Introduction
האנדותל של כלי הדם הוא לא רק שכבת מחסום שמפרידה דם ורקמות, זה נחשב בלוטת אנדוקרינית עצומה המשתרעת על עץ כלי הדם כולו עם שטח פנים של 400 מ"ר 1. את רווחתם של האנדותל חיוני הומאוסטזיס וסקולרית. האנדותל מתפקדת משתתף והפרעות שונות לב וכלי דם, כולל טרשת עורקים, וסקוליטיס ופציעות איסכמיה / reperfusion, וכו '2-4. נכון להיום, את המנגנונים תאיים ומולקולריים הספציפיים המעורבים הגדרות מחלות אלה אינם מובנים היטב בשל אופי אנטומיים המתפזר של האנדותל.
העכבר הוא מודל חשוב למחקר כי טכניקות מניפולציה גנטיות הן יותר התפתחו בעכברים מאשר בכל מיני יונקים אחרים. עם זאת, את הבידוד של תאי אנדותל אב עורקים בעכברים העיקריים נחשב קשה במיוחד בגלל גודלו הקטן של אב העורקים עושה enzymatעיכול ic של האנדותל מעשי. חלקם דיווחו נהלים לבודדים ולטהר ECS דורשות 5-7.
מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בשיטה פשוטה כדי לבודד להרחיב בתאי האנדותל מן האאורטה העכבר ללא שימוש בכל ציוד מיוחד. בפרוטוקול זה, האאורטה המבודד הטרי נחתך למקטעים קטנים זורע על מטריצה עם האנדותל פונה כלפי מטה על מנת לאפשר הנבטה האנדותל. לאחר המגזרים יוסרו, תאי אנדותל מורחבים במדיום האנדותל מועדף והם מוכנים לניסויים אחרי שניים או שלושה קטעים. היתרונות של השיטה המתוארת הם כי: 1) מספרים גבוהים באופן משמעותי של תאי אנדותל נקצרים מן האאורטה יחיד; 2) כדאיות התא נשמר היטב; ו -3) לא נדרש ציוד או טכניקה מיוחדת. הוא מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים תאיים ומולקולריים ספציפיים פתופיזיולוגיה תא האנדותל. לאלו המעוניינים ללמוד יחסי ציבורimary בתרבית תאי אנדותל מעכברי נוק-אאוט או גן, גן עקום בעכברים, או מודל מחלה בעכברים, פרוטוקול זה הוא מאוד שימושי וקל לתרגל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניתוק של אבי העורקים מעכברים
כל הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש של וויין סטייט.
- שים את העכבר לתוך תא האינדוקציה של מכונת ההרדמה. הגדר את זרימת isoflurane ל 4% בשילוב עם 25% אוויר צח 75% O 2. להרדים את העכבר על ידי שאיפה של isoflurane (4% לזירוז, ± 1.0% לצורך תחזוקה) בשיתוף עם 25% אוויר צח 75% O 2 באמצעות תא אינדוקציה ואחריו חרטומו ייעודי. הערה: הרדמה עם isoflurane ניתן להעביר 75% חמצן / 25% האוויר או 100% חמצן.
- בדוק את העכבר כל 5 דקות עד הרמה המתאימה של הרדמה הוא הגיעה (חוסר נסיגת קמצוץ בוהן).
- קח את העכבר מחוץ לתא האינדוקציה ולהמשיך משאיפת isoflurane למרות חרטומו הייעודי המחובר למכונת ההרדמה. הבוררisoflurane לזרום עד 1% כדי לשמור על הרדמה.
- אמנם זה בהרדמה, לשים את העכבר על כרית ניתוח, ממוקמת על הגב שלו. השתמש קלטת מעבדה להבטחת הגפיים.
- השתמש מנורת חימום כדי לשמור על חומו של העכבר. שמור את המנורה במרחק מתאים מן העכבר, כך העכבר לא יתר חום.
- תרסיס החזה עם 70% אתנול.
- השתמש במספריים לנתיחה כדי לפתוח את הבטן מן קו האמצע, ולחשוף את אבי העורקים בבטן. פתח את חלל החזה ולחשוף את הלב והריאות.
- חותכים את אבי העורקים בבטן באמצע במספריים לנתיחה כדי לשחרר את הדם.
- ממלאים מזרק 1 מ"ל (עם 25 מחט G) עם 1 מ"ל של PBS המכיל 1,000 U / mL של הפרין. להזריק PBS המכיל 1,000 U / mL של הפרין אל החדר השמאלי ו perfuse האאורטה. דחוף את הלב ואת הריאות עם מלקחיים על העורקים הגדולים לצד ימין של עכברים כדי לחשוף את אבי העורקים החזי.
- להסיר במהירות את אבי העורקים החזי באמצעות-di מיקרומלקחיים ssection והכניס אותו 1x קר כקרח PBS (סטרילי), ולאחר מכן להעביר את המיכל לתוך ברדס זרימת אוויר למינרית.
- הכנס מזרק 1 מ"ל מצויד עם 25 G מחט לתוך קצה אחד של אבי העורקים, בעדינות ולשטוף את אבי העורקים עם PBS קר כקרח כדי להסיר את הדם.
- שימוש במלקחיים מיקרו לנתיחה כדי להסיר כמה שיותר רקמת השומן המצורפת וקטנים כלי לרוחב ככל האפשר.
- מיד להעביר את אבי העורקים אנדותל מדיום הגידול.
- חותכים את אבי העורקים לתוך 1 טבעות מ"מ באמצעות סכין אזמל סטרילי. קציר על 8 - 10 טבעות לכל האאורטה.
- פתח כל טבעת אבי העורקים באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה.
זרע 2. מגזרי אבי העורקים על מטריקס
- כאשר אינו בשימוש, לשמור על מטריקס צמיחה מופחתת גורם -20 ° C כדי למנוע התמצקות. שים את מטריקס גורם מופחת הצמיחה 4 מעלות צלזיוס לפחות לילה כדי לאפשר הפשרה מלאה.
- Precool טיפים צלחת pipet 6 גם ל -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות10 דק '. מכניסים את הצלחת 6-היטב על קרח מעיל אחד טוב של צלחת עם 1 מ"ל של מטריקס ללא החדרת בועות אוויר. מניח את הצלחת בתוך 37 ° C חממה עבור 20 דקות, כדי לאפשר המטריצה כדי לחזק.
- השתל החלקים אבי העורקים על מטריצה הקרושה באמצעות מלקחיים מיקרו לנתיחה סטרילית. מניחים את חתיכות לומן-צדה על המטריצה בלי לגעת האנדותל. מניחים 3 - 4 מגזרים אבי העורקים קרובים זה לזה על המטריצה.
- להוסיף מספיק מדיום גידול תא האנדותל כדי לשמור קטעים רטובים (~ 200 μL).
- דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 ל -4 עד 6 שעות. בסוף היום, להוסיף מספיק בינוני כדי לכסות את פלחי אבי העורקים.
- שימו במגזר אבי העורקים הנבטה מעת לעת תחת מיקרוסקופ שלב ניגודיות. בדוק את הרמה בינונית צמיחת תאים בכל יום. הוסף בינוני במידת צורך לשמור מגזרי אב עורקים מכוסים.
- ביום 4 th, בעדינות להסיר את המדיום ולהסיר את f מגזרים אבי העורקיםROM מטריקס באמצעות מחט סטרילית בלי להפריע לתאי אנדותל גדל.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום הגידול סלולרי חדש אנדותל ולאפשר לתאי אנדותל ממשיכים להתרבות על מטריקס עבור 2 - 3 ימים.
3. Passaging ראשונית של לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר
- מעיל בקבוקון T12.5 חדש עם ג'לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- שטפו את צלחות מטריקס בזהירות עם 37 סטרילי ° C PBS.
- הוסף 2 מ"ל של proteinase נייטרלי (50 U / mL) אל צלחות מטריקס דגירה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה פלטפורמה עם רעד מדי פעם. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד לוודא שרוב התאים מנותקים.
- הוסף 2 מ"ל של D-Val כדי להשבית את proteinase נייטרלי.
- אסוף את supernatant בקפידה צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לשטוף את הצלחת עם 2 מ"ל D-Val ולאסוף את supernatant.
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות ב רוטמפרטורה מ.
- Re- להשעות את התא גלולה ב 4 מ"ל של מדיום הגידול תא האנדותל צלחת בבקבוק T12.5 מצופה ג'לטין. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 שעות.
- החלף את המדיום. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שהם 85% - 90% ומחוברות.
4. Passaging של לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר
- מעיל שתי צלוחיות T12.5 חדש עם ג'לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. טריפסין- EDTA טרום חום (0.25% טריפסין, 0.02 EDTA ב PBS) PBS סטרילית על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות.
- שוטפים את התאים בזהירות עם 37 סטרילי ° C PBS.
- הוסף 0.5 מ"ל של טריפסין- EDTA (0.25% טריפסין, 0.02 EDTA ב PBS) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 1 דקות או עד שרוב התאים להסתובב.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום הגידול תא האנדותל כדי לעצור את העיכול. פיפטה השעית התא למעלה ולמטה תוך זמני הבקבוק כמה. במידת הצורך, להשתמש בתאמגרד כדי לאסוף את התאים.
- אסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- Re- להשעות את התא גלולה ב 4 מ"ל של מדיום צלחת צמיחת תאים האנדותל 2 צלוחיות T12.5 מצופה ג'לטין. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 שעות.
- החלף את המדיום. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שהם 85% - 90% ומחוברות.
- השתמש בתאי האנדותל אבי העורקים עכבר לאחר 2 - 3 קטעים.
אפיון 5. לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר
- Re-צלחת התאים.
- מעיל 6-גם צלחת עם ג'לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. יש לשטוף את הצלחת עם PBS.
- בצעו חימום מוקדם של טריפסין-EDTA ו PBS סטרילי עד 37 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות.
- שוטפים את התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS. הוסף 0.5 מ"ל של טריפסין / EDTA על התאים, דגירה של ~ 1 דקות ב 37 ° C or עד שרוב התאים להסתובב.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום הגידול תא האנדותל כדי לעצור את העיכול. פיפטה השעית התא למעלה ולמטה תוך זמני הבקבוק כמה. במידת הצורך, להשתמש מגרד תא לאסוף את התאים.
- אסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- בטל supernatant, מחדש להשעות את התאים במדיום גידול תא האנדותל. זרעים התאים בצלחת 6-היטב מצופה ג'לטין בצפיפות של 3 x 10 5 / טוב.
- דגירת תאי הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר לתאים לצרף אל פני שטח התרבות.
- דיל-AC-LDL uptaken ו Ulex -lectin מחייב.
- אחסן את-3,3,3 1,1'-dioctadecyl ', 3'- tetramethylindo-carbocyanine שכותרתו פרכלורט LDL acetylated (דיל-AC-LDL) ב -20 ° C. לפני מכתים, להפשיר דיל-AC-LDL על הקרח. Solu המניות דיל-AC-LDLtion הוא 1 מ"ג / מ"ל. אחסן את agglutinin europaeus Ulex FITC שכותרתו (Ulex -Lectin, 1 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה 4 מעלות צלזיוס. פתרון המניות Ulex -Lectin הוא 1 מ"ג / מ"ל. חנות Hoechst 33342 ב 4 מעלות צלזיוס. המניה Hoechst 33342 הפתרון הוא 100 מיקרוגרם / מ"ל.
- הוסף 10 μL של פתרון המניות דיל-AC-LDL ל 1 מ"ל של מדיום תרבות לעשות לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
- לפני מכתים, להסיר את המדיום הישן לשטוף את התאים בכל טוב עם המדיום החדש.
- הסר את המדיום החדש ולהוסיף המדיום מכתים דיל-AC-LDL.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור H 1.
- שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי.
- הוסף 1 מ"ל של פורמלין 10% כדי לתקן את התאים. שים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך כ 30 דקות.
- שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. הימנע אור.
- הוסף 1 מ"ל סטרילי 1x PBS המכיל 10 μL של Ulex -Lectin.
- דגירת התאים ב חדר טמפרטורותמחדש בחושך במשך 1 שעה.
- הסר את Ulex-לקטינים על ידי שטיפת התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי.
- להוסיף Hoechst 33342 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל, דגירה 10 דקות בחושך.
- הצג את הקרינה של-LDL דיל-AC (אדום, גל עירור של 576 ננומטר), Ulex -Lectin (ירוק, גל עירור של 519 ננומטר) ו Hoechst (כחול, גל עירור של 361 ננומטר) עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה.
- מכתים פלורסנט עבור CD31, VEGFR2, אינס, VE-cadherin ו Calponin.
- FITC- מצומדות חנות אנטי עכבר נוגדנים CD31, נוגדן אינס, VE-cadherin נוגדן, FITC- מצומדות IgG נגד ארנב ב 4 ° C בחושך. VEGFR2 חנות נוגדן -20 ° C.
- שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי.
- הוסף 1 מ"ל של פורמלין 10% כדי לתקן את התאים. שים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך כ 30 דקות.
- שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי.
- כדי להכתים CD31, להוסיף 1 מ"ל של 1x סטריליPBS המכיל 10 μL של נוגדן CD31-FITC. כדי להכתים או VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin, להוסיף 1 מ"ל של PBS 1x סטרילי המכיל 4 μL של VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin נוגדן ראשוני, בהתאמה.
- דגירת התאים על קרח למשך 1 שעות בחושך.
- הסר נוגדנים על ידי שטיפת התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS.
- עבור מכתים של VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin, להוסיף 1 מ"ל של PBS 1x סטרילי המכיל 10 μL של IgG נגד ארנב FITC- מצומדות. דגירת התאים על קרח למשך 1 שעות בחושך. הסר את IgG ידי שטיפת התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS.
- להוסיף Hoechst 33342 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל, דגירה 10 דקות בחושך.
- הצג את הקרינה של CD31, VEGFR2, אינס, VE-cadherin, calponin (ירוק, גל עירור של 518-535 ננומטר) ו Hoechst (כחול, גל עירור של 361 ננומטר) עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנבטת תא האנדותל
תא האנדותל ספונטני נברא נכתב ממקטע עכבר אב עורקים. מגזר האאורטה העכבר היה מותר לגדל על מטריצה-מופחת גורם גדילה אז במדיום גידול תא האנדותל במשך 4 ימים. נביטת תא האנדותל מופיעה בדרך כלל 2 - 4 ימים. Photomicrographs נלקח ביום 4 (איור 1). כפי שניתן לראות בתמונות, תאי אנדותל רבים נודדים הרחק במגזר. הנבטים שהוקמו זה עתה ממשיכים להרחיב מהמגזר ואת הסניף.
פנוטיפים תא האנדותל
תאים אלה הפגינו הופעות כישוריות ו מרוצפות דמוית אחרי (איור 2 א) מעבר ראשוני. התאים מחוברים תויגו עם דיל-AC-LDL ו- Ulex -Lectin במשך שעה אחת. כפי שניתן לראות 2B-2E הדמוי, רוב התאים היו פעמים חיוביות עבור דיל-AC-LDL ספיגת (אדום) ו Ulex -Lectin מחייב (ירוק). בינתיים, לאחר הקטע השני, יותר מ -95% מכלל התאים היו חיוביות עבור מולקולה הידבקות תא האנדותל טסיות 1 (CD31, PECAM-1, איור 2F), VEGFR2 (איור 2G), VE-cadherin (איור 2H), eNOS ( איור 2I) אבל שלילי עבור Calponin (איור 2J) אשר מהווה סמן תא שריר חלק.
Cell איור 1. האנדותל הנבטה. קטע עכבר אב עורקים היה זורע על מטריצת גורם מופחת צמיחה בתרבית בינוני צמיחת תא האנדותל. נבראת התחיל תא האנדותל מוקדם ככל ביום 2 (א ', בר = 100 מיקרומטר) והגדילה ב 2 הבא - 3 ימים (B, C, בר = 100 מיקרומטר). המגזר הוסר ביום 4 (D, בר = 500 מיקרומטר).
איור 2. פנוטיפים תא האנדותל. התאים מחוברים להציג בצורת ציר מרוצפת דמוי הופעות (A, בר = 100 מיקרומטר), קרינת פעמים החיוביות של דיל-AC-LDL ו- Ulex -Lectin (BE, בר = 100 מיקרומטר). בינתיים, הדבקת תא האנדותל טסיות מולקולת 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadherin, eNOS היה חיובי> 95% של התאים לאחר הקטע השני (FI, בר = 100 מיקרומטר) רוב התאים היו שליליים עבור מכתים Calponin, אשר מהווה סמן תא שריר חלק (J, בר = 100 מיקרומטר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מדגים שיטה פשוטה לבודדים תאי התרבות האנדותל מתוך האאורטה עכבר בלי שום ציוד מיוחד. מכתים immunofluorescence הצביע על כך שרוב התאים היו תאי אנדותל לאחר הקטע השני. הוא הציע כי תאים ב שני למעבר שלישי מתאימים במבחנה בניסויי vivo ללמוד ביולוגיה האנדותל.
הערות המפתח מן הפרוטוקול הנוכחי
ישנן חמש נקודות קריטיות בתהליך. ראשית, לומן וסקולרית סמוק מרוב הפרין המכיל PBS למזער הפעלת תא האנדותל היווצרות קריש דם. שנית, הזמן בין דום לב ואת הזריעה של קטע אב עורקים על מטריקס הוא קריטי כדאיות האנדותל. תוך שהוא מותיר את רקמת השומן פרי-עורקים ורקמות החיבור, למנוע מתיחת האאורטה ולהגביל את משך הזמן על שלב זה עד 10 - 15 דקות. שלישית, לשפוךרק תקשורת מספיק כדי לכסות את הפלחים אחרי שהם זורעים. מדי בתקשורת הרבה תגרום מגזרי אב העורקים לצוף. הרביעית, התרבות הבינונית מכיל ריכוז גבוה של תוספת צמיחת תא האנדותל, מה שהופך לתאי אנדותל לגדול הרבה יותר מהר מאשר כאשר בתרבית בינונית-2 צמיחה האנדותל. התולדה של תאי אנדותל תמנע את סוגי תאים אחרים כגון תאי פיברובלסטים שריר חלק. חמישית, את העיתוי כדי להסיר קטע אב עורקים מן מטריקס הוא גם חיוני לקיומו הטוהר תאי האנדותל. פעולה זו מונעת זיהום על ידי פיברובלסטים ותאי שריר חלק. המגזר יש להסירו לפני התפתחות רשת הצינור. הסרה מושהה של קטע אב עורקים תגרום לזיהום של סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים או תאי שריר חלק. יש לציין כי גישה זו משמשת גם ללמוד אנגיוגנזה במבחנת ההיווצרות של נימים כמו מבנים מצביע על יכולת אנגיוגנזה של מגזר אב העורקים. בהתבסס על הדואר שלנוxperience, אם מגזרים יוסרו לאחר מבנה דמוי נימי מפתחת באופן מלא, את השכיחות של עליות זיהום תאי שריר חלק דרמטי. לכן, אנו חשים כי נקודת הזמן הטובה ביותר כדי להסיר את הפלח הוא כאשר הרשת מתחילה להיות גלוי אך אינו מפותחת. בדרך זו, אנו מסוגלים לקצור כמה שיותר תאי אנדותל ככל האפשר תוך שמירת זיהום על ידי לתאי שריר חלק עד למינימום.
המגבלות של הפרוטוקול הנוכחי
ישנן מספר מגבלות של השיטות שתוארו. ראשית, יש סיכוי של זיהום של פיברובלסטים ותאי שריר חלק, אם מגזרי אב העורקים אינם מוסרים לפני רשתות צינור לפתח. הפיברובלסטים או תאי שריר חלק עשויים להתחיל לצרף המטריצה מתרבים 3 עד 5 ימים לאחר הזריעה. לכן, תמיד להסיר את פלחי אבי העורקים מבעוד מועד. כאמצעי זהירות משנית, שינוי המדיום 2 שעות לאחר מחדש -plating התאים על גבי בקבוק חדש מסייע גם לחסל את הזיהום האפשרי של פיברובלסטים ותאי שריר חלק. שנית, תאים אלה הם מתורבתים במבחנה במשך 7 - 10 ימים לאחר בידוד. יתכן כי פנוטיפים שלהם עשויים להיות שונים מתאי אנדותל הטריים מבודדים. לדוגמא, אם תאי אנדותל ממודל עכבר של היפרליפידמיה מתורבתים במדיום גידול תא האנדותל ללא ריכוז גבוה של שומנים, הם אינם חשופים לסביבת hyperlipidemic כפי שהיו בחיות. תאי אנדותל בתרבית עשויים להתנהג באופן שונה מתאי אנדותל מבודדים טרי 8. בעיה זו קיימת בכל במבחנת התאים הראשוניים בתרבית שורות תאים. הוספת הגירויים פתולוגי לתוך מדיום התרבות לחקות את הסביבה vivo יכולה להיות פתרון.
לתאי אנדותל להפגין פנוטיפים שונים בענפי כלי דם שונים
e_content "> מערכת כלי הדם היא מבנה היררכי מורכב עורקים, ורידים, נימים. ההטרוגניות של תאי אנדותל שוכני 'האזורים' של כלי דם הספציפיים ממלאת תפקיד מרכזי ביצירת מגוון פונקציונלי 9,10 מערכת כלי הדם. אפילו מיטה כלי הדם יחיד, כגון אבי העורקים, ההטרוגניות האנדותל קיים. זרימת הדם למינרית עם הלחץ גזירה גבוהה בחלק הישר של אבי העורקים גורמת synthase תחמוצת החנקן אנדותל thrombomodulin 11. לכן, תאי אנדותל שנמצא לשביל הישר של האאורטה להפגין קרישה אנטי מודבקות אנטי, ונוגדות דלקתיות 12,13. לעומת זאת, זרימת הדם סוער לאזורים סניף העורקים או לפנייה חדה (קשת אבי העורקים) מפחית ביטוי synthase תחמוצת החנקן אנדותל ומשרה גנים atherogenic ב האנדותל תאים, כלומר, חלבון-1 chemotactic מונוציטים (MCP-1), ואת גורמי גדילה הנגזרות טסיות (PDGFs), וכתוצאה מכך פנוטיפ האנדותל פרו-דלקתי הטרשת העורק 6. בנוסף, תאי אנדותל של הכלי של כל איבר עוברים שינויים אדפטיבית אנטומיים ותפקודיים ומתאימים הפונקציות של האיבר 14,15. עם זאת, קיימת הסכמה כי סמני משטח מספר תא, גנים פעילים ופעילות תא יכולים לשמש כדי לאפיין שושלת תא האנדותל. סמנים פני התא אלה כוללים מולקולות הידבקות התא טסיות האנדותל (PCAM-1, CD31), גורם פון Willebrand (vWF), כלי דם האנדותל-cadherin (VE-cadherin, CD144). הגנים פונקציונלי השכיח ביותר כוללים synthase תחמוצת החנקן אנדותל (eNOS) ו הקולטן לגורם הצמיחה דם האנדותל (VEGFR). פעילות התא שבדרך כלל נראות שושלת תא האנדותל כוללת ספיגה של דיל-ad-LDL ומחייבים לקטינים, המהווה מבנים דמויי חוט שנכנס לטבלה.יישומי משמעויותיה עתיד של פריתאים בתרבית mary עכבר אבי העורקים האנדותל
השיטה המתוארת כאן משמש ללמוד תאי אנדותל macrovascular. המשמעות של פרוטוקול זה היא בכך שהוא מספק הזדמנות מצוינת ללמוד את הפעילויות ספציפיות-אנדותל של מולקולות ממוקדות ויכול להיעשות בנוקאאוט ומודלי עכבר מהונדסים, מה שהופך אותו מאוד שימושי במחקר לב וכלי דם. היכולת לגדול מספרים גבוהים של תאי אנדותל אב עורקי עכבר בתנאים מוגדרים עושה את טכניקת האידאל הזה כדי להגדיר טוב יותר את פנוטיפים ופונקציות של האנדותל. טכניקה זו משפרת את המעשיות של בדיקת הפוטנציאל הפוטנציאלי של טיפול מבוסס תאים אנדותל במודלי Murine, בין אם באמצעות הזרקה תוך ורידית או engraftment של תאי אנדותל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
