por fim, o anticorpo totalmente Nurr1 purificada foi utilizada para a análise imuno-histoquímica de neurónios MDA. É bem documentado que Nurr1, mas não os seus homólogos próximos NOR1 e Nur77, está proeminentemente expressa em roedores e humanos MDA neurônios, tanto ARNm e os níveis de proteína 14,15. O uso do anticorpo Nurr1 totalmente purificado confirmou que Nurr1 é expressa quase exclusivamente em neurónios do núcleo de MDA na área da substantia nigra (Figura 3).
Figura 1: Comparação ELISA de reactividade cruzada de anticorpos anti-Nurr1 antes e após a purificação por passagem através de Nur77 e NOR1 LBDs colunas acopladas de Proteína A anticorpos anti-Nurr1 purificadas (0,156 ug / mL) (a) ou proteína A purificada, seguido de. cromatografia em colunas NOR1 e Nur77 LBD acoplados anticorpos anti-Nurr1 (0,156 ug / ml) (b) foram adicionados a poços de placa de 96 poços revestidas com 100 uL de 2,5 ug / ml de Nurr1 ou LBD, NOR1 LBD ou Nur77 LBD. O ELISA foi realizado como descrito na secção de método.
Figura 2: A detecção específica de Nurr1 de comprimento completo expressa em células CHO, utilizando o anticorpo específico de Nurr1 totalmente purificada Full-length Nurr1, proteínas NOR1, e Nur77 foram expressos como myc marcados.proteínas de fusão em células CHO e detectados por anticorpos específicos de Myc (um), Proteína-A purificada anticorpo Nurr1 (b), e anticorpo Nurr1 totalmente purificada (C). Os anticorpos anti-actina utilizados para controlo de carga de proteína (d). Cada ADN marcada com myc de comprimento completo (massa molecular de 65, 66, e 69 kDa para Nurr1, Nur77, NOR1, respectivamente) foi transientemente transfectada para células de CHO e a mesma quantidade de extractos celulares foram carregadas em cada faixa. Pista 1: controlo negativo que consiste em extractos de células CHO transfectadas com um vector vazio; pista 2: Myc-Nurr1; pista 3: Myc-Nur77; pista 4: Myc-NOR1.
Figura 3:. O anticorpo específico da Nurr1 totalmente purificada detecta especificamente os neurónios de dopamina-tirosina-hidroxilase positiva neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo na substantia nigra são positivos para Nurr1, como examined por imuno-histoquímica utilizando anticorpos específicos de Nurr1 completamente purificados. Notavelmente, Nurr1 estava localizada no núcleo de neurónios MDA. TH (tirosina hidroxilase). Barra de escala = 100 pm. Barra de escala na caixa branca de mesclagem é de 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O sucesso deste protocolo baseia-se na disponibilidade de proteínas puras para a caracterização dos anticorpos criados contra um membro específico da família de proteínas de interesse. Não há necessidade de purificar os anticorpos utilizando proteína A / G até que seja claramente estabelecido que existem significativas reacções cruzadas por ELISA e Western blot.
Conforme indicado no texto, é importante para evitar a suspensão de proteína (s) a ser reticulado à coluna num tampão contendo amina tais como Tris ou glicina. Além disso, a concentração óptima de proteína usada para a ligação cruzada deve ser determinada empiricamente. O excesso de proteína na coluna pode resultar em bloqueio estérico, enquanto muito pouco reduziria a eficiência de adsorção. Portanto, é uma boa ideia para testar concentrações de proteína na gama de 2 a 10 mg / ml e para avaliar a qualidade dos anticorpos resultantes.
Vários fatores devem ser considerados quando thé técnica falha para se obter anticorpos altamente específicos. Estes incluem: eficiência reticulação, perda de domínio imunorreactivo, e desnaturação da proteína de ligação cruzada. Tal como referido no protocolo, a monitorização de reticulação eficiência permite a determinação de que a proteína muito ou muito pouco tem sido imobilizado na coluna. No caso de suspeita de ligação cruzada reactivos com aminas de destruir domínio imunorreactivo (s), a imobilização através do grupo carboxílico ou através de hidratos de carbono devem ser considerados.
É importante para controlar a eficiência do processo para produzir de forma consistente os anticorpos altamente específicos. Para fins de regeneração, as colunas devem ser despojado dos anticorpos de reação cruzada vinculados a eles usando condições adversas de pH (alta ou baixa). Isto faz com que uma percentagem cada vez maior de proteínas de ligação cruzada para ser eficazmente desnaturados, reduzindo o desempenho da coluna.
A adição de agentes de bloqueio de ELISA e Westeblotting rn é comumente usado com um nível razoável de sucesso. No entanto, a abordagem descrita neste vídeo aumenta a probabilidade de sucesso e reduz a necessidade de manutenção de grandes quantidades de proteínas com reactividade cruzada na mão. À medida que os reagentes e os métodos para imobilizar proteínas a cromatografia meios de continuar melhorando, esta abordagem irá contribuir para a identificação de células transformadas que circulam anticorpos específicos.
Esta abordagem é limitada pela disponibilidade de proteínas puras. Outra limitação deste protocolo é a dependência de dobradura apropriada ao usar domínios de proteína. Se os domínios de proteína não se enrolam como em toda a proteína, a estratégia de pré-adsorção podem não produzir anticorpos que pode facilmente identificar o elemento de proteína de interesse na análise de extractos celulares ou de tecidos.
Muitas proteínas de interesse pertencem a (sub) famílias de proteínas com alto aminoácidos homologias de sequências de ácido. Caracterização funcional e identificação da distribuição das proteínas, muitas vezes dependem da disponibilidade de anticorpos específicos contra cada membro da família. As homologias de ácidos aminados alta entre os membros proteicos da mesma família contribuir para as dificuldades na produção de anticorpos altamente específicos. Usando estes anticorpos com reactividade cruzada muitas vezes levar a resultados conflitantes.
Um exemplo é o receptor nuclear Nurr1 órfão que pertence à subfamília de receptores nucleares NR4A, em conjunto com Nur77 e NOR1. Uma vez que estes três factores partilham um elevado grau de homologia de aminoácidos, anticorpos contra cada um dos factores mostram reactividade cruzada significativa, que dificultam a análise precisa de cada fator.
Usando estes membros NR4a como um exemplo, foi possível gerar anticorpos altamente específicos Nurr1 livre de reactividades para NOR1 ou Nur77. Uma vez que as partes menos LBDs homologia do que os domínios de ligação ao ADN, o LBD de cada proteína foi expressa e purificada e, em seguida, utilizada para improve a especificidade dos anticorpos anti-Nurr1. Inicialmente, os anticorpos contra LBD do Nurr1 exibiram níveis modestos, mas significativos de reactividade cruzada com outras proteínas, como examinado por ELISA e análises de Western blot. No entanto, quando os anticorpos Nurr1-A proteína purificada foram ainda purificadas através de pré-adsorção contra domínios LBD de reactividade cruzada e de Nur77 NOR1, o anticorpo Nurr1 resultante não mostrou qualquer reactividade cruzada, tal como foi analisado por transferência de Western e análise de ELISA de forma proeminente detectado Nurr1 -expressing neurônios DA nas áreas do mesencéfalo. Os dados de Western blot e ELISA análises concordam estreitamente entre si, o que indica que essas análises podem ser complementares e apoiar uns aos outros.
Tomados em conjunto, esta estratégia de purificação de anticorpo serão extremamente úteis para gerar um anticorpo específico ao eliminar a reactividade cruzada com membros de proteínas homólogas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
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