Introduction
血管内皮細胞だけでなく、血液と組織を分離するバリア層であり、それを400正方形のメートル1の表面積全体血管樹上に伸びる広大な内分泌腺と考えられています。内皮の幸福は、血管の恒常性に不可欠です。機能不全の内皮は、アテローム性動脈硬化症、血管炎および虚血/再灌流傷害など 2-4を含む様々な心血管障害、に参加しています。現在までに、これらの疾患の設定に関与する特定の細胞および分子メカニズムはよく起因する内皮の拡散解剖学的性質のために理解されていません。
遺伝子操作技術は、より多くの任意の他の哺乳動物種に比べてマウスで開発されているので、マウスは、研究のための重要なモデルです。大動脈の小さなサイズがenzymatを作るためしかし、初代マウス大動脈内皮細胞の単離は、特に困難であると考えられています非現実的内皮のIC消化。いくつかは、電気部品を分離し、精製するための手順は5-7を必要と報告しました。
このプロトコルの目的は、特別な装置を使用せずに、マウスの大動脈から内皮細胞を分離し、展開する簡単な方法を使用することです。このプロトコルでは、新たに単離された大動脈は、小さなセグメントに切断され、内皮発芽を可能にするために下向きに内皮とマトリックス上に播種しました。セグメントが除去された後、内皮細胞は内皮好ま培地中で増殖し、二、三継代後の実験のために準備されています。記載された方法の利点は、その：1）単一の大動脈から収穫された内皮細胞のかなり高い数字。 2）細胞生存率がよく保存されています。 3）特別な装置や技術が必要とされません。これは、内皮細胞の病態生理学における特定の細胞および分子機構を同定する効果的な手段を提供します。広報の研究に興味がある人のためにimaryいずれかの遺伝子ノックアウトマウスから培養された内皮細胞は、遺伝子ノックインマウス、またはマウス疾患モデル、このプロトコルは、非常に有用と練習するのは簡単です。
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Protocol
マウスからの大動脈の1の単離
ここで説明するすべての手順は、ウェイン州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
- 麻酔器の誘導チャンバ内にマウスを置きます。 25％新鮮な空気と75％のO 2と併せて4％イソフルランの流れを設定します。イソフルランの吸入によりマウスを麻酔専用のノーズコーンに続く誘導室を経由して 25％の新鮮な空気と75％O 2と連動して（誘導のために4％、保守のための±1.0％）。注：イソフルランで麻酔、75％酸素/ 25％空気中、または100％の酸素中で送達することができます。
- 麻酔の適切なレベルが（つま先のピンチに撤退の欠如）に到達するまで、マウスを5分ごとに確認してください。
- 誘導室の外にマウスを取り、麻酔装置に接続されている専用のノーズコーンもののイソフルラン吸入を続けます。スイッチイソフルランは、麻酔を維持するために1％へと流れます。
- それは麻酔下であるが、その裏に位置し、手術パッド上にマウスを置きます。手足を確保するために実験室でのテープを使用してください。
- マウスを暖かく保つために加熱ランプを使用してください。マウスはしません過熱ようにマウスから適切な距離にランプを保管してください。
- 70％エタノールで胸をスプレーします。
- 正中線から腹部を開き、腹部大動脈を露出するために解剖ハサミを使用してください。胸腔を開き、心臓や肺を公開します。
- 血液を解放するために解剖ハサミで中央に腹部大動脈をカットします。
- ヘパリン1,000 U / mLを含む1mlのPBS（25 G針を有する）1 mLシリンジを埋めます。左心室へのヘパリンの千U / mLを含むPBSを注入し、大動脈を灌流。胸部大動脈を露出するために、マウスの右サイドに大きな動脈でピンセットで心臓や肺を押してください。
- 迅速マイクロジを使用して胸部大動脈を削除ssection鉗子や氷冷1×PBS（滅菌）に入れては、その後、層流フード内にコンテナを輸送します。
- 大動脈の一端に25 G針を取り付けた1mLの注射器を挿入し、静かに血液を除去するために、氷冷PBSで大動脈をフラッシュします。
- できるだけ添付脂肪組織の多くと小さな横方向の血管を除去するためのマイクロ解剖鉗子を使用してください。
- すぐに成長培地を内皮細胞に大動脈を転送します。
- 滅菌メスの刃を使用して、1ミリメートルのリングに大動脈をカット。収穫は約8 - 大動脈当たり10のリング。
- マイクロ解剖ハサミを使用して、各大動脈輪を開きます。
2.種子マトリックス上の大動脈セグメント
- 使用しないで、凝固を防止するために-20°Cで成長因子減少行列を維持します。完全な融解を可能にするために、少なくとも一晩4°Cで成長因子減少行列を置きます。
- 少なくとも-20℃に6ウェルプレートおよびピペットチップを予冷10分。気泡を導入することなく、マトリックスの1ミリリットルと氷とプレートのコート1つのウェルに6ウェルプレートを置きます。マトリックスが固化することを可能にするために20分間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
- 滅菌マイクロ解剖ピンセットを用いて固化したマトリックス上に大動脈片を移植します。内皮を触れることなく、マトリックス上のピースルーメン側を下にして置きます。マトリックス上に互いに近接4大動脈セグメント - 3を配置します。
- （〜200μL）濡れたセグメントを維持するだけの十分な内皮細胞増殖培地を追加します。
- 4〜6時間、5％CO 2下、37℃でプレートをインキュベートします。一日の終わりには、大動脈のセグメントをカバーするだけの十分なメディアを追加します。
- 位相差顕微鏡下で定期的に発芽大動脈セグメントを観察します。毎日中レベルと細胞の成長を確認してください。覆われた大動脈セグメントを維持するために必要に応じてメディアを追加します。
- 4 日目に、培地に穏やかに除去し、大動脈セグメントFを削除成長している内皮細胞を中断することなく滅菌針を使用して行列をROM。
- 新しい内皮細胞増殖培地2mlを加え、内皮細胞が2のためのマトリックスで増殖し続ける可能 - 3日。
マウス大動脈内皮細胞の3初期継代
- コートゼラチン（0.1％）を有する新しいT12.5フラスコを、37℃で30分間インキュベートします。
- 滅菌37℃PBSで慎重にマトリックスプレートを洗ってください。
- マトリックスプレートに、中性プロテアーゼ（50 U / mL）を2 mLを加え、時々振とうしながら、プラットフォームロッカー上で室温でインキュベートします。細胞の大部分が分離されていることを確認するために位相差顕微鏡で細胞を確認してください。
- ニュートラルプロテイナーゼを不活性化するためにD-ヴァルの2 mLを加え。
- 15 mL遠心管に慎重に上清を収集します。 2 mLのD-ヴァルでプレートを洗浄し、上清を集めます。
- ROOで5分間、900×gで細胞懸濁液を遠心メートル温度。
- ゼラチンでコーティングされたT12.5フラスコ中の内皮細胞増殖培地およびプレート4mLに細胞ペレットを再懸濁します。 2時間、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- 培地を交換してください。 90％コンフルエント-それらが85％になるまで37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
マウス大動脈内皮細胞の4継代
- コート二つの新しいT12.5フラスコは、ゼラチン（0.1％）で、37℃で30分間インキュベートします。約15分間37℃で予熱トリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、PBS中の0.02 EDTA）および滅菌PBS。
- 滅菌37℃PBSで慎重に細胞を洗浄。
- トリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、PBS中0.02 EDTA）の0.5 mLを加えそして〜1分間、または細胞の大部分がラウンドを回すまで37℃でインキュベートします。
- 消化を停止し、内皮細胞増殖培地2mlを加えます。フラスコ内を上下に数回の細胞懸濁液をピペットで。必要であれば、細胞を使用細胞を収集するためにスクレーパー。
- 15mLの遠心管中の細胞懸濁液を収集します。室温で5分間、900×gで細胞懸濁液を遠心。
- ゼラチンでコーティングされた2 T12.5フラスコ中で内皮細胞増殖培地およびプレート4mLに細胞ペレットを再懸濁します。 2時間、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- 培地を交換してください。 90％コンフルエント-それらが85％になるまで37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- 3継代 - 2の後にマウス大動脈内皮細胞を使用してください。
マウス大動脈内皮細胞の5キャラクタリゼーション
- 再プレート細胞。
- ゼラチン（0.1％）でコート6ウェルプレートを、37℃で30分間インキュベートします。 PBSでプレートを洗浄します。
- 約15分間37℃でトリプシン-EDTA、滅菌PBSを予熱。
- 滅菌PBSで3回細胞を洗浄。細胞にトリプシン/ EDTAの0.5 mLを加え、37°C Oで〜1分間インキュベートR細胞の大部分がラウンドを回すまで。
- 消化を停止し、内皮細胞増殖培地2mlを加えます。フラスコ内を上下に数回の細胞懸濁液をピペットで。必要に応じて、細胞を収集するために、セルスクレーパーを使用しています。
- 15mLの遠心管中の細胞懸濁液を収集します。室温で5分間、900×gで細胞懸濁液を遠心。
- 上清を捨て、内皮細胞増殖培地中で細胞を再懸濁します。 3×10 5 /ウェルの密度で、ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートに細胞を播種します。
- 細胞が培養表面に付着できるようにするために、37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートします。
- DIL-AC-LDLが結合-lectin取り込まとULEX。
- -20℃で、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 'を格納する3'- tetramethylindo-カルボ過塩素酸標識アセチル化LDL（ディル-AC-LDL）。染色前に、氷上でのDil-AC-LDLを解凍。株式のDil-AC-LDLのソリューンを1mg / mLです。 4℃でFITC標識ハリエニシダ凝集素（ULEX -Lectin、を1μg/ ml）を保管してください。ストックULEX -Lectin溶液を1mg / mLです。 4℃で保存ヘキスト33342。ストックヘキスト33342ソリューションは、100μg/ mLのです。
- 10μg/ mLの最終濃度を作るために、培養培地の1 mLにディル-AC-LDLストック溶液10μLを追加します。
- 染色の前に、古い培地を除去し、新しい培地を各ウェルに細胞を洗浄します。
- 新しいメディアを取り外し、ディル-AC-LDL染色媒体を追加します。
- 1時間、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。
- 細胞を固定するために10％ホルマリンの1 mLを加え。約30分間室温でプレートを置きます。
- 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。光を避けてください。
- ULEX -Lectinの10μLを含んで1 mLの滅菌1×PBSを追加します。
- 部屋のtemperatuで細胞をインキュベート1時間、暗所で再び。
- 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄することによりULEX-レクチンを削除します。
- 暗闇の中で10分間インキュベート、最終濃度1μg/ mLにヘキスト33342を追加します。
- 倒立蛍光顕微鏡でのDil-AC-LDL（赤、576 nmでの励起波長）、ULEX -Lectin（緑、519 nmでの励起波長）とヘキスト（361ナノメートルの青、励起波長）の蛍光を表示します。
- CD31、VEGFR2、eNOSのための蛍光染色は、VEカドヘリンとカルポニンを。
- 店舗FITC結合抗マウスCD31抗体、eNOSの抗体は、VEカドヘリンの4℃での抗体、FITC結合抗ウサギIgGを暗所。 -20°Cで保管してVEGFR2抗体。
- 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。
- 細胞を固定するために10％ホルマリンの1 mLを加え。約30分間室温でプレートを置きます。
- 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。
- CD31を染色するために、1 mLの滅菌1Xのを追加します。CD31-FITC抗体の10μLを含んでいるPBS。 VEGFR2、eNOSの、VEカドヘリンまたはカルポニンを、VEGFR2の4μLを含有する滅菌1×PBSの1 mLを加え、eNOSのいずれかを染色するには、それぞれ、またはカルポニン一次抗体カドヘリンをVE。
- 暗所で1時間、氷上で細胞をインキュベートします。
- 滅菌PBSで3回細胞を洗浄することにより抗体を除去します。
- VEGFR2の染色のために、eNOSのは、VEカドヘリンまたはカルポニン、FITC結合抗ウサギIgGの10μLを含む滅菌1×PBSの1 mLを加え。暗所で1時間、氷上で細胞をインキュベートします。滅菌PBSで3回細胞を洗浄することによりIgGのを削除します。
- 暗闇の中で10分間インキュベート、最終濃度1μg/ mLにヘキスト33342を追加します。
- 倒立蛍光顕微鏡を用いてCD31、VEGFR2の蛍光を見る、eNOSの、VEカドヘリンを、カルポニン（緑、518から535 nmでの励起波長）とヘキスト（青、361 nmでの励起波長）。
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Representative Results
内皮細胞の萌芽
発芽自発的内皮細胞は、マウスの大動脈セグメントから開始しました。マウスの大動脈セグメントは4日間、内皮細胞増殖培地中で成長因子減少マトリックス上で増殖させました。 4日間 - 内皮細胞の発芽は通常2に表示されます。顕微鏡写真は、4日目（ 図1）に採取しました。写真に示すように、多数の内皮細胞は、セグメントから離れて移動します。新たに形成されたもやしは、セグメントと枝から延長し続けています。
内皮細胞表現型
これらの細胞は最初の継代（ 図2A）後の紡錘形と石畳のような外観を実証しました。付着した細胞を1時間にDil-AC-LDLとULEX -Lectinで標識しました。 図2B〜図2Eに示されるように、細胞の大部分は、ディル-AC-LDLのための二重陽性でした取り込み（赤）とULEX -Lectin結合（緑）。一方、第2継代の後、細胞の95％以上は、血小板内皮細胞接着分子1（CD31、PECAM-1、 図2F）について陽性であった、VEGFR2（ 図2G）は 、VEカドヘリン（ 図2H）、eNOSのを（平滑筋細胞のマーカーである図2I）が、カルポニン（ 図2Jについて陰性）。
図1.内皮細胞の萌芽。マウスの大動脈セグメントは、成長因子減少マトリックス上に播種し、内皮細胞増殖培地で培養しました。発芽の内皮細胞は、早くも2日目（= 100μmのA、バー）上のように開始され、以下の2に増加- 3日間（= 100μmのB、C、バー）。セグメントは4日目（D、バー= 500μm）で除去しました。
図2. 内皮細胞の表現型 。付着した細胞は紡錘状や石畳のような外観を表示します （A、バー= 100μm）で、ディル-AC-LDLとULEX -Lectin（BE、バー= 100μm）との二重陽性蛍光。一方、血小板内皮細胞接着分子1（CD31、PECAM-1）、VEGFR2は、VEカドヘリンは、eNOSの細胞の大部分が陰性であった第2通路（=100μmのFI、バー）後、細胞の> 95％において陽性でした平滑筋細胞のマーカーであるカルポニン染色、（J、バー= 100μm）のため。
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Discussion
この研究は、特別な装置なしで、マウスの大動脈から内皮細胞を分離し、培養するための簡単な方法を示しています。免疫蛍光染色は、細胞の大部分が第2の通路後の内皮細胞であったことを示しました。第3通路への第2の細胞は、in vitroのに適しており、in vivo実験における内皮生物学を研究することが示唆されています。
この議定書からのキーノート
手順の5つの重要なポイントがあります。まず、血管の内腔は、内皮細胞の活性化および血栓形成を最小限にするためにPBSを含むヘパリンでフラッシングされます。第二に、心停止およびマトリックスへの大動脈セグメントの播種の間の時間は、内皮細胞の生存率に重要です。周囲動脈脂肪組織および結合組織をクリアしながら、大動脈を伸ばし回避し、10にこのステップに費やされた時間制限 - 15分。第三に、注ぎますそれらが播種された後のセグメントをカバーするだけの十分なメディア。あまりにも多くのメディアは、大動脈セグメントが浮くことになります。第四に、培養培地は、内皮細胞が培養される場合、内皮増殖培地-2に比べてはるかに速く成長しながら、内皮細胞成長サプリメントを高濃度に含んでいます。内皮細胞の増殖は、平滑筋細胞および線維芽細胞のような他の細胞型を抑制する。第五に、マトリックスから大動脈セグメントを削除するタイミングは、内皮細胞の純度に重要です。このステップでは、線維芽細胞および平滑筋細胞による汚染を防止します。セグメントは、管網の整備の前に除去する必要があります。大動脈セグメントの遅延除去は、線維芽細胞や平滑筋細胞などの他の細胞型の汚染をもたらします。このアプローチは、インビトロでの血管形成を研究するためにも使用されることに注意や構造など毛細血管の形成が大動脈セグメントの血管新生能力を示してください。私たちの電子に基づきますエクスペリエンス、毛細管様構造が完全に劇的、平滑筋細胞の汚染が増加する発生率を開発した後、セグメントが削除された場合。したがって、我々はネットワークが表示されるように起動しますが、完全に開発されていない場合にセグメントを削除するための最良の時間点があると感じています。このようにして、我々は最小限に平滑筋細胞による汚染を維持しながら、できるだけ多くの内皮細胞を採取することができます。
現在のプロトコルの制限
記載された方法のいくつかの制限があります。チューブネットワークが発達する前に大動脈のセグメントが削除されていない場合は、最初、線維芽細胞および平滑筋細胞の汚染の可能性があります。線維芽細胞または平滑筋細胞がマトリックスに付着し、播種後3~5日増殖し始めることができます。そのため、常にタイムリーに大動脈セグメントを削除します。二次予防措置として、2時間の再後に培地を交換します新しいフラスコに細胞を-platingはまた、線維芽細胞や平滑筋細胞の汚染の可能性を排除することができます。単離後10日-第二に、これらの細胞は7 インビトロで培養されます。それらの表現型は、新たに単離した内皮細胞でも異なっていてもよい可能性があります。高脂血症のマウスモデルからの内皮細胞が脂質を高濃度なしに内皮細胞増殖培地で培養される場合、それらは動物であったように、例えば、それらは高脂血症環境に露出されません。培養内皮細胞は新たに単離した内皮細胞8は異なる動作をする場合があります。この問題は、すべてのインビトロ培養初代細胞および細胞株に存在します。 インビボ環境を模倣するために培養培地中に病理学的な刺激を加えると、溶液であってもよいです。
内皮細胞は、さまざまな血管の枝で異なる表現型のデモンストレーションを実施します
e_contentは">血管系は、動脈、静脈、および毛細血管から成る階層構造である。血管系の具体的な「ゾーン」に存在する内皮細胞の不均一性は、血管系9,10における機能的多様性を作成する際に大きな役割を果たしています。 1つでも血管床において、例えば大動脈などの血管内皮異質性が存在する。大動脈の直線部における高いせん断応力で層状の血流がの直線部分に存在する内皮一酸化窒素合成酵素及びトロンボモジュリン11。ため、内皮細胞を誘導し大動脈は、対照的に動脈の分岐領域における乱血流を、抗凝固剤、抗接着剤、及び抗炎症特性12,13を示すか、鋭くオン（大動脈弓）は、内皮一酸化窒素合成酵素の発現を減少させ、内皮細胞におけるアテローム遺伝子を誘導します細胞、 すなわち 、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、および血小板由来成長因子（PDGF）、炎症誘発性およびアテローム性動脈硬化症、内皮表現型6が得られます。また、各臓器の血管中の内皮細胞は、その器官の機能14,15に固有のもので解剖学的および機能的な適応変化を受けます。それにもかかわらず、いくつかの細胞表面マーカー、機能遺伝子及び細胞活性は、内皮細胞系統を特徴づけるために使用することができることを合意があります。これらの細胞表面マーカーは、血小板内皮細胞接着分子（PCAM-1、CD31）、フォンウィルブランド因子（vWF）、血管内皮カドヘリン（VEカドヘリン、CD144）が挙げられます。最も頻繁に使用される機能的な遺伝子は、内皮一酸化窒素合成酵素（eNOS）および血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）が挙げられます。通常、内皮細胞系譜に見られる細胞の活動がディル-広告-LDLの取り込み及びマトリックス上に索状構造を形成して結合レクチンが含まれます。ぷりの意義と今後の応用メアリー培養したマウス大動脈内皮細胞
ここで説明する方法は、大血管内皮細胞を研究するために使用されます。このプロトコルの重要性は、それが標的分子の内皮特異的な活動を研究する絶好の機会を提供し、心血管系の研究で、それは非常に有用なもの、ノックアウトおよびトランスジェニックマウスモデルにおいて行うことができることです。定義された条件の下でマウス大動脈内皮細胞の高い数を増殖する能力は、この理想的な技術は、より良い内皮の表現型と機能を定義することができます。この技術は、静脈内注射または内皮細胞の生着いずれかを介して、マウスモデルにおいて内皮細胞に基づく治療の将来の可能性をテストするための実用性を向上させます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
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