Introduction
Vaskulært endotel er ikke bare et barrieresjikt som skiller blod og vev, er det ansett som en stor endokrin kjertel som strekker seg over hele vaskulære treet med et overflateareal på 400 kvadratmeter 1. Den trivsel endotelet er viktig for vaskulær homeostase. Den dysfunksjonelle endotelet deltar i ulike kardiovaskulære lidelser, inkludert aterosklerose, vaskulitt og iskemi / reperfusjon skader, etc. 2-4. Til dags dato er de spesifikke cellulære og molekylære mekanismer som er involvert i slik sykdom ikke godt forstått på grunn av diffust anatomisk natur endotelet.
Musen er en viktig modell for forskning fordi genetiske manipulasjonsteknikker er mer utviklet hos mus enn i noen andre pattedyrarter. Imidlertid er isoleringen av primære murine endotelceller fra aorta betraktes som særlig vanskelig fordi den lille størrelsen av aorta gjør enzymatic fordøyelsen av endotelet upraktisk. Noen rapporterte prosedyrer for å isolere og rense egenkapitalbevis krever 5-7.
Målet med denne protokollen er å bruke en enkel metode for å isolere og utvide endotelceller fra aorta mus uten bruk av spesialutstyr. I denne protokollen, er det nylig isolerte aorta skåret i små segmenter og sådd ut på en matrise med endotelet vendt ned for å tillate endotelial spiring. Etter at segmentene er fjernet, er endotelceller ekspanderes i endotel-begunstiget medium og er klar for eksperimenter etter to eller tre passasjer. Fordelene ved den beskrevne fremgangsmåte er at: 1) betraktelig høye tall av endotelceller er høstet fra en enkelt aorta; 2) celle levedyktighet er godt bevart; og 3) ikke noe spesielt utstyr eller teknikk er nødvendig. Det gir et effektivt middel for å identifisere spesifikke cellulære og molekylære mekanismer på endotelcelle patofysiologi. For de som er interessert i å studere primary dyrkede endotelceller fra enten gene knock-out mus, gene knock-in mus, eller en murin modell sykdom, er denne protokollen meget nyttig og lett å praktisere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av Aorta fra Mus
Alle prosedyrene som er beskrevet her ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Wayne State University.
- Sett musen inn i induksjon kammer av anestesiapparatet. Sett isofluran strømme til 4% i forbindelse med 25% frisk luft og 75% O 2. Bedøve mus ved inhalering av isofluran (4% for induksjon, ± 1,0% for vedlikehold) sammen med 25% frisk luft og 75% O 2 via induksjon skammer etterfulgt av en dedikert nesekonus. MERK: anestesi med isofluran kan leveres i 75% oksygen / 25% luft eller i 100% oksygen.
- Sjekk musen hvert 5 min til det riktige nivået av anestesi er nådd (mangel på uttak til tå klype).
- Ta mus ut av induksjonskammeret og fortsette isofluran inhalering skjønt den tilpassede koniske nese som er koblet til anestesiapparatet. slåisofluran strømme til 1% for å opprettholde anestesi.
- Selv om det er under narkose, sett muse på en operasjon pad, plassert på ryggen. Bruk laboratorium tape for å feste bena.
- Bruk en varmelampe for å holde musen varm. Hold lampen i en passende avstand fra musen slik at musen vil ikke over-varme.
- Spray brystet med 70% etanol.
- Bruk disseksjon saks til å åpne magen fra midtlinjen, og utsett abdominal aorta. Åpne brysthulen og utsette hjertet og lungene.
- Kutt abdominal aorta på midten med disseksjon saks for å frigjøre blodet.
- Fyll en 1 ml sprøyte (med 25 G-nål) med 1 ml PBS inneholdende 1000 U / ml heparin. Injiser PBS inneholdende 1000 U / ml heparin til venstre ventrikkel og aorta perfuse. Skyv hjerte og lunge med pinsett ved de store arterier til den høyre side av musene for å eksponere den torakale aorta.
- Raskt fjerne thorakalaorta ved hjelp av mikro-dissection pinsett og legg den i iskaldt 1x PBS (sterilt), og deretter frakte containeren inn i en laminær luftstrøm hette.
- Sette inn en 1 ml sprøyte utstyrt med 25 G nål inn i en ende av aorta, og spyle forsiktig aorta med iskald PBS for å fjerne blodet.
- Bruke mikro-disseksjon tang for å fjerne så mye av de vedlagte fettvev og små side fartøy som mulig.
- Umiddelbart overføre aorta til endotelial vekstmedium.
- Skjær aorta til 1 mm ringer med en steril skalpell blad. Høste ca 8-10 ringer per aorta.
- Åpne hvert aorta ringen med et par av mikro-disseksjon saks.
2. Seed aorta segmenter på Matrix
- Når den ikke er i bruk, holder vekstfaktor-redusert matrise i -20 ° C for å hindre størkning. Sett vekstfaktor-reduserte matrise i 4 ° C i det minste over natten for å tillate en fullstendig tining.
- Forkjøle en 6-brønners plate og pipettespisser til -20 ° C i minst10 min. Sette den 6-brønns plate på is og belegge en brønn på platen med 1 ml av matrise uten å innføre luftbobler. Sett platen i en 37 ° C inkubator i 20 min for å tillate at matrise å stivne.
- Implantere aorta brikker over størknet matrise ved hjelp av sterile mikro disseksjon tang. Plasser brikkene lumen-side-ned på matrisen uten å berøre endotelet. Plasser 3 - 4 aorta segmenter nær hverandre på matrisen.
- Legg akkurat nok til endotelial cellevekstmedium for å holde segmentene våt (~ 200 ul).
- Inkuber platen ved 37 ° C under 5% CO2 i 4 til 6 timer. På slutten av dagen, tilsett akkurat nok til å dekke medium aorta segmenter.
- Observer aortic segmentet spirende jevne mellomrom under et fasekontrastmikroskop. Sjekk middels nivå og cellevekst hver dag. Legg medium hvis det er nødvendig for å holde aorta segmenter dekket.
- På den 4. dag, forsiktig fjerne mediet og fjerne aortic segmenter fROM matrisen ved hjelp av en steril nål uten å avbryte den voksende endotelceller.
- Tilsett 2 ml ny endotelial cellevekstmedium og tillate endotelcellene fortsetter å proliferere på matrise i 2 - 3 dager.
3. Første aging av Mouse endotelceller fra aorta
- Belegge en ny T12.5 kolbe med gelatin (0,1%), inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Vask matrise platene forsiktig med sterilt 37 ° C PBS.
- Tilsett 2 ml nøytral proteinase (50 U / ml) til matrise-plater og inkuberes ved værelsestemperatur på plattformen vippe med leilighetsvis rysting. Sjekk cellene under et fasekontrastmikroskop for å sørge for at de fleste av cellene er frittliggende.
- Tilsett 2 ml D-Val å inaktivere nøytral proteinase.
- Samle supernatanten forsiktig i et 15 ml sentrifugerør. Vask platen med 2 ml D-Val og samle supernatanten.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 900 xg i 5 minutter ved room temperatur.
- Re-suspen cellepelleten i 4 ml av endotelial cellevekstmedium og plate i T12.5 kolben belagt med gelatin. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i to timer.
- Sett på medium. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 inntil de er 85% - 90% sammenflytende.
4. aging av Mouse endotelceller fra aorta
- Coat to nye T12.5 kolber med gelatin (0,1%), inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Forvarm Trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,02 EDTA i PBS) og steril PBS ved 37 ° C i ca 15 min.
- Vask cellene grundig med sterilt 37 ° C PBS.
- Tilsett 0,5 ml Trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,02 EDTA i PBS) og inkuberes ved 37 ° C i ca. 1 min eller inntil mesteparten av cellene snu seg.
- Tilsett 2 ml av endotelial cellevekstmedium for å stoppe fordøyelse. Pipetter cellesuspensjonen opp og ned inne i kolben flere ganger. Om nødvendig, bruk en celleskraper å samle cellene.
- Samle cellesuspensjonen i et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 900 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Re-suspen cellepelleten i 4 ml av endotelial cellevekstmedium og platen i 2 T12.5 kolber belagt med gelatin. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i to timer.
- Sett på medium. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 inntil de er 85% - 90% sammenflytende.
- Bruk musen aorta endotelceller etter 2 - 3 passasjer.
5. Karakterisering av Mouse endotelceller fra aorta
- Re-plate cellene.
- Belegge en 6-brønns plate med gelatin (0,1%), inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Skyll platen med PBS.
- Forvarm Trypsin-EDTA og steril PBS til 37 ° C i ca 15 min.
- Vask cellene med steril PBS 3 ganger. Tilsett 0,5 ml trypsin / EDTA til cellene, inkuberes i ~ 1 min ved 37 ° C or inntil mesteparten av cellene snu seg.
- Tilsett 2 ml av endotelial cellevekstmedium for å stoppe fordøyelse. Pipetter cellesuspensjonen opp og ned inne i kolben flere ganger. Om nødvendig, bruk en celle skrape for å samle cellene.
- Samle cellesuspensjonen i et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 900 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, re-suspendere cellene i endotelial cellevekstmedium. Seed cellene i 6-brønners plate belagt med gelatin med en tetthet på 3 x 10 5 / brønn.
- Cellene inkuberes over natten ved 37 ° C, 5% CO2 for å tillate cellene å feste til kulturoverflaten.
- Dil-ac-LDL uptaken og Ulex -lectin bindende.
- Oppbevar 1,1'-dioktadekyl-3,3,3 ', 3'tetramethylindo-carbocyanine perklorat-merket acetylert LDL (Dil-ac-LDL) ved -20 ° C. Før farging, tine Dil-ac-LDL på is. Aksjen Dil-ac-LDL Solusjon er 1 mg / ml. Oppbevar FITC-merket gulltorn agglutinin (Ulex -Lectin, 1 mikrogram / ml) ved 4 ° C. Aksjen Ulex -Lectin løsningen er 1 mg / ml. Oppbevares Hoechst 33342 ved 4 ° C. Aksjen Hoechst 33342 løsningen er 100 mikrogram / ml.
- Tilsett 10 ul av Dil-ac-LDL-stamoppløsning til 1 ml av kulturmedium for å lage en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml.
- Før farging fjerne det gamle mediet og vask cellene i hver brønn med nytt medium.
- Ta den nye medium og tilsett Dil-ac-LDL flekker medium.
- Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 1 time.
- Vask cellene med steril 1 x PBS 3 ganger.
- Tilsett 1 ml 10% formalin for å fiksere cellene. Sette platen i romtemperatur i ca. 30 min.
- Vask cellene med steril 1 x PBS 3 ganger. Unngå lys.
- Tilsett 1 ml steril 1x PBS som inneholder 10 mL av Ulex -Lectin.
- Cellene inkuberes ved rom- temperare i mørket i 1 time.
- Fjern det Ulex-lektin ved vasking av cellene med steril 1 x PBS 3 ganger.
- Legg Hoechst 33342 til endelig konsentrasjon på 1 pg / ml, inkuberes 10 min i mørket.
- Se fluorescens Dil-ac-LDL (rød, eksitasjon bølgelengde på 576 nm), Ulex -Lectin (grønn, eksitasjon bølgelengde på 519 nm) og Hoechst (blå, eksitasjon bølgelengde på 361 nm) med en invertert fluorescerende mikroskop.
- Fluorescent farging for CD31, VEGFR2 Enos, VE-cadherin og Calponin.
- Butikk FITC-konjugert anti-muse-CD31-antistoff, antistoff eNOS, VE-cadherin antistoff, FITC-konjugert-anti-kanin-IgG ved 4 ° C i mørket. Oppbevares VEGFR2 antistoff i -20 ° C.
- Vask cellene med steril 1 x PBS 3 ganger.
- Tilsett 1 ml 10% formalin for å fiksere cellene. Sette platen i romtemperatur i ca. 30 min.
- Vask cellene med steril 1 x PBS 3 ganger.
- Å farge CD31, tilsett 1 ml sterilt 1xPBS som inneholder 10 ul av CD31-FITC antistoff. Å farge enten VEGFR2 Enos, VE-cadherin eller calponin, tilsett 1 ml sterilt 1x PBS som inneholder 4 mL av VEGFR2 Enos, VE-cadherin eller calponin primært antistoff, henholdsvis.
- Cellene inkuberes på is i 1 time i mørke.
- Fjern de antistoffer ved vasking av cellene med steril PBS 3 ganger.
- For farging av VEGFR2 Enos, VE-cadherin eller calponin, tilsett 1 ml sterilt 1x PBS som inneholder 10 mL av FITC-konjugert anti-kanin IgG. Cellene inkuberes på is i 1 time i mørke. Fjern det IgG ved vasking av cellene med steril PBS 3 ganger.
- Legg Hoechst 33342 til endelig konsentrasjon på 1 pg / ml, inkuberes 10 min i mørket.
- Se fluorescens av CD31, VEGFR2 Enos, VE-cadherin, calponin (grønn, eksitasjon bølgelengde på 518-535 nm) og Hoechst (blå, eksitasjon bølgelengde på 361 nm) med en invertert fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotelceller Sprouting
Spontan endotelceller spirende startet fra en mus aorta segment. Musen aorta-segmentet ble tillatt å vokse i et vekstfaktor-redusert matrise deretter i endotelial cellevekstmedium i 4 dager. Den endotelceller spirende vises vanligvis i 2 - 4 dager. Photomicrographs ble tatt på dag 4 (figur 1). Som vist på bildene, mange endotelceller migrerer bort fra segmentet. De nydannede spirer fortsette å utvide fra segmentet og grenen.
Endotelceller fenotyper
Disse cellene demonstrerte spindel-formet og brosteinslignende kamper etter første passering (figur 2A). De festede celler ble merket med Dil-ac-LDL og Ulex -Lectin i en time. Som vist i figurene 2B-2E, de fleste av cellene var dobbelt-positive for Dil-ac-LDL opptak (rød) og Ulex -Lectin binding (grønn). I mellomtiden, etter den andre passasjen, var positive for blodplate-endothelial cell adhesion molecule 1 (CD31, PECAM-1, figur 2F) mer enn 95% av cellene, VEGFR2 (figur 2G), VE-cadherin (figur 2H), eNOS ( fig 2I), men negativ for Calponin (figur 2J) som er et glatt muskelcellemarkør.
Figur 1. endotelcelle Sprouting. Mus aorta-segmentet ble sådd ut på vekstfaktor-reduserte matrise og dyrket i endotelial cellevekstmedium. Endotelceller spirende startet så tidlig som på dag 2 (A, bar = 100 nm) og økt i følgende 2 - 3 dager (B, C, bar = 100 nm). Segmentet ble fjernet på dag 4 (D, bar = 500 mikrometer).
Figur 2. endotelceller fenotyper. Vedlagte celler vise spindel-formet og brosteinslignende skinn (A, bar = 100 mikrometer), dobbelt positiv fluorescens av Dil-ac-LDL og Ulex -Lectin (BE, bar = 100 nm). I mellomtiden, blodplate-endotelcelle adhesjonsmolekyl 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadherin, eNOS var positive i> 95% av cellene etter den andre passasje (FI, bar = 100 um) De fleste av cellene var negative for Calponin farging, noe som er et glatt muskelcellemarkør (J, bar = 100 pm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien viser en enkel metode for å isolere og kultur endotel- celler fra en mus aorta uten noe spesialutstyr. Den immunfluorescens farging indikerte at mesteparten av cellene var endoteliale celler etter den andre passasje. Det er foreslått at celler ved andre til tredje passasje er egnet for in vitro og in vivo forsøk for å studere endotelial biologi.
De viktigste Notater fra protokoll
Det er fem kritiske punkter i fremgangsmåten. Først blir de vaskulære hulrommet spylt med PBS inneholdende heparin for å minimalisere endotelial celleaktivering og dannelse av blodpropper. For det andre er tiden mellom hjertestans og såing av aorta segment på matrise kritisk til endotelet levedyktighet. Mens avskjære peri-arteriell fettvev og bindevev, unngå å strekke aorta og begrense tiden brukt på dette trinnet i en 10 - 15 min. Tredje, hellakkurat nok til å dekke media segmentene etter at de er sådd. For mye media vil føre til at aorta segmenter for å flyte. For det fjerde, inneholder kulturmediet en høy konsentrasjon av endotelial celleveksttilskudd, noe som gjør endotelceller vokser mye hurtigere enn når de dyrkes i endotelial vekstmedium-2. Den utvekst av endotelceller vil undertrykke andre celletyper, slik som glattmuskelceller og fibroblaster. Femte, timingen for å fjerne aorta-segment fra matriksen er også kritisk for renheten av endotelceller. Dette trinnet forhindrer kontaminering av fibroblaster og glatte muskelceller. Segmentet bør fjernes før utviklingen av røret nettverket. Forsinket fjerning av aorta-segment vil resultere i forurensning av andre celletyper slik som fibroblaster eller glatte muskelceller. Legg merke til at denne fremgangsmåten også brukes til å studere angiogenese in vitro og dannelsen av kapillære lignende strukturer indikerer angiogenese kapasitet av aorta segmentet. Basert på vår experience, hvis segmenter er fjernet etter kapillar-lignende struktur fullt utvikles, er forekomsten av glatte muskelceller kontaminering øker dramatisk. Derfor føler vi at det beste tidspunktet for å fjerne segmentet er når nettverket begynner å bli synlig, men er ikke fullt utviklet. På denne måte er vi i stand til å høste så mange endotelceller som mulig samtidig holde forurensning av glatte muskelceller til et minimum.
Begrensningene i denne protokoll
Det er noen begrensninger i de beskrevne fremgangsmåter. Først er det sjanser for forurensning av fibroblaster og glatte muskelceller, hvis aorta segmentene ikke er fjernet før tube nettverk utvikles. De fibroblaster eller glatte muskelceller kan begynne å feste til matrise og sprer tre til fem dager etter såing. Derfor må du alltid ta aorta segmentene på en riktig måte. Som sekundærforholdsregel, endre medium 2 timer etter re -plating cellene til en ny kolbe bidrar også til å eliminere den mulige forurensning av fibroblaster og glattmuskelceller. For det andre er disse cellene dyrkes in vitro i 7 - 10 dager etter isolasjon. Det er mulig at deres fenotyper kan være forskjellig fra nylig isolerte endotelceller. For eksempel, hvis endotelceller fra en musemodell av hyperlipidemi er dyrket i endotelial cellevekstmedium uten en høy konsentrasjon av lipider, er de ikke utsatt for hyperlipidemi miljøet som de var i dyr. De dyrkede endotelceller kan oppføre seg annerledes enn nylig isolerte endotelceller 8. Dette problemet eksisterer i alle in vitro dyrkede primære celler og cellelinjer. Tilsetning av patologiske stimuli i kulturmediet for å etterligne in vivo miljøet kan være en løsning.
Endotelceller Demonstrere ulike fenotyper i forskjellige Vaskulær Branches
e_content "> The karsystemet er en hierarkisk struktur består av arterier, vener og kapillærer. Den heterogenitet av endotelceller som bor i de spesifikke soner" av blodkar spiller en stor rolle i å skape funksjonelle mangfold i karsystemet 9,10. selv i en enkelt vaskulær seng, slik som aorta, eksisterer endotelial heterogenitet. Laminær blodstrøm med høy skjærspenning i den rette delen av aorta induserer endotelisk nitrogenoksidsyntase og trombomodulin 11. Derfor, endotelceller som befinner seg i den rette delen av aorta demonstrere anti-koagulant, anti-klebemiddel og anti-inflammatoriske egenskaper 12,13. i motsetning til dette, turbulent blodstrøm på områder hvor arterier gren eller svinge skarpt (aortabuen) reduserer endotelisk nitrogenoksidsyntase ekspresjon og induserer aterogene gener i endotelial -celler, det vil si, monocytt kjemotaktisk protein-1 (MCP-1), og blodplateavledet vekstfaktor (PDGFs), Hvilket resulterer i en pro-inflammatorisk og aterosklerotisk endotelial fenotype 6. I tillegg endotelceller i karene i hvert organ gjennomgå anatomiske og funksjonelle adaptive endringer som er spesifikke for at organ funksjoner 14,15. Ikke desto mindre, er det enighet om at flere celleoverflatemarkører, funksjonelle gener og celleaktiviteter kan benyttes for å karakterisere endotelcelle avstamning. Disse celleoverflatemarkører inkluderer blodplate endothelial cell adhesion molecule (PCAM-1, CD31), von Willebrand-faktor (vWF), vaskulær endotel-cadherin (VE-cadherin, CD144). De mest brukte funksjonelle gener inkluderer endothelial nitrogenoksid syntase (eNOS) og vaskulær endotel vekstfaktor reseptor (VEGFR). Celle aktiviteter som vanligvis sett i endotelceller avstamning inkludere opptak av Dil-ad-LDL og bindende lektin, som danner ledningen-lignende strukturer på matrisen.Betydningen og fremtidige anvendelser av Primary Cultured Mouse endotelceller fra aorta
Metoden som er beskrevet her, brukes for å studere makrovaskulære endotelceller. Betydningen av denne protokollen er at det gir en flott mulighet til å studere endotelceller spesifikke aktiviteter målrettede molekyler og kan gjøres på knockout og transgene musemodeller, noe som gjør det svært nyttig i kardiovaskulær forskning. Evnen til å vokse høyt antall mus endotelceller fra aorta under definerte betingelser som gjør denne ideelle teknikken for å bedre definere fenotyper og funksjoner av endotel. Denne teknikk forbedrer praktisk å teste potensielle potensialet av endotelial cellebasert terapi hos murine modeller, enten via intravenøs injeksjon eller innpoding av endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
