Introduction
血管内皮不仅是分隔的血液和组织的屏障层，它被认为是一个巨大的内分泌腺，绵延在整个血管树具有400平方米1的表面积。内皮的福祉是血管稳态的关键。的内皮机能障碍参与各种心血管疾病，包括动脉粥样硬化，血管炎和缺血/再灌注损伤， 等 2-4。迄今为止，涉及这些疾病的设置特定的细胞和分子机制尚未很好地理解，由于内皮的漫射解剖性质。
鼠标是研究的重要模型，因为遗传操作技术在小鼠比较发达的比任何其他哺乳动物物种。然而，由于主动脉的小尺寸使得enzymat原代鼠主动脉内皮细胞的分离被认为是特别困难内皮不切实际的IC消化。一些报道的方法分离和纯化的EC要求5-7。
该协议的目标是用一个简单的方法来从鼠标主动脉隔离和扩大血管内皮细胞，而无需使用任何特殊的设备。在这个协议中，新鲜分离的主动脉切成小片段，并接种到朝下以允许内皮出芽内皮的基质。段被删除后，内皮细胞在血管内皮青睐中等扩大，准备好两三个代后实验。所描述的方法的优点是：1）相当高数量的内皮细胞来自单一主动脉收获的; 2）细胞存活率保存良好; 3）不需要特殊的设备或技术。它提供了鉴定内皮细胞病理生理学特异性细胞和分子机制的一种有效手段。对于那些有兴趣谁在学习公关从任一基因敲除小鼠imary培养的内皮细胞，基因敲除小鼠中，或鼠疾病模型中，该协议是非常有用和易于实践。
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Protocol
1.主动脉的小鼠中分离
这里所描述的所有程序均通过的韦恩州立大学的机构动物护理和使用委员会批准。
- 把鼠标放到麻醉机的感应室。设置异氟烷流至4％结合25％的新鲜空气和75％ 的 O 2。 通过感应腔随后由专用的鼻锥异氟醚（诱导4％，±1.0％用于保养）用25％的新鲜空气和75％的O 2一起吸入麻醉鼠标。注：麻醉用异氟烷可以在75％氧气/ 25％空气中或在100％的氧气递送。
- 检查鼠标每隔5分钟，直到达到麻醉的适当水平（缺乏撤退到脚趾捏）。
- 取鼠标移出感应腔，并继续吸入异氟烷虽然连接到麻醉机专用的鼻锥。切换异氟烷流至1％，以保持麻醉。
- 虽然这是麻醉下，把鼠标到手术垫，放置在它的后面。使用磁带的实验室，以确保四肢。
- 使用加热灯，保持鼠标的温暖。保持该灯在适当的距离从鼠标，使得鼠标不会过热。
- 喷用70％乙醇的胸部。
- 用解剖剪来自中线打开腹部，并露出腹主动脉。打开胸腔暴露心脏和肺部。
- 切腹主动脉与在解剖剪刀释放血液中的中间。
- 填补了1毫升注射器（用25g针），用1毫升的PBS含1000 U / mL的肝素。注入含1000单位/毫升肝素到左心室的PBS中，灌注主动脉。推心脏和肺钳在大动脉到小鼠的右侧，露出胸主动脉。
- 快速使用微迪取出胸主动脉ssection镊子，把它放在冰冷的1X PBS（无菌），那么运输容器放入一个层流罩。
- 插入一个1毫升的注射器装配用25g针进入主动脉的一端，并轻轻冲洗以冰冷的PBS主动脉以除去血液。
- 使用显微解剖钳去除尽可能多的附加脂肪组织的和小的横向容器越好。
- 马上转移的主动脉内皮生长培养基。
- 切主动脉成用无菌手术刀刀片1毫米环。收获大约8 - 每10主动脉环。
- 打开使用一对显微解剖剪的每个主动脉环。
2.种子矩阵的主动脉段
- 在不使用时，保持生长因子减少基质中-20℃，以防止凝固。把生长因子减少基质中4℃至少过夜以允许完全解冻。
- 预冷6孔板枪头到-20℃，至少10分钟。置于冰上并涂覆6孔板一个孔用1mL基质的板，而不会引入任何气泡。放置板在37℃培养箱中20分钟，以使基质固化。
- 植入主动脉片上使用无菌显微解剖镊固化的基质。放置件内腔面朝下上的基质不接触内皮。放置3 - 4彼此接近的矩阵主动脉段。
- 加入足够的血管内皮细胞生长培养基，以保持湿润段（约200微升）。
- 孵育在37℃的板在5％CO 2的4至6小时。在一天结束时，加入足够的媒体覆盖主动脉段。
- 观察主动脉段相差显微镜下周期性地发芽。检查中等水平和细胞生长的每一天。添加媒体如有必要，要盖上主动脉段。
- 在第 4天，轻轻除去培养基并取出主动脉曲线段F使用无菌针而不中断生长的内皮细胞ROM基质。
- 添加2mL的新内皮细胞生长培养基中，并允许内皮细胞继续增殖基质2 - 3天。
3.小鼠主动脉内皮细胞的初始传代
- 涂层用明胶（0.1％）的新T12.5烧瓶中，孵育在37℃下30分钟。
- 用无菌37℃PBS仔细清洗矩阵板。
- 加入2毫升中性蛋白酶（50U /毫升）到矩阵板中，在与偶尔摇动摇杆平台室温孵育。检查相衬显微镜下的细胞，以确保大部分细胞被分离。
- 加入2毫升D-瓦尔的灭活中性蛋白酶。
- 仔细收集上清在15毫升离心管中。用2mL的D-缬氨酸洗涤板，并收集上清。
- 离心在900 xg离心所述细胞悬浮液在袋鼠5分钟米温度。
- 重悬在涂有明胶的T12.5烧瓶在4mL内皮细胞生长介质和板的细胞沉淀。孵育细胞在37℃，5％CO 2的2小时。
- 更换介质。孵育细胞在37℃，5％的CO 2，直到它们的85％ - 90％汇合。
4.传代的小鼠主动脉内皮细胞的
- 外套两个新T12.5烧瓶用明胶（0.1％），孵育在37℃下30分钟。预热胰蛋白酶-EDTA（0.25％胰蛋白酶，0.02 EDTA在PBS中）和无菌PBS在37℃下约15分钟。
- 用无菌37℃PBS仔细洗涤细胞。
- 添加0.5毫升胰蛋白酶-EDTA（0.25％胰蛋白酶，0.02 EDTA在PBS中）中，并在37℃孵育约1分钟，或直到大部分细胞转身。
- 添加2mL的内皮细胞生长培养基以停止消化。吸取细胞悬液上下烧瓶几次内。如有必要，可使用电池刮板以收集细胞。
- 收集在15毫升离心管中的细胞悬浮液。离心细胞悬浮液在900×g离心，在室温下5分钟。
- 重悬在涂有明胶2 T12.5烧瓶在4mL内皮细胞生长介质和板的细胞沉淀。孵育细胞在37℃，5％CO 2的2小时。
- 更换介质。孵育细胞在37℃，5％的CO 2，直到它们的85％ - 90％汇合。
- 使用鼠标主动脉内皮细胞后的2 - 3代。
5.表征小鼠主动脉内皮细胞的
- 重新板上的细胞。
- 涂层用明胶（0.1％）的6孔板，孵育在37℃下30分钟。用PBS冲洗板。
- 预加热胰蛋白酶-EDTA和无菌PBS中至37℃约15分钟。
- 清洗细胞，用无菌PBS中的3倍。添加0.5胰蛋白酶毫升/ EDTA对细胞，孵育约1分钟，在37℃õ- [R，直到大部分细胞转身。
- 添加2mL的内皮细胞生长培养基以停止消化。吸取细胞悬液上下烧瓶几次内。如有必要，使用细胞刮刀收集细胞。
- 收集在15毫升离心管中的细胞悬浮液。离心细胞悬浮液在900×g离心，在室温下5分钟。
- 弃去上清液，再悬浮在内皮细胞生长培养基中的细胞。种子涂有明胶的6孔板的细胞以3×10 5 /孔的密度。
- 孵育细胞在37℃，5％的CO 2过夜以使细胞附着到培养表面。
- DIL-AC-LDL摄取和荆豆 -lectin约束力。
- 存储1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'- tetramethylindo-羰花青高氯酸盐标记在-20℃乙酰低密度脂蛋白（语-AC-LDL）。染色之前，解冻冰语-AC-LDL。该股语-AC-LDL SOLU灰是1毫克/毫升。储存在4℃的FITC标记的荆豆凝集素（ 荆豆 -Lectin，1微克/毫升）。股票荆豆 -Lectin溶液是1毫克/毫升。商店赫斯特33342在4℃。股票的Hoechst 33342溶液为100微克/毫升。
- 添加的语-AC-LDL原液10微升至1毫升培养基中，以使10微克/毫升的最终浓度。
- 染色前，删除旧的介质，并用新的培养基洗涤细胞每孔。
- 取出新媒体，并添加语-AC-LDL染色网上平台。
- 孵育细胞在37℃，5％CO 2的1小时。
- 清洗细胞，用无菌1×PBS中的3倍。
- 加入1毫升10％福尔马林固定细胞。放于室温下的板约30分钟。
- 清洗细胞，用无菌1×PBS中的3倍。避免光线。
- 加入1毫升无菌1X PBS包含荆 -Lectin的10微升。
- 孵育在室温temperatu细胞重新在黑暗中保持1小时。
- 通过用无菌1×PBS中3次洗涤细胞除去荆豆凝集素。
- 添加的Hoechst 33342至1微克/毫升的最终浓度，孵育在黑暗中10分钟。
- 查看语-AC-LDL（红色，576纳米的激发波长）， 荆豆 -Lectin（绿色，519 nm的激发波长）和赫斯特的荧光（蓝色，361 nm的激发波长），用倒置荧光显微镜。
- 荧光染色CD31，VEGFR2，eNOS的，VE-cadherin和钙调节蛋白。
- 商店FITC缀合的抗小鼠CD31抗体，eNOS的抗体，VE钙粘蛋白抗体，FITC缀合的抗兔IgG在4℃下在黑暗中。商店VEGFR2抗体在-20℃。
- 清洗细胞，用无菌1×PBS中的3倍。
- 加入1毫升10％福尔马林固定细胞。放于室温下的板约30分钟。
- 清洗细胞，用无菌1×PBS中的3倍。
- 染色CD31，加入1毫升无菌1X的PBS包含CD31-FITC抗体10μL的。染色要么VEGFR2，eNOS的，VE钙粘蛋白或调宁蛋白，添加包含4μLVEGFR2，eNOS的无菌1X PBS 1毫升，VE钙粘蛋白或调宁一抗，分别为。
- 在冰上孵育细胞，在黑暗中1小时。
- 通过用无菌PBS 3次洗涤细胞除去抗体。
- 对于VEGFR2的染色，eNOS的，VE-钙粘蛋白或调宁蛋白，添加包含FITC缀合的抗兔IgG的10微升无菌1×PBS中的1毫升。在冰上孵育细胞，在黑暗中1小时。通过用无菌PBS 3次洗涤细胞除去IgG的。
- 添加的Hoechst 33342至1微克/毫升的最终浓度，孵育在黑暗中10分钟。
- 查看CD31，VEGFR2，eNOS的荧光，VE钙粘蛋白，调宁（绿色的518-535纳米的激发波长）和赫斯特（蓝色，361 nm的激发波长），用倒置荧光显微镜。
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Representative Results
内皮细胞发芽
自发的内皮细胞出芽来自小鼠主动脉段开始。鼠标主动脉段被允许在低生长因子基质生长然后在内皮细胞生长培养基中4天。内皮细胞出芽通常出现在2 - 4天。显微照片拍摄第4天（ 图1）。正如图片所示，无数的内皮细胞迁移从段路程。新成立的豆芽继续从段和分支延伸。
内皮细胞表型
这些细胞表现出纺锤形和鹅卵石样外观初始通道（ 图2A）以后。附着细胞用语-AC-LDL和荆豆 -Lectin一小时。如在图2B-2E示出，大部分细胞呈双阳性为语-AC-LDL摄取（红色）和荆豆 -Lectin结合（绿色）。同时，第二通道后，该细胞的95％以上为阳性血小板内皮细胞粘附分子1（CD31，PECAM-1， 图2F），VEGFR2（ 图2G），VE-钙粘蛋白（ 图2H），eNOS的（ 图2I），但阴性钙调节蛋白（ 图2J），其是平滑肌细胞的标记。
图1.内皮细胞发芽。小鼠主动脉段被接种到低生长因子基质和在内皮细胞生长培养基中培养。内皮细胞出芽开始早在第2天（A，栏= 100微米），并在下面的2增加- 3天（B，C，栏= 100微米）。段是第4天（D，酒吧= 500微米）中删除。
图2. 内皮细胞的表型 。贴壁细胞显示梭形和鹅卵石样外观 （A，栏= 100微米），语-AC-LDL和荆豆 -Lectin的双阳性荧光（BE，酒吧= 100微米）。同时，血小板内皮细胞粘附分子1（CD31，PECAM-1），VEGFR2，VE-钙粘蛋白，第二通道后的eNOS分别在细胞的> 95％为阳性（FI，棒= 100微米）的大部分细胞是阴性对钙调节蛋白染色，这是一个平滑肌细胞标记物（J，棒= 100微米）。
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Discussion
这项研究表明了一个简单的方法来分离，培养内皮细胞从鼠标主动脉细胞无任何特殊设备。免疫荧光染色显示，大部分细胞是第二通道后内皮细胞。有人建议，细胞在第二至第三通道适于在体外 和体内实验来研究内皮生物学。
从本议定书的重要注意事项
有在步骤五个关键点。首先，血管腔与含肝素的PBS冲洗，以尽量减少内皮细胞的活化和凝块形成。第二，心脏骤停和主动脉段的播种到基体之间的时间是到内皮细胞活性的关键。如果清周围动脉脂肪组织和结缔组织，避免拉伸主动脉和限制花在该步骤10的时间 - 15分钟。三，倒刚好足够的介质，以覆盖段它们接种后。太多的媒体将造成主动脉段浮动。第四，培养基含有内皮细胞生长补充物的高浓度，使得内皮细胞生长速度远远超过在内皮细胞生长培养基-2中培养时。内皮细胞的生长将抑制其它细胞类型，如平滑肌细胞和成纤维细胞。第五，从基质除去主动脉段的定时也是内皮细胞的纯度是至关重要的。此步骤由成纤维细胞和平滑肌细胞防止污染。段应管网发展之前被删除。延迟除去主动脉段将导致其它细胞类型如成纤维细胞或平滑肌细胞的污染。请注意，该方法也被用于研究血管生成的体外和状结构毛细管的形成表明主动脉段的血管生成的能力。基于我们的电子xperience，如果段被除去毛细管样结构充分发展后，平滑肌细胞污染的发生率增加显着。所以，我们觉得最好的时间点上，拆下段是当网络开始可见，但还没有发育完全。以这种方式，我们能够收获许多内皮细胞，同时尽可能保持污染由平滑肌细胞在最低限度。
本议定书的局限性
有所描述的方法的一些局限性。首先，是成纤维细胞和平滑肌细胞的污染的机会，如果管网络开发之前主动脉段不会被删除。的成纤维细胞或平滑肌细胞可能开始附加到基质和播种之后增殖3至5天。因此，总是删除及时主动脉段。作为辅助预防措施，改变介质再后2小时 -plating细胞到新的烧瓶中还有助于消除成纤维细胞和平滑肌细胞的可能的污染。第二，这些细胞是在体外对7培养-分离后10天。这可能是他们的表型可以是从新鲜分离的内皮细胞不同。例如，如果从高脂血症小鼠模型的内皮细胞在内皮细胞生长培养基中培养无脂质的高浓度，它们不会因为他们在动物暴露于高脂血症的环境。在培养的内皮细胞可以从新鲜分离的内皮细胞8表现不同。在所有体外培养的原代细胞和细胞系中存在这个问题。加入病理刺激到培养基中以模仿体内环境可以是一个解决办法。
内皮细胞展示不同的血管分支不同的表型
e_content“>血管系统是动脉，静脉和毛细血管组成的分层结构。驻留在脉管系统的特定的”区域“的内皮细胞的异质性起着在血管系统9,10创建功能多样性的很大一部分。即使在一个单一的血管床，如主动脉，内皮异质的存在。在高剪切应力层流的血液流动在主动脉的直线部分引起驻留在的直线部分一氧化氮合酶和血栓11。因此，内皮细胞主动脉证明抗凝血剂，抗粘合剂，和抗炎特性12,13，另一方面，在区域湍流血流那里动脉分支或急转（主动脉弓）降低内皮型一氧化氮合成酶的表达，并诱导内皮动脉粥样硬化的基因细胞， 即 ，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），和血小板衍生的生长因子（PDGFs），导致促炎和动脉粥样硬化血管内皮表型6。此外，在各器官的血管内皮细胞经历解剖和功能的特定于该机构的功能14,15适应性变化。然而，存在几个细胞表面标记物，功能性基因和细胞活动可用于表征内皮细胞谱系的共识。这些细胞表面标记物包括血小板内皮细胞粘附分子（PCAM-1，CD31），血管性血友病因子（vWF），血管内皮钙粘蛋白（VE-钙粘蛋白，CD144）。最频繁使用的功能的基因包括内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）。这通常出现在内皮细胞谱系的细胞活动包括语-AD-LDL的摄取和凝集素结合，形成的矩阵索状结构。优先级的意义和未来应用玛丽培养的小鼠主动脉内皮细胞
这里所描述的方法被用于研究的大血管内皮细胞。此协议的意义在于，它提供了一个很好的机会，有针对性的研究分子的具体内皮细胞的活动，可以在敲除和转基因小鼠模型来完成，使得其在心血管研究非常有用的。确定的条件下生长高数量小鼠主动脉血管内皮细胞的能力使这种理想的技术来更好地定义内皮的表型和功能。这种技术改进了测试内皮细胞为基础的治疗的前瞻性潜力在小鼠模型中，或者通过静脉注射或内皮细胞的植入的实用性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
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