Introduction
Das vaskuläre Endothel nicht nur eine Barriereschicht ist , die Blut und Gewebe trennt, wird eine große endokrine Drüse betrachtet , die mit einer Oberfläche von 400 Quadratmetern 1 über den gesamten Gefäßbaum erstreckt. Das Wohlbefinden des Endothels ist wesentlich für vaskuläre Homöostase. Die dysfunktionalen Endothels beteiligt sich an verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen wie Atherosklerose, Vaskulitis und Ischämie / Reperfusion Verletzungen, usw. 2-4. Bis heute sind die spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen in dieser Krankheitseinstellungen beteiligt sind nicht gut verstanden durch die diffuses anatomischen Natur des Endothels.
Die Maus ist ein wichtiges Modell für die Forschung, da genetische Manipulationstechniken mehr bei Mäusen entwickelt als in jeder anderen Säugetierspezies. Jedoch ist die Isolierung von primären Maus-Aorta-Endothelzellen als besonders schwierig, da die geringe Größe der Aorta enzymat machtic Verdauung von Endothel nicht praktikabel. Einige Verfahren berichtet , zu isolieren und zu reinigen ECs 5-7 erfordern.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches Verfahren zu verwenden, um Endothelzellen aus der Maus Aorta zu isolieren und zu erweitern, ohne eine spezielle Ausrüstung. In diesem Protokoll wird die frisch isolierten Aorta in kleine Segmente geschnitten und ausgesät auf einer Matrix mit dem Endothel für endothelial Austrieb zu ermöglichen nach unten zeigt. Nach Segmenten entfernt werden, werden Endothelzellen in Endothel-bevorzugtes Medium erweitert und sind für Experimente nach zwei oder drei Passagen bereit. Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens sind, dass: 1) beträchtlich hohe Anzahl von Endothelzellen aus einer einzigen Aorta geerntet werden; 2) die Lebensfähigkeit der Zellen ist gut erhalten; und 3) keine spezielle Ausrüstung oder Technik erforderlich ist. Sie stellt ein wirksames Mittel zur spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen in Endothelzellen Pathophysiologie identifizieren. Für diejenigen, die bei der Untersuchung pr interessiert sindimary kultivierten Endothelzellen aus entweder Gen-Knock-out-Mäuse, Gen-Knock-in-Mäusen, oder einem murinen Krankheitsmodell ist dieses Protokoll sehr nützlich und leicht zu praktizieren.
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Protocol
1. Isolierung von Aorta von Mäusen
Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von der Wayne State University genehmigt.
- Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer der Anästhesiemaschine. Stellen Sie die Isofluran - Flow auf 4% in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O 2. Anesthetize die Maus durch Inhalation von Isofluran (4% für die Induktion, ± 1,0% für die Wartung) in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O 2 über Induktionskammer durch einen eigenen Bugnase gefolgt. HINWEIS: Anästhesie mit Isofluran kann in 75% Sauerstoff / 25% Luft oder 100% Sauerstoff zugeführt werden.
- Überprüfen Sie die Maus alle 5 Minuten, bis die angemessene Höhe der Anästhesie erreicht ist (Mangel an Rückzug bis Fuß Prise).
- Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und weiter Isofluran Inhalation obwohl die spezielle Nasenkegel, die mit dem Anästhesiegerät angeschlossen ist. Schalten Sie dieIsofluran fließen zu 1% Anästhesie aufrechtzuerhalten.
- Während es unter Narkose ist, legen Sie die Maus auf eine Operation Pad, auf dem Rücken positioniert. Verwenden Labor Band, die Glieder zu sichern.
- Verwenden Sie eine Wärmelampe die Maus warm zu halten. Halten Sie die Lampe in einem angemessenen Abstand von der Maus, so dass die Maus nicht überhitzen.
- Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol.
- Verwenden Sie Dissektion Schere den Bauch von der Mittellinie zu öffnen und die Bauchaorta aussetzen. Öffnen Sie die Brusthöhle und setzen das Herz und die Lunge.
- Schneiden Sie die Bauchaorta in der Mitte mit Dissektion Schere, um das Blut zu lösen.
- Füllen einer 1 ml Spritze (25 G Nadel) mit 1 ml PBS, enthaltend 1,000 U / ml Heparin. Injizieren PBS, enthaltend 1,000 U / ml Heparin zu dem linken Ventrikel und die Aorta perfundieren. Schieben Sie das Herz und die Lunge mit einer Pinzette an den großen Arterien auf die rechte Seite der Mäuse der thorakalen Aorta zu belichten.
- Entfernen Sie schnell die Brustaorta Mikro di mitssection Zange und legte sie in eiskaltem 1x PBS (steril), transportieren dann den Behälter in eine laminare Luftströmung Haube.
- Legen Sie eine 1-ml-Spritze mit 25 G-Nadel in ein Ende der Aorta eingesetzt und sanft die Aorta mit eiskaltem PBS spülen das Blut zu entfernen.
- Verwenden einer Pinzette Mikrodissektion so viel des anhänge Fettgewebe und kleine seitliche Gefäße wie möglich zu entfernen.
- Unmittelbar nach der Aorta übertragen Wachstumsmedium an Endothelzellen.
- Schneiden Sie die Aorta in 1 mm Ringe ein steriles Skalpell verwendet wird. Ernte etwa 8 - 10 Ringe pro Aorta.
- Öffnen Sie jeden Aorten-Ring ein Paar von Mikro-Dissektion Schere.
2. Seed die Aorten-Segmente auf Matrix
- Wenn nicht in Gebrauch, halten den Wachstumsfaktor reduzierte Matrix in 20 ° C Erstarrungs zu verhindern. Setzen Sie den Wachstumsfaktor reduzierte Matrix in 4 ° C mindestens über Nacht ein komplettes Tauwetter zu ermöglichen.
- Vorkühlung eine 6-Well-Platte und Pipettenspitzen bis -20 ° C für mindestens10 Minuten. Legen Sie die 6-Well-Platte auf Eis und Mantel eine Vertiefung der Platte mit 1 ml Matrix ohne Luftblasen einzuführen. Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten die Matrix zu ermöglichen, sich zu verfestigen.
- Implantieren Sie die Aorten-Stücke auf die verfestigte Matrix mit sterilen Mikro-Dissektion Pinzette. Legen Sie die Stücke Lumen-Seite nach unten auf die Matrix ohne das Endothel zu berühren. Platzieren von 3 bis 4 aortic Segmente nahe beieinander auf der Matrix.
- In gerade genug endothelialen Zellwachstumsmedium zu halten Segmente nass (~ 200 ul).
- Inkubieren der Platte bei 37 ° C unter 5% CO 2 für 4 bis 6 h. Am Ende des Tages, fügen Sie einfach genug Medium die Aorten-Segmente abzudecken.
- Beachten Sie die Aorten-Segment in regelmäßigen Abständen unter einem Phasenkontrastmikroskop sprießen. Überprüfen mittleren Ebene und das Zellwachstum pro Tag. In Medium bei Bedarf abgedeckt Aorten-Segmente zu halten.
- Am 4. Tag, entfernen Sie das Medium und entfernen Sie die Aorten - Segmente fROM mit der Matrix mit einer sterilen Nadel ohne die wachsenden Endothelzellen zu unterbrechen.
- In 2 ml neuen endothelialen Zellwachstumsmedium und damit die Endothelzellen weiterhin auf Matrix 2 zu vermehren - 3 Tage.
3. Erste Passagierung der Maus Aortic Endothelial Cells
- Mantel ein neuer T12.5 Kolben mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
- Waschen Sie die Matrixplatten vorsichtig mit sterilem PBS 37 ° C.
- In 2 ml neutralen Proteinase (50 U / ml) auf die Matrixplatten und Inkubation bei Raumtemperatur auf Wippschüttler mit gelegentlichem Schütteln. Schauen Sie sich die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop die Mehrzahl der Zellen, um sicherzustellen, abgelöst werden.
- 2 mL D-Val in die neutrale Proteinase zu inaktivieren.
- Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Platte mit 2 ml D-Val und sammeln den Überstand.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 g für 5 min bei room Temperatur.
- Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml Endothelzellen-Wachstumsmedium und der Platte in dem T12.5 Kolben mit Gelatine beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 h.
- Ersetzen Sie das Medium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 , bis sie 85% - 90% konfluent.
4. Passagierung der Maus Aortic Endothelial Cells
- Mantel zwei neue T12.5 Kolben mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Vorheizen Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 0,02 EDTA in PBS) und sterile PBS bei 37 ° C für etwa 15 min.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einer sterilen 37 ° C PBS.
- In 0,5 ml Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 0,02 EDTA in PBS) und Inkubation bei 37 ° C für ca. 1 min oder bis die Mehrzahl der Zellen umdrehen.
- 2 mL endothelialen Zellwachstumsmedium, das die Verdauung zu stoppen. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten in den Kolben mehrmals. Verwenden Sie bei Bedarf eine ZelleSchaber um die Zellen zu sammeln.
- Sammeln der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml Endothelzellen-Wachstumsmedium und der Platte in 2 T12.5 Kolben mit Gelatine beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 h.
- Ersetzen Sie das Medium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 , bis sie 85% - 90% konfluent.
- Verwenden Sie die Maus Aorten-Endothelzellen nach 2 - 3 Passagen.
5. Charakterisierung der Maus Aortic Endothelial Cells
- Re-Platte die Zellen.
- Mantel eine 6-well-Platte mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Spülen Sie die Platte mit PBS.
- Vorheizen Trypsin-EDTA und sterilem PBS auf 37 ° C für etwa 15 min.
- Waschen Sie die Zellen mit steriler PBS 3 mal. In 0,5 ml Trypsin / EDTA zu den Zellen, Inkubation für ca. 1 min bei 37 ° C or, bis die Mehrheit der Zellen umdrehen.
- 2 mL endothelialen Zellwachstumsmedium, das die Verdauung zu stoppen. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten in den Kolben mehrmals. Verwenden Sie bei Bedarf einen Zellschaber um die Zellen zu sammeln.
- Sammeln der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Überstand verwerfen, wieder die Zellen in endothelialen Zellwachstumsmedium. Samen , die Zellen in 6-Well - Platte , beschichtet mit Gelatine in einer Dichte von 3 x 10 5 / Vertiefung.
- Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 werden die Zellen zu erlauben , auf die Kulturoberfläche zu befestigen.
- Dil-Ac-LDL uptaken und Ulex -lectin Bindung.
- Bewahren Sie die 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-Carbocyaninfarbstoffes Perchlorat-markierten acetyliertes LDL (Dil-Ac-LDL) bei -20 ° C. Vor dem Färben, auftauen Dil-Ac-LDL auf Eis. Die Aktie Dil-Ac-LDL solution beträgt 1 mg / mL. Lagern Sie den FITC-markierten Ulex europaeus Agglutinin (Ulex -Lectin, 1 & mgr; g / ml) bei 4 ° C. Die Aktie Ulex -Lectin Lösung beträgt 1 mg / ml. Store Hoechst 33342 bei 4 ° C. Die Aktie Hoechst 33342 Lösung ist 100 ug / ml.
- Fügen Sie 10 & mgr; l von Dil-Ac-LDL-Stammlösung auf 1 ml Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 ug / ml zu erhalten.
- Vor der Färbung, entfernen Sie das alte Medium und waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit neuen Medium.
- Nehmen Sie das neue Medium und fügen Sie die Dil-Ac-LDL-Färbung Medium.
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1 h.
- Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal.
- 1 ml 10% Formalin, die Zellen zu fixieren. Legen Sie die Platte in Raumtemperatur für etwa 30 min.
- Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal. Vermeiden Sie Licht.
- In 1 ml sterile 1x PBS , die 10 & mgr; l von Ulex -Lectin enthält.
- Inkubieren Sie die Zellen bei Raum temperature im Dunkeln für 1 h.
- Entfernen Sie die Ulex-Lektin, indem die Zellen mit steriler PBS 1x 3-mal gewaschen wurde.
- Hinzufügen Hoechst 33342 bis zu einer Endkonzentration von 1 ug / ml, 10 min Inkubieren im Dunkeln.
- Sehen Sie sich die Fluoreszenz von Dil-Ac-LDL (rot, Anregungswellenlänge von 576 nm), Ulex -Lectin (grün, Anregungswellenlänge von 519 nm) und Hoechst (blau, Anregungswellenlänge von 361 nm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
- Fluoreszenzfärbung für CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin und Calponin.
- Store FITC-konjugiertem anti-Maus-CD31-Antikörper, Antikörper eNOS, VE-Cadherin-Antikörper FITC-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG bei 4 ° C im Dunkeln. Store VEGFR2 Antikörper in -20 ° C.
- Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal.
- 1 ml 10% Formalin, die Zellen zu fixieren. Legen Sie die Platte in Raumtemperatur für etwa 30 min.
- Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal.
- Beflecken CD31, 1 ml steriler 1xPBS, das 10 & mgr; l von CD31-FITC-Antikörper enthält. Um Fleck entweder VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin, 1 mL sterile 1x PBS, die 4 ul VEGFR2 enthält, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin primären Antikörper sind.
- Inkubieren der Zellen auf Eis für 1 h in der Dunkelheit.
- Entfernen der Antikörper, die durch die Zellen mit steriler PBS 3 mal waschen.
- Für die Färbung von VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin, 1 ml steriler 1x PBS, das 10 & mgr; l FITC-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG enthält. Inkubieren der Zellen auf Eis für 1 h in der Dunkelheit. Entfernen Sie die IgG, indem die Zellen mit steriler PBS 3 mal waschen.
- Hinzufügen Hoechst 33342 bis zu einer Endkonzentration von 1 ug / ml, 10 min Inkubieren im Dunkeln.
- Sehen Sie sich die Fluoreszenz von CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin, Calponin (grün, Anregungswellenlänge von 518 bis 535 nm) und Hoechst (blau, Anregungswellenlänge von 361 nm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Endothelzell Sprießen
Spontane Endothelzellen aus einem Maus-Aorta-Segment gestartet sprießen. Die Maus-Aorta-Segment wurde für 4 Tage auf einem Wachstumsfaktor-reduzierte Matrix dann in endothelialen Zellwachstumsmedium wachsen gelassen. Die Endothelzellen Austrieb erscheint in der Regel innerhalb von 2 - 4 Tage. Photomikrographien wurden am Tag 4 (Figur 1) aufgenommen. Wie in den Abbildungen gezeigt, wandern zahlreiche Endothelzellen aus dem Segment entfernt. Die neu gebildeten Sprossen weiterhin aus dem Segment und den Zweig zu erweitern.
Endothelzell-Phänotypen
Diese Zellen zeigten spindelförmigen und pflastersteinartigen Erscheinungen nach dem ersten Durchgang (2A). Die anhaftenden Zellen wurden für eine Stunde mit Dil-Ac-LDL und Ulex -Lectin gekennzeichnet. Wie in den Figuren 2B-2E gezeigt wird , waren die meisten der Zellen doppelt positiv für Dil-Ac-LDL Aufnahme (rot) und Ulex -Lectin Bindung (grün). Inzwischen wird nach dem zweiten Durchgang mehr als 95% der Zellen positiv für plättchen endothelial cell adhesion molecule 1 (CD31, PECAM-1, 2F) waren, VEGFR2 (Figur 2G), VE-Cadherin (Figur 2H), eNOS ( 2I) , aber negativ für Calponin (2J) , die eine glatte Muskelzelle Marker ist.
Abbildung 1. Endothelzell Sprießen. Maus-Aorten-Segment wurde auf Wachstumsfaktor reduziert ausgesät Matrix und kultiviert in endothelialen Zellwachstumsmedium. 3 Tage (B, C, bar = 100 & mgr; m) - Endothelial Zelle bereits am Tag 2 (A, bar = 100 & mgr; m) und erhöhte sich in den folgenden 2 gestartet sprießen. Das Segment wurde am Tag 4 entfernt (D, bar = 500 & mgr; m).
Abbildung 2. Endothelzell Phänotypen. Die anhaftenden Zellen zeigen spindelförmig und pflastersteinartigen Erscheinungen (A, bar = 100 & mgr; m), Doppel-positive Fluoreszenz von Dil-Ac-LDL und Ulex -Lectin (BE, bar = 100 & mgr; m). Inzwischen plättchen endothelial cell adhesion molecule 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-Cadherin, eNOS positiv waren in> 95% der Zellen nach dem zweiten Durchgang (FI, bar = 100 um) Die meisten Zellen waren negativ für Calponin Färbung, die eine glatte Muskelzellmarker ist (J, bar = 100 & mgr; m).
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Discussion
Diese Studie zeigt, ein einfaches Verfahren zur Isolierung und Kultur Endothelzellen von einer Maus Aorta ohne spezielle Ausrüstung. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, daß die Mehrzahl der Zellen Endothelzellen nach dem zweiten Durchgang waren. Es wird vorgeschlagen , dass die Zellen am zweiten in den dritten Durchgang geeignet sind , in vitro und in vivo Experimenten endothelial biology zu studieren.
Die EVP - ED aus dem Protokoll
Es gibt fünf kritische Punkte in dem Verfahren. Zuerst wird das Gefäßlumen mit PBS, enthaltend Heparin gespült, um endotheliale Zellaktivierung und die Gerinnselbildung zu minimieren. Zweitens ist die Zeit zwischen Herzstillstand und dem Säen des aortischen Segmentes auf einer Matrix auf Endothel Lebensfähigkeit kritisch. Während die peri-arterielle Fettgewebe und Bindegewebe Clearing, vermeiden Sie die Aorta Strecken und die Zeit auf diesen Schritt 10 ausgegeben begrenzen - 15 min. Drittens gießengerade genug, um Medien, die Segmente zu decken, nachdem sie geimpft sind. Zu viel Medien werden die Aorten-Segmente führen zu schweben. Viertens, das Kulturmedium enthält eine hohe Konzentration an endothelialen Zellwachstumsergänzungsmittel, wachsen Endothelzellen machen viel schneller als wenn sie in endothelialen Wachstumsmedium-2. Der Auswuchs von Endothelzellen werden andere Zelltypen wie glatte Muskelzellen und Fibroblasten unterdrücken. Fünftens, das Timing Aortensegment von Matrix zu entfernen, ist ebenfalls kritisch für die Reinheit von Endothelzellen. Dieser Schritt verhindert, dass Verunreinigungen durch Fibroblasten und glatte Muskelzellen. Das Segment sollte vor der Entwicklung des Rohrnetzwerk entfernt werden. Verzögert Entfernung von Aortensegment wird in Kontaminierung anderer Zelltypen, wie Fibroblasten oder glatten Muskelzellen führen. Bitte beachten Sie, dass dieser Ansatz auch zu studieren Angiogenese in vitro verwendet wird und die Bildung von kapillaren artigen Strukturen zeigt Angiogenese Kapazität des Aorta - Segment. Auf der Basis unserer experience, wenn die Segmente entfernt werden, nachdem die Kapillare artige Struktur das Auftreten von glatten Muskelzellen Verschmutzung steigt dramatisch vollständig entwickelt. Daher glauben wir, dass der beste Zeitpunkt, das Segment zu entfernen ist, wenn das Netzwerk sichtbar zu sein beginnt, aber noch nicht voll entwickelt. Auf diese Weise sind wir in der Lage, so viele Endothelzellen wie möglich zu ernten, während Verunreinigungen durch glatte Muskelzellen auf einem Minimum zu halten.
Die Einschränkungen des Protokolls
Es gibt einige Einschränkungen der beschriebenen Verfahren. Erstens gibt es die Chancen der Kontamination von Fibroblasten und glatten Muskelzellen, wenn die Aorten-Segmente nicht entfernt werden, bevor Rohrnetze entwickeln. Die Fibroblasten oder glatten Muskelzellen kann beginnen mit der Matrix zu befestigen und 3 bis 5 Tage nach dem Aussäen proliferieren. Daher immer die Aorten-Segmente in einer angemessenen Art und Weise zu entfernen. Als Neben vorsorglich die Medium 2 Stunden nach dem erneuten Wechsel die Zellen auf einen neuen Kolben -plating hilft auch, die mögliche Kontamination von Fibroblasten und glatten Muskelzellen zu beseitigen. Zweitens sind diese Zellen in vitro für 7 bis 10 Tage nach der Isolierung. Es ist möglich, dass die Phänotypen von frisch isolierten Endothelzellen unterschiedlich sein kann. wenn die Endothelzellen aus einem Maus-Modell von Hyperlipidämie kultiviert werden in endothelialen Zellwachstumsmedium, zum Beispiel ohne eine hohe Konzentration von Lipiden, sie sind nicht auf die hyperlipidämischen Umgebung ausgesetzt, da sie in Tieren waren. Die kultivierten Endothelzellen können unterschiedlich von frisch isolierten Endothelzellen 8 verhalten. Dieses Problem besteht bei allen in vitro kultivierten Primärzellen und Zelllinien. Hinzufügen der pathologischen Stimuli in das Kulturmedium zu imitieren , die in vivo - Umgebung kann eine Lösung sein.
Endothelial Cells Demonstrieren unterschiedlichen Phänotypen in verschiedenen Gefäß Branchen
e_content "> das Gefäßsystem ist eine hierarchische Struktur von Arterien zusammengesetzt, Venen und Kapillaren. Die Heterogenität von Endothelzellen , die in den spezifischen" Zonen "von Gefßsystem befinden spielt eine große Rolle bei der Schaffung funktionelle Diversität in das Gefäßsystem 9,10. selbst in einem einzigen Gefäßbett, beispielsweise der Aorta, existiert endothelial Heterogenität. Laminar Blutfluss mit hoher Scherbeanspruchung in dem geraden Teil der Aorta 11 endothelialer Stickstoffmonoxid-Synthase und Thrombomodulin induziert. Daher endotheliale Zellen , die in dem geraden Teil besteht aus die Aorta zeigen Antikoagulans, antiadhäsiven und entzündungshemmende Eigenschaften 12,13. im Gegensatz dazu turbulenten Blutfluss in Bereichen , in denen Arterien Zweig oder scharf abbiegen (Aortenbogen) reduziert endotheliale Expression Stickstoffmonoxid-Synthase und induziert atherogenen Gene in endothelial Zellen, dh die Monozyten - chemotaktisches Protein-1 (MCP-1) und Thrombozyten-Wachstumsfaktoren (PDGFs), 6 in einer pro-inflammatorischen und atherosklerotischen endothelialen Phänotyp führt. Darüber hinaus unterziehen Endothelzellen in den Gefäßen des jeweiligen Organs anatomische und funktionelle adaptive Veränderungen , die 14,15 zu , dass die Organfunktionen spezifisch sind. Nichtsdestotrotz gibt es einen Konsens, dass mehrere Zelloberflächenmarker, funktionelle Gene und Zellaktivitäten verwendet werden können endotheliale Zelllinie zu charakterisieren. Diese Zelloberflächenmarker umfassen Platelet endothelial cell adhesion molecule (PCAM-1, CD31), von Willebrand-Faktor (vWF), Vascular Endothelial-Cadherin (VE-Cadherin, CD144). Die am häufigsten verwendeten funktionelle Gene umfassen endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) und Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR). Die Zellaktivitäten, die in der Regel in endothelialen Zelllinie zu sehen sind die Aufnahme von Dil-ad-LDL und bindendes Lektin, die schnurartigen Strukturen auf der Matrix bildet.Die Bedeutung und zukünftige Anwendungen von Primary Cultured Maus Aortic Endothelial Cells
Das hier beschriebene Verfahren wird verwendet, makrovaskulärer Endothelzellen zu studieren. Die Bedeutung dieses Protokolls ist, dass es eine große Chance bietet, die endothelial-spezifischen Aktivitäten gezielt Moleküle zu studieren und in Knock-out und transgenen Mausmodellen durchgeführt werden, ist es sehr nützlich, in der kardiovaskulären Forschung zu machen. Die Fähigkeit, eine hohe Zahl von Maus Aorta-Endothelzellen unter definierten Bedingungen zu wachsen, macht diese ideale Technik, um besser die Phänotypen und Funktionen des Endothels definieren. Diese Technik verbessert die praktische Anwendbarkeit des zukünftigen Potential von endothelialen zellbasierte Therapie in murinen Modellen zu testen, entweder durch intravenöse Injektion oder Verpflanzung von Endothelzellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
