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Biology

अलगाव और माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति

Published: December 19, 2016 doi: 10.3791/52965
Automatic Translation
1, 2, 1
1Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University, 2Third Xiangya Hospital and the Institute of Vascular Disease and Translational Medicine, Central South University

Introduction

संवहनी endothelium न केवल एक बाधा परत है कि रक्त और ऊतकों को अलग करती है, यह एक विशाल अंत: स्रावी ग्रंथि है कि 400 वर्ग मीटर 1 के एक सतह क्षेत्र के साथ पूरे संवहनी पेड़ पर फैला माना जाता है। endothelium की भलाई संवहनी homeostasis के लिए आवश्यक है। बेकार endothelium atherosclerosis, वेसकुलिटिस और ischemia / reperfusion चोट, आदि सहित विभिन्न 2-4 हृदय संबंधी विकार, में भाग लेता है। आज की तारीख तक इन रोग सेटिंग्स में शामिल विशिष्ट सेलुलर और आणविक तंत्र में अच्छी तरह से endothelium के विसरित शारीरिक प्रकृति के कारण समझ नहीं रहे हैं।

माउस अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल क्योंकि आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों और अधिक किसी भी अन्य स्तनधारी प्रजातियों में से चूहों में विकसित कर रहे है। हालांकि, प्राथमिक murine महाधमनी endothelial कोशिकाओं के अलगाव विशेष रूप से कठिन माना जाता है क्योंकि महाधमनी के छोटे आकार enzymat बनाता हैendothelium अव्यावहारिक के आईसी पाचन। कुछ प्रक्रियाओं को अलग-थलग करने और शुद्ध ईसीएस की आवश्यकता होती है 5-7 को सूचना दी।

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के किसी विशेष उपकरण का उपयोग किए बिना माउस महाधमनी से अलग और endothelial कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक सरल विधि का उपयोग करने के लिए है। इस प्रोटोकॉल में, हौसले से पृथक महाधमनी छोटे खंडों में कटौती और endothelium नीचे का सामना करना पड़ endothelial अंकुरण के लिए अनुमति देने के लिए के साथ एक मैट्रिक्स पर वरीयता दी गई है। बाद खंडों को हटा रहे हैं, endothelial कोशिकाओं endothelium इष्ट माध्यम में विस्तार किया है और दो या तीन मार्ग के बाद प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं। वर्णित विधि के लाभ कर रहे हैं कि: 1) endothelial कोशिकाओं एक भी महाधमनी से काटा जाता है की काफी अधिक संख्या; 2) सेल व्यवहार्यता अच्छी तरह से संरक्षित है; और 3) कोई विशेष उपकरण या तकनीक की जरूरत है। यह endothelial सेल pathophysiology में विशिष्ट सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने का एक प्रभावी साधन प्रदान करता है। जो उन लोगों के जनसंपर्क का अध्ययन करने में रुचि रखते हैंया तो जीन नाक आउट चूहों से imary सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं, जीन दस्तक में चूहों, या एक murine मॉडल रोग, इस प्रोटोकॉल बहुत ही उपयोगी और अभ्यास करने के लिए आसान है।

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Protocol

चूहे से महाधमनी के 1. अलगाव

सभी यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं वेन स्टेट यूनिवर्सिटी के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

  1. संज्ञाहरण मशीन की प्रेरण कक्ष में माउस रखो। Isoflurane 25% ताजा हवा और 75% ओ 2 के साथ संयोजन के रूप में 4% से प्रवाह निर्धारित करें। Isoflurane (प्रेरण के लिए 4%, रखरखाव के लिए 1.0% ±) 25% ताजा हवा और 75% ओ 2 के साथ संयोजन के रूप में की साँस लेना द्वारा माउस anesthetize प्रेरण कक्ष एक समर्पित नाक शंकु के द्वारा पीछा के माध्यम से। नोट: isoflurane के साथ संज्ञाहरण 75% ऑक्सीजन / 25% हवा में या 100% ऑक्सीजन में दिया जा सकता है।
  2. माउस हर 5 मिनट की जाँच करें जब तक संज्ञाहरण के उचित स्तर (पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए वापसी की कमी) पर पहुंच गया है।
  3. प्रेरण कक्ष से बाहर माउस ले लो और isoflurane साँस लेना हालांकि समर्पित नाक शंकु कि संज्ञाहरण मशीन से जुड़ा है जारी है। स्विचisoflurane 1% से प्रवाह संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए।
  4. यह संज्ञाहरण के तहत है, वहीं एक सर्जरी पैड, अपनी पीठ पर तैनात पर माउस डाल दिया। अंग सुरक्षित करने के लिए प्रयोगशाला टेप का प्रयोग करें।
  5. माउस गर्म रखने के लिए एक हीटिंग दीपक का प्रयोग करें। इतना है कि माउस नहीं होगा अधिक गर्मी माउस से एक उचित दूरी में दीपक रखें।
  6. 70% इथेनॉल के साथ छाती स्प्रे।
  7. midline से पेट खुला, और उदर महाधमनी बेनकाब करने के लिए विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें। छाती गुहा खोलें और हृदय और फेफड़ों को बेनकाब।
  8. विच्छेदन कैंची रक्त को रिहा करने के साथ बीच पर उदर महाधमनी में कटौती।
  9. पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक 1 एमएल सिरिंज (25 जी सुई के साथ) 1,000 यू / हेपरिन के एमएल युक्त भरें। पीबीएस 1,000 यू / बाएं वेंट्रिकल को हेपरिन के एमएल युक्त इंजेक्षन और महाधमनी छिड़कना। वक्ष महाधमनी का पर्दाफाश करने के लिए चूहों के दाईं ओर करने के लिए महान धमनियों में दिल और फेफड़ों के संदंश के साथ पुश।
  10. जल्दी सूक्ष्म di का उपयोग करते हुए वक्ष महाधमनी को दूरssection संदंश और ठंडा 1x पीबीएस (बाँझ) में डाल दिया है, तो एक लामिना airflow हुड में कंटेनर परिवहन।
  11. 1 एमएल सिरिंज महाधमनी के एक छोर में 25 जी सुई के साथ लगे डालें, और धीरे रक्त को दूर करने के लिए ठंडा पीबीएस के साथ महाधमनी फ्लश।
  12. माइक्रो-विच्छेदन संदंश का प्रयोग संभव के रूप में संलग्न वसा ऊतकों के रूप में ज्यादा और छोटे जहाजों पार्श्व हटा दें।
  13. इसके तत्काल बाद महाधमनी मध्यम विकास endothelial के लिए स्थानांतरण।
  14. 1 मिमी एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग छल्ले में महाधमनी में कटौती। फसल के बारे में 8 - महाधमनी प्रति 10 बजता है।
  15. प्रत्येक महाधमनी अंगूठी सूक्ष्म विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग खोलें।

2. बीज मैट्रिक्स पर महाधमनी अनुभाग

  1. जब उपयोग में नहीं है, जमना को रोकने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में वृद्धि कारक कम मैट्रिक्स रहते हैं। कम से कम 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात में वृद्धि कारक कम मैट्रिक्स रखो एक पूरा पिघलना की अनुमति है।
  2. कम से कम के लिए -20 डिग्री सेल्सियस के लिए 6 अच्छी तरह से थाली और pipet सुझावों Precoolदस मिनट। 6 अच्छी तरह से थाली बर्फ और कोट पर किसी भी हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना मैट्रिक्स के 1 एमएल के साथ थाली में से एक अच्छी तरह से रख। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस 20 मिनट मैट्रिक्स जमना करने की अनुमति के लिए।
  3. जम मैट्रिक्स बाँझ सूक्ष्म विच्छेदन संदंश का उपयोग पर महाधमनी टुकड़े प्रत्यारोपण। टुकड़े लुमेन साइड-नीचे मैट्रिक्स पर endothelium को छूने के बिना रखें। 4 महाधमनी मैट्रिक्स पर एक दूसरे के करीब खंडों - 3 जगह।
  4. अभी काफी endothelial सेल विकास खंडों गीला (~ 200 μL) रखने के लिए मध्यम जोड़ें।
  5. 4 से 6 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। दिन के अंत में, महाधमनी खंडों को कवर करने के लिए अभी काफी माध्यम जोड़ें।
  6. महाधमनी खंड एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत समय समय पर अंकुरण का निरीक्षण करें। मध्यम स्तर और सेल के विकास के लिए प्रत्येक दिन की जाँच करें। मध्यम यदि आवश्यक हो तो कवर महाधमनी खंडों रखने के लिए जोड़ें।
  7. 4 वें दिन पर, धीरे मध्यम हटाने और महाधमनी खंडों एफ को हटानेबढ़ रही endothelial कोशिकाओं में दखल के बिना एक बाँझ सुई का उपयोग मैट्रिक्स ROM।
  8. नई endothelial सेल मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर जोड़ने और endothelial कोशिकाओं 2 के लिए मैट्रिक्स पर पैदा जारी की अनुमति - 3 दिन।

3. माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्रारंभिक Passaging

  1. कोट जिलेटिन (0.1%) के साथ एक नया T12.5 फ्लास्क, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ सावधानी से मैट्रिक्स प्लेटें धोने।
  3. तटस्थ proteinase (50 यू / एमएल) के 2 एमएल मैट्रिक्स प्लेटों में जोड़े और सामयिक झटकों के साथ मंच घुमाव पर कमरे के तापमान पर सेते हैं। एक चरण विपरीत खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच यकीन है कि कोशिकाओं के बहुमत अलग कर रहे हैं बनाने के लिए।
  4. डी-वैल के 2 एमएल तटस्थ proteinase निष्क्रिय करने के लिए जोड़ें।
  5. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ध्यान से सतह पर तैरनेवाला लीजिए। 2 एमएल डी-वैल के साथ थाली धो और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  6. roo पर 5 मिनट के लिए 900 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्रएम तापमान।
  7. T12.5 कुप्पी जिलेटिन के साथ लेपित में endothelial सेल मध्यम विकास और थाली के 4 एमएल में सेल गोली फिर से निलंबित। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
  8. मध्यम बदलें। 90% मिला हुआ - जब तक वे 85% कर रहे हैं 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।

4. माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं की Passaging

  1. कोट दो नई T12.5 बोतल जिलेटिन (0.1%) के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पूर्व गर्मी trypsin EDTA (0.25% trypsin, पीबीएस में 0.02 EDTA) और बाँझ पीबीएस 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 15 मिनट के लिए।
  2. बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ सावधानी से कोशिकाओं को धो लें।
  3. Trypsin EDTA (0.25% trypsin, पीबीएस में 0.02 EDTA) के 0.5 एमएल जोड़ें और ~ 1 मिनट के लिए या जब तक कोशिकाओं के बहुमत दौर बारी 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. endothelial सेल मध्यम विकास के 2 एमएल पाचन को रोकने के लिए जोड़ें। सेल निलंबन ऊपर और नीचे कुप्पी कई बार भीतर पिपेट। यदि आवश्यक हो, एक सेल का उपयोगकोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए खुरचनी।
  5. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 900 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
  6. 2 T12.5 जिलेटिन के साथ लेपित बोतल में endothelial सेल मध्यम विकास और थाली के 4 एमएल में सेल गोली फिर से निलंबित। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. मध्यम बदलें। 90% मिला हुआ - जब तक वे 85% कर रहे हैं 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
  8. 3 अंश - 2 के बाद माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं का प्रयोग करें।

5. माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं की विशेषता

  1. पुन प्लेट कोशिकाओं।
    1. कोट जिलेटिन (0.1%) के साथ 6 अच्छी तरह से थाली, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पीबीएस के साथ थाली कुल्ला।
    2. पूर्व गर्मी के बारे में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्रिप्सिन- EDTA और बाँझ पीबीएस।
    3. बाँझ पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं को 0.5 trypsin के एमएल / EDTA जोड़ें, 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ ~ 1 मिनट के लिए सेतेकोशिकाओं के बहुमत तक आर दौर की बारी है।
    4. endothelial सेल मध्यम विकास के 2 एमएल पाचन को रोकने के लिए जोड़ें। सेल निलंबन ऊपर और नीचे कुप्पी कई बार भीतर पिपेट। यदि आवश्यक हो, कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग करें।
    5. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 900 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, endothelial सेल मध्यम विकास में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 3 एक्स 10 5 / अच्छी तरह के घनत्व में जिलेटिन के साथ लेपित 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं बीज।
    7. कोशिकाओं संस्कृति सतह को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में रात भर कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. दिल-एसी-एलडीएल uptaken और Ulex बाध्यकारी -lectin।
    1. स्टोर 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate लेबल acetylated एलडीएल (Dil-एसी-एलडीएल) -20 डिग्री सेल्सियस पर। धुंधला करने से पहले, बर्फ पर पिघलना दिल एसी एलडीएल। शेयर दिल एसी एलडीएल समाधानtion 1 मिलीग्राम एमएल है /। 4 डिग्री सेल्सियस पर FITC लेबल Ulex europaeus agglutinin (Ulex -Lectin, 1 माइक्रोग्राम / एमएल) की दुकान। शेयर Ulex -Lectin समाधान 1 मिलीग्राम / एमएल है। स्टोर Hoechst 33342 4 डिग्री सेल्सियस पर। शेयर Hoechst 33342 समाधान 100 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    2. दिल-एसी-एलडीएल शेयर समाधान के 10 μL संस्कृति के माध्यम से 1 एमएल में जोड़े 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए।
    3. धुंधला करने से पहले, पुराने मध्यम हटाने और नए माध्यम के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक में कोशिकाओं को धो लें।
    4. नई मध्यम निकालें और दिल एसी एलडीएल धुंधला माध्यम जोड़ें।
    5. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. बाँझ 1x पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    7. 10% formalin के 1 एमएल कोशिकाओं को ठीक करने के लिए जोड़ें। लगभग 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान में थाली रखो।
    8. बाँझ 1x पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धो लें। प्रकाश से बचें।
    9. 1 मिलीलीटर बाँझ 1x पीबीएस कि Ulex -Lectin के 10 μL शामिल जोड़ें।
    10. कमरे temperatu कोशिकाओं सेते1 घंटे के लिए अंधेरे में रहे हैं।
    11. बाँझ 1x पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धोने से Ulex-Lectin निकालें।
    12. Hoechst 33342 1 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें, अंधेरे में 10 मिनट सेते हैं।
    13. दिल-एसी-एलडीएल (लाल, 576 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना), Ulex -Lectin (हरे, 519 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना) और Hoechst की प्रतिदीप्ति देखें (नीले, 361 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना) एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ।
  3. CD31, VEGFR2, एनोस के लिए फ्लोरोसेंट धुंधला, VE-Cadherin और Calponin।
    1. स्टोर FITC संयुग्मित विरोधी माउस CD31 एंटीबॉडी, एनोस एंटीबॉडी, VE-Cadherin 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी, FITC संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी अंधेरे में। -20 डिग्री सेल्सियस में स्टोर VEGFR2 एंटीबॉडी।
    2. बाँझ 1x पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    3. 10% formalin के 1 एमएल कोशिकाओं को ठीक करने के लिए जोड़ें। लगभग 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान में थाली रखो।
    4. बाँझ 1x पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    5. CD31 दाग, बाँझ 1x के 1 एमएल जोड़नेपीबीएस कि CD31-FITC एंटीबॉडी के 10 μL में शामिल है। दाग या तो VEGFR2, एनोस, VE-Cadherin या calponin, बाँझ 1x पीबीएस कि VEGFR2, एनोस के 4 μL होता है की 1 मिलीग्राम, VE-Cadherin या प्राथमिक एंटीबॉडी calponin, क्रमशः।
    6. अंधेरे में 1 घंटे के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    7. बाँझ पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धोने से एंटीबॉडी निकालें।
    8. VEGFR2 की धुंधला के लिए, एनोस, VE-Cadherin या calponin, बाँझ 1x पीबीएस कि FITC संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी के 10 μL शामिल के 1 एमएल जोड़ें। अंधेरे में 1 घंटे के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं। बाँझ पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं को धोने से आईजीजी निकालें।
    9. Hoechst 33342 1 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें, अंधेरे में 10 मिनट सेते हैं।
    10. CD31, VEGFR2, एनोस के प्रतिदीप्ति देखें, VE-Cadherin, calponin (हरे, 518-535 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना) और Hoechst (नीला, 361 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना) एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ।

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Representative Results

Endothelial सेल अंकुरित

उठना, endothelial सेल एक माउस महाधमनी खंड से शुरू कर दिया अंकुरण। माउस महाधमनी खंड 4 दिनों के लिए endothelial सेल मध्यम विकास में तो एक वृद्धि कारक कम मैट्रिक्स पर विकसित करने के लिए अनुमति दी गई थी। 4 दिन - endothelial सेल अंकुरण आमतौर पर 2 में दिखाई देता है। Photomicrographs दिन 4 (चित्रा 1) पर ले जाया गया। चित्रों के रूप में दिखाया गया है, कई endothelial कोशिकाओं खंड से दूर विस्थापित। नवगठित अंकुरित खंड और शाखा से विस्तार करने के लिए जारी है।

Endothelial सेल phenotypes

इन कोशिकाओं को धुरी के आकार और पत्थर की तरह दिखावे प्रारंभिक बीतने (2A चित्रा) के बाद प्रदर्शन किया। संलग्न कोशिकाओं दिल-एसी-एलडीएल और एक घंटे के लिए Ulex -Lectin साथ लेबल रहे थे। के रूप में आंकड़े 2 बी -2 ई में दिखाया गया है, कोशिकाओं की सबसे दिल एसी एलडीएल के लिए डबल सकारात्मक थे तेज (लाल) और Ulex -Lectin बाध्यकारी (हरा)। इस बीच, दूसरे पारित होने के बाद, कोशिकाओं के 95% से अधिक प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु 1 (CD31, PECAM-1, चित्रा 2 एफ) के लिए सकारात्मक थे, VEGFR2 (चित्रा 2 जी), VE-Cadherin (चित्रा 2H), एनोस ( चित्रा 2I), लेकिन Calponin (चित्रा 2J के लिए नकारात्मक), जो एक चिकनी पेशी सेल मार्कर है।

आकृति 1
चित्रा 1. Endothelial सेल अंकुरित। माउस महाधमनी खंड विकास का पहलू को कम मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त और endothelial सेल मध्यम विकास में संवर्धित किया गया था। Endothelial सेल के रूप में जल्दी दिन 2 (ए, बार = 100 माइक्रोन) के रूप में शुरू किया और निम्नलिखित 2 में वृद्धि हुई अंकुरण - 3 दिन (बी, सी, बार = 100 माइक्रोन)। खंड दिन 4 (D, बार = 500 माइक्रोन) पर हटा दिया गया था।

ईएनटी "> चित्र 2
चित्रा 2. Endothelial सेल phenotypes। संलग्न कोशिकाओं धुरी के आकार और पत्थर की तरह दिखावे प्रदर्शित (ए, बार = 100 माइक्रोन), दिल-एसी-एलडीएल और Ulex -Lectin की डबल सकारात्मक प्रतिदीप्ति (इ, बार = 100 माइक्रोन)। इस बीच, प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-Cadherin, एनोस दूसरे पारित होने के बाद में कोशिकाओं की> 95% सकारात्मक थे (फ़ाई, बार = 100 माइक्रोन) कोशिकाओं की सबसे नकारात्मक थे Calponin धुंधला है, जो एक चिकनी पेशी सेल मार्कर है (जम्मू, बार = 100 माइक्रोन) के लिए।

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Discussion

इस अध्ययन से किसी भी विशेष उपकरण के बिना एक माउस महाधमनी से कोशिकाओं को अलग और संस्कृति endothelial के लिए एक सरल विधि को दर्शाता है। immunofluorescence धुंधला संकेत दिया है कि कोशिकाओं के बहुमत दूसरे पारित होने के बाद endothelial कोशिकाओं थे। यह सुझाव दिया है कि तीसरे पारित होने के बाद दूसरे स्थान पर कोशिकाओं में इन विट्रो के लिए और इन विवो प्रयोगों में endothelial जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल से कुंजी नोट्स

वहाँ प्रक्रिया में पांच महत्वपूर्ण अंक हैं। सबसे पहले, नाड़ी लुमेन endothelial सेल सक्रियण और थक्का बनने को कम करने के पीबीएस युक्त हेपरिन के साथ प्लावित है। दूसरा, हृदय की गिरफ्तारी और मैट्रिक्स पर महाधमनी खंड के बोने के बीच समय endothelium व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है। पेरी-धमनी वसा ऊतकों और संयोजी ऊतक समाशोधन, वहीं महाधमनी खींच से बचने और समय 10 के लिए इस चरण पर खर्च की सीमा - 15 मिनट। तीसरा, डालनाअभी पर्याप्त मीडिया खंडों के बाद वे वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कवर करने के लिए। बहुत ज्यादा मीडिया महाधमनी खंडों फ्लोट करने के लिए प्रेरित करेगा। चौथा, संस्कृति के माध्यम बनाने endothelial कोशिकाओं बहुत तेजी से बढ़ने की तुलना में, endothelial सेल के विकास के पूरक के एक उच्च एकाग्रता शामिल जब endothelial वृद्धि मध्यम 2 में सुसंस्कृत। endothelial कोशिकाओं के परिणाम इस तरह चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और fibroblasts के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं को दबाने होगा। पांचवां, मैट्रिक्स से महाधमनी खंड दूर करने के लिए समय भी endothelial कोशिकाओं की शुद्धता के लिए महत्वपूर्ण है। यह कदम fibroblasts और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं द्वारा संक्रमण से बचाता है। खंड ट्यूब नेटवर्क के विकास से पहले हटा दिया जाना चाहिए। महाधमनी खंड की देरी हटाने ऐसे fibroblasts या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं के प्रदूषण में परिणाम होगा। कृपया ध्यान दें कि यह दृष्टिकोण भी इन विट्रो और संरचनाओं की तरह केशिका के गठन में angiogenesis अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है महाधमनी खंड के angiogenesis क्षमता को दर्शाता है। हमारे ई के आधार परxperience के बाद केशिका की तरह संरचना पूरी तरह से विकसित करता है, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं संदूषण बढ़ जाती है की घटनाओं में नाटकीय रूप से खंडों को हटा रहे हैं। इसलिए, हम दूर करने के लिए सबसे अच्छा है कि समय बिंदु जब नेटवर्क दिखाई करने के लिए शुरू होता है, लेकिन पूरी तरह से विकसित नहीं है खंड है लग रहा है। इस तरह, हम के रूप में कई endothelial कोशिकाओं के रूप में संभव है, जबकि एक न्यूनतम करने के लिए चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं द्वारा संक्रमण रखते हुए फसल के लिए सक्षम हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल की सीमाएं

इसमें वर्णित विधि की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, वहाँ fibroblasts और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्रदूषण की संभावना है, अगर महाधमनी खंडों ट्यूब नेटवर्क विकसित करने से पहले नहीं हटा रहे हैं। fibroblasts या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं मैट्रिक्स के लिए देते हैं और बोने के बाद 3 से 5 दिन पैदा करना शुरू कर सकते हैं। इसलिए, हमेशा के लिए एक समय पर ढंग से महाधमनी खंडों को हटा दें। एक माध्यमिक एहतियात, मध्यम बदलने पुन बाद 2 घंटे के रूप में एक नई कुप्पी पर कोशिकाओं -plating भी fibroblasts और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के संभावित प्रदूषण को खत्म करने में मदद करता है। अलगाव के बाद 10 दिन - दूसरा, इन कोशिकाओं 7 के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत हैं। यह उनकी phenotypes हौसले से पृथक endothelial कोशिकाओं से अलग हो सकता है कि संभव है। उदाहरण के लिए, यदि hyperlipidemia के एक माउस मॉडल से endothelial कोशिकाओं लिपिड के एक उच्च एकाग्रता के बिना endothelial सेल मध्यम विकास में संवर्धित कर रहे हैं, वे hyperlipidemic वातावरण के संपर्क में नहीं हैं, क्योंकि वे जानवरों में थे। सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं हौसले से पृथक endothelial कोशिकाओं 8 से अलग ढंग से व्यवहार कर सकता है। यह समस्या सभी इन विट्रो सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों में मौजूद है। संस्कृति के माध्यम में रोग उत्तेजनाओं को जोड़ने की नकल करने में विवो पर्यावरण के लिए एक समाधान हो सकता है।

Endothelial कोशिकाओं को अलग संवहनी शाखाओं में अलग phenotypes प्रदर्शित

e_content "> नाड़ी तंत्र एक श्रेणीबद्ध धमनियों, शिराओं, और की रचना की संरचना है। endothelial कोशिकाओं कि वाहिका के विशिष्ट 'जोन' में रहते हैं की विविधता नाड़ी तंत्र 9,10 में कार्यात्मक विविधता बनाने में एक बड़ी भूमिका निभाता है। यहां तक कि एक एकल संवहनी बिस्तर में, इस तरह के रूप में महाधमनी, endothelial विविधता मौजूद है। महाधमनी के सीधे भाग में उच्च कतरनी तनाव के साथ लामिना रक्त के प्रवाह को प्रेरित करता endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड synthase और thrombomodulin 11। इसलिए, endothelial कोशिकाओं है कि सीधे भाग में रहता है महाधमनी विरोधी कौयगुलांट, विरोधी चिपकने वाला, और विरोधी भड़काऊ गुण 12,13 प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, क्षेत्रों में रक्त के प्रवाह को अशांत जहां धमनियों शाखा या तेजी से बारी (महाधमनी चाप) कम कर देता है endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड synthase अभिव्यक्ति और endothelial में मेदार्बुदजनक जीन लाती कोशिकाओं, यानी, एककेंद्रकश्वेतकोशिका कीमोटैक्टिक प्रोटीन -1 (एमसीपी-1), और प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारकों (PDGFs)एक समर्थक भड़काऊ और atherosclerotic endothelial phenotype 6 में जिसके परिणामस्वरूप। इसके अलावा, प्रत्येक अंग की वाहिकाओं में endothelial कोशिकाओं शारीरिक और कार्यात्मक अनुकूली परिवर्तन है कि उस अंग के कार्यों 14,15 के लिए विशिष्ट हैं गुज़रना पड़ता है। फिर भी, वहाँ एक आम सहमति है कि कई कोशिका की सतह मार्कर, कार्यात्मक जीन और सेल गतिविधियों endothelial सेल वंश को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये कोशिका की सतह मार्करों प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु (PCAM -1, CD31), वॉन Willebrand कारक (vWF), संवहनी endothelial-Cadherin (VE-Cadherin, CD144) शामिल हैं। सबसे अक्सर इस्तेमाल किया कार्यात्मक जीन endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड synthase (एनोस) और संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर (VEGFR) शामिल हैं। सेल गतिविधियों है कि आम तौर पर endothelial सेल वंश में देखा जाता है दिल-विज्ञापन-एलडीएल की तेज और बाध्यकारी Lectin, जो मैट्रिक्स पर कॉर्ड संरचनाओं की तरह रूपों में शामिल हैं।

पंचायती राज का महत्व और भविष्य के अनुप्रयोगोंमैरी सभ्य माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं

विधि यहाँ वर्णित macrovascular endothelial कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के महत्व यह लक्षित अणुओं के endothelial-विशिष्ट गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है और पीटा और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में किया जा सकता है, यह बहुत हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोगी बनाने है। परिभाषित परिस्थितियों में माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं की उच्च संख्या बढ़ने की क्षमता बेहतर phenotypes और endothelium के कार्यों को परिभाषित करने के लिए इस तकनीक का आदर्श बनाता है। इस तकनीक, murine मॉडल में endothelial सेल आधारित चिकित्सा के भावी संभावित परीक्षण कर सकते हैं या तो नसों में इंजेक्शन या endothelial कोशिकाओं के engraftment के माध्यम से की व्यावहारिकता को बेहतर बनाता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4- or 6-week-old mice Jackson Laboratory #000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) Gibco #10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin Sigma Aldrich H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix BD Biosciences 356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) Life Technologies L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) Sigma L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody BD Biosciences 553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody Cell Signaling 9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase Abcam ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin Abcam 33168
Anti-mouse calponin Abcam 700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG Sigma F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle Fisher Scientific 50-900-04222
100 mm Peri dishes Fisher Scientific 07-202-516
Six-well cell culture plates Fisher Scientific 08-772-1B
T12.5 culture flask Fisher Scientific 50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane Webster Veterianary Supply 07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope

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References

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अलगाव और माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति
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Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K.… More

Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (118), e52965, doi:10.3791/52965 (2016).

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