Introduction
Det vaskulära endotelet inte bara är ett barriärskikt som separerar blod och vävnad, anses det vara en stor endokrin körtel som sträcker sig över hela det vaskulära trädet med en ytarea av 400 kvadratmeter 1. Den välmående endotelet är avgörande för vaskulär homeostas. Den dysfunktionella endotel deltar i olika kardiovaskulära sjukdomar, inklusive åderförkalkning, vaskulit och ischemi / reperfusionsskador, etc. 2-4. Hittills har de specifika cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i dessa sjukdomar inte förstått på grund av den diffusa anatomiska natur endotel.
Musen är en viktig modell för forskning eftersom genetiska manipulationstekniker är mera utvecklade i möss än i någon annan däggdjursart. Emellertid är isoleringen av primära murina aortaendotelceller anses särskilt svårt eftersom den lilla storleken av aortan gör enzymatic digerering av endotel opraktisk. Några rapporterade förfaranden för att isolera och rena EC kräver 5-7.
Målet med detta protokoll är att använda en enkel metod för att isolera och expandera endotelceller från mus aorta utan att använda någon speciell utrustning. I detta protokoll är nyligen isolerade aorta skärs i små segment och såddes på en matris med endotel nedåt för att möjliggöra endotel groning. Efter segment tas bort, är endotelceller expanderas i endotel gynnade medium och är redo för experiment efter två eller tre passager. Fördelarna med den beskrivna metoden är att: 1) avsevärt stort antal endotelceller skördas från en enda aorta; 2) cellviabiliteten är välbevarad; och 3) Det behövs ingen speciell utrustning eller teknik. Det ger ett effektivt sätt att identifiera specifika cellulära och molekylära mekanismer i endotelceller patofysiologi. För dem som är intresserade av att studera primary odlade endotelceller från antingen gen knock-out-möss, knock-i möss, eller en mus sjukdomsmodell, är genen detta protokoll mycket användbar och lätt att träna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av Aorta från möss
Alla de förfaranden som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Wayne State University.
- Placera musen i induktionskammaren av anestesiapparaten. Ställ in isofluran flödet till 4% i samband med 25% frisk luft och 75% O2. Söva musen genom inandning av isofluran (4% för induktion, ± 1,0% för underhåll) i samband med 25% frisk luft och 75% O 2 via induktionskammare, följt av en dedikerad noskon. OBS: Anesthesia med isofluran kan levereras i 75% syre / 25% luft eller i 100% syre.
- Kontrollera musen var 5 min tills en lämplig nivå av anestesi uppnås (brist på tillbakadragande till tå nypa).
- Ta musen ut ur induktionskammare och fortsätta isofluran inandning om den särskilda noskonen som är ansluten till anestesiapparaten. växlaisofluran flöde till 1% för att upprätthålla anestesi.
- När den är under anestesi, placera musen på en läkarmottagning pad, placerad på rygg. Använd laboratorium tejp för att fästa benen.
- Använda en värmelampa för att hålla musen varm. Håll lampan i ett lämpligt avstånd från musen så att musen kommer inte överhettas.
- Spraya bröstet med 70% etanol.
- Använd dissekering sax för att öppna buken från mittlinjen, och exponera bukaorta. Öppna brösthålan och exponera hjärtat och lungorna.
- Skär bukaorta i mitten med dissektion sax för att frigöra blodet.
- Fyll en 1 ml spruta (med 25 G-nål) med 1 ml PBS innehållande 1000 U / ml av heparin. Injicera PBS innehållande 1000 U / ml heparin till den vänstra ventrikeln och BEGJUTA aorta. Driva hjärtat och lungan med pincett på de stora artärerna till den högra sidan av mössen för att exponera bröstaortan.
- Snabbt ta bort bröst aorta med hjälp av mikro-dissection pincett och placera den i iskall 1x PBS (steril), sedan transportera behållaren i ett laminärt luftflöde huva.
- Infoga en 1 ml spruta försedd med 25 G nål i en ände av aorta, och spola försiktigt aortan med iskall PBS för att avlägsna blodet.
- Använd mikro-dissekering pincett för att ta bort så mycket av den bifogade fettvävnad och små sido fartyg som möjligt.
- Överför omedelbart aorta till Endothelial Growth medium.
- Skär aorta i 1 mm ringar med hjälp av en steril skalpell blad. Harvest ca 8-10 ringar per aorta.
- Öppna varje aortaringen med ett par mikro dissektion sax.
2. Seed aorta segment på Matrix
- När den inte används, hålla tillväxtfaktor-reducerad matris i -20 ° C för att förhindra stelning. Sätta den tillväxtfaktor reducerad matris i 4 ° C åtminstone över natten för att möjliggöra en fullständig tining.
- Förkyla en 6-brunnar och pipettspetsar till -20 ° C under åtminstone10 min. Sätta 6-brunnar på is och belägga en brunn i plattan med 1 ml matris utan att introducera några luftbubblor. Placera plattan i en 37 ° C inkubator under 20 min för att tillåta matrisen att stelna.
- Implantera aorta bitar på den stelnade matrisen med sterila mikro dissektion pincett. Placera bitar lumensidan nedåt på matrisen utan att röra endotelet. Placera 3 - 4 aortasegment nära varandra på matrisen.
- Lägg bara tillräckligt endotelceller tillväxtmedium för att hålla segment våt (~ 200 mikroliter).
- Inkubera plattan vid 37 ° C under 5% CO2 under 4 till 6 timmar. Vid slutet av dagen, tillsätt bara tillräckligt medium för att täcka de aortasegmenten.
- Observera aortasegmentet groning med jämna mellanrum under ett faskontrastmikroskop. Kontrollera medelhög nivå och celltillväxt varje dag. Lägg medium om nödvändigt för att hålla aortasegment som omfattas.
- Den 4: e dagen, försiktigt bort mediet och avlägsna aortasegmenten from matrisen med en steril nål utan att avbryta de växande endotelceller.
- Tillsätt 2 ml av ny endotelial celltillväxtmedium och tillåta endotelcellerna fortsätter att proliferera på matrisen under 2 - 3 dagar.
3. Första Aging av mus aortaendotelceller
- Belägga en ny T12.5 kolv med gelatin (0,1%), inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Tvätta matrisplattorna försiktigt med steril 37 ° C PBS.
- Tillsätt 2 ml av neutralt proteinas (50 U / ml) för att de matrisplattorna och inkubera vid rumstemperatur på plattform rocker med skakning då och då. Kontrollera cellerna under ett faskontrastmikroskop för att säkerställa att majoriteten av cellerna är fristående.
- Tillsätt 2 ml av D-Val för att inaktivera den neutrala proteinas.
- Samla in supernatanten noggrant i ett 15 ml centrifugrör. Tvätta plattan med 2 ml D-Val och samla supernatanten.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 900 xg under 5 min vid room temperatur.
- Återsuspendera cellpelleten i 4 ml endotelial celltillväxtmedium och plattan i T12.5 kolv belagda med gelatin. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 2 h.
- Ersätta mediet. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 tills de är 85% - 90% sammanflytande.
4. Passaging av mus aortaendotelceller
- Coat två nya T12.5 kolvar med gelatin (0,1%), inkubera vid 37 ° C under 30 min. Förvärmningsblockaggregatet Trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,02 EDTA i PBS) och steril PBS vid 37 ° C under ca 15 min.
- Tvätta cellerna försiktigt med steril 37 ° C PBS.
- Tillsätt 0,5 ml Trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 0,02 EDTA i PBS) och inkubera vid 37 ° C under ~ 1 min eller tills majoriteten av cellerna vända sig om.
- Tillsätt 2 ml av endotelcelltillväxt medium för att stoppa digerering. Pipett cellsuspensionen upp och ner inom kolv flera gånger. Om det behövs, använd en cellskrapa för att samla upp cellerna.
- Samla cellsuspensionen i ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera cellsuspensionen vid 900 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Återsuspendera cellpelleten i 4 ml endotelial celltillväxtmedium och plattan i 2 T12.5-kolvar belagda med gelatin. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 2 h.
- Ersätta mediet. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 tills de är 85% - 90% sammanflytande.
- Använd musen aortaendotelceller efter 2 - 3 passager.
5. Karakterisering av mus aortaendotelceller
- Re-platta cellerna.
- Belägga en 6-brunnsplatta med gelatin (0,1%), inkubera vid 37 ° C under 30 min. Skölj plattan med PBS.
- Förvärm Trypsin-EDTA och steril PBS till 37 ° C under ca 15 min.
- Tvätta cellerna med sterila PBS 3 gånger. Tillsätt 0,5 ml Trypsin / EDTA till cellerna, inkubera i ~ 1 min vid 37 ° C or tills majoriteten av cellerna vända sig om.
- Tillsätt 2 ml av endotelcelltillväxt medium för att stoppa digerering. Pipett cellsuspensionen upp och ner inom kolv flera gånger. Om det behövs, använd en cell skrapa för att samla upp cellerna.
- Samla cellsuspensionen i ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera cellsuspensionen vid 900 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten, återsuspendera cellerna i endotelcell-tillväxtmedium. Ympa cellerna i 6-brunnsplatta belagda med gelatin vid en densitet av 3 x 10 5 / brunn.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO2 för att göra det möjligt för cellerna att fästa till odlingsytan.
- Dil-ac-LDL uptaken och Ulex -lectin bindning.
- Lagra 1,1'-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo-karbocyanin perklorat-märkt acetylerat LDL (Dil-ac-LDL) vid -20 ° C. Före färgning, tina Dil-ac-LDL på is. Beståndet Dil-ac-LDL solution är 1 mg / ml. Lagra FITC-märkt Ulex europaeus agglutinin (Ulex -Lectin, 1 | ig / ml) vid 4 ° C. Beståndet Ulex -Lectin lösning är 1 mg / ml. Store Hoechst 33342 vid 4 ° C. Beståndet Hoechst 33342 lösning är 100 mikrogram / ml.
- Tillsätt 10 mikroliter av Dil-ac-LDL stamlösning till 1 ml odlingsmedium för att göra en slutlig koncentration av 10 mikrogram / ml.
- Före färgning, ta bort den gamla mediet och tvätta cellerna i varje brunn med nytt medium.
- Ta det nya mediet och tillsätt Dil-ac-LDL färgning medium.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 1 h.
- Tvätta cellerna med sterila 1x PBS 3 gånger.
- Tillsätt 1 ml 10% formalin för att fixera cellerna. Sätta plattan i rumstemperatur under ca 30 min.
- Tvätta cellerna med sterila 1x PBS 3 gånger. Undvik ljus.
- Tillsätt 1 ml steril 1x PBS som innehåller 10 mikroliter av Ulex -Lectin.
- Inkubera cellerna vid rumstemperatåter i mörker under 1 timme.
- Ta bort Ulex-lektin genom tvättning av cellerna med sterila 1x PBS 3 gånger.
- Lägga Hoechst 33342 till slutkoncentration av 1 mikrogram / ml, inkubera 10 minuter i mörker.
- Visa fluorescens av Dil-Ac-LDL (röd, excitationsvåglängd av 576 nm), Ulex -Lectin (grön, excitationsvåglängd av 519 nm) och Hoechst (blå, excitationsvåglängd av 361 nm) med en inverterad fluorescerande mikroskop.
- Fluorescerande färgning för CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherin och Calponin.
- Store FITC-konjugerad anti-mus CD31-antikropp, eNOS-antikropp, VE-cadherin-antikroppen, FITC-konjugerad anti-kanin-IgG vid 4 ° C i mörker. Store VEGFR2 antikropp i -20 ° C.
- Tvätta cellerna med sterila 1x PBS 3 gånger.
- Tillsätt 1 ml 10% formalin för att fixera cellerna. Sätta plattan i rumstemperatur under ca 30 min.
- Tvätta cellerna med sterila 1x PBS 3 gånger.
- Att färga CD31, tillsätt 1 ml av steril 1xPBS som innehåller 10 mikroliter av CD31-FITC-antikropp. Att färga antingen VEGFR2, eNOS, VE-cadherin eller calponin, tillsätt 1 ml av steril 1x PBS som innehåller 4 mikroliter av VEGFR2, eNOS, VE-cadherin eller calponin primär antikropp, respektive.
- Inkubera cellerna på is under 1 h i mörker.
- Ta bort antikroppar genom tvättning av cellerna med sterila PBS 3 gånger.
- För färgning av VEGFR2, eNOS, VE-cadherin eller calponin, tillsätt 1 ml av steril 1x PBS som innehåller 10 mikroliter av FITC-konjugerad anti-kanin IgG. Inkubera cellerna på is under 1 h i mörker. Ta IgG genom tvättning av cellerna med sterila PBS 3 gånger.
- Lägga Hoechst 33342 till slutkoncentration av 1 mikrogram / ml, inkubera 10 minuter i mörker.
- Visa fluorescens av CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherin, calponin (grön, excitationsvåglängd av 518-535 nm) och Hoechst (blå, excitationsvåglängd av 361 nm) med en inverterad fluorescerande mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endothelial Cell Sprouting
Spontan endotelceller groning startade från en mus aorta segment. Musen aorta segmentet tilläts växa på en tillväxtfaktor-reducerad matris sedan i endotelcell-tillväxtmedium i 4 dagar. Endotelceller groning uppträder vanligen i 2 - 4 dagar. Mikrofotografier togs på dag 4 (Figur 1). Såsom visas i bilderna, talrika endotelceller migrera bort från segmentet. De nybildade groddar fortsätter att sträcka sig från segmentet och grenen.
Endoteliala cellfenotyper
Dessa celler uppvisade spolformad och kullerstensliknande utseenden efter initial passage (Figur 2A). De bifogade celler märktes med Dil-ac-LDL och Ulex -Lectin under en timme. Såsom visas i figurerna 2B-2E, de flesta av cellerna var dubbelpositiva för Dil-ac-LDL upptag (röd) och Ulex -Lectin bindning (grön). Samtidigt, efter den andra passagen, var mer än 95% av cellerna positiva för trombocyter endotel celladhesionsmolekyl 1 (CD31, PECAM-1, figur 2F), VEGFR2 (figur 2G), VE-cadherin (Figur 2H), eNOS ( Figur 2I) men negativa för Calponin (Figur 2J) som är en glatt muskelcellmarkör.
Figur 1. Endothelial Cell Sprouting. Mus aortasegmentet ympades på tillväxtfaktor-reducerad matris och odlades i endotel-celltillväxtmedium. Endotelceller groning började så tidigt som på dag 2 (A, bar = 100 um) och ökade i följande 2 - 3 dagar (B, C, bar = 100 nm). Segmentet avlägsnades på dag 4 (D, bar = 500 | j, m).
Figur 2. endotelceller fenotyper. De bifogade celler visar spolformad och kullerstensliknande utseenden (A, bar = 100 nm), dubbel-positiv fluorescens av Dil-ac-LDL och Ulex -Lectin (BE, bar = 100 nm). Samtidigt trombocyter endotel celladhesionsmolekyl 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadherin, eNOS var positiva i> 95% av cellerna efter den andra passagen (FI, bar = 100 nm) De flesta av cellerna var negativa för Calponin färgning, vilket är en glatt muskelcellmarkör (J, bar = 100 | j, m).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie visar en enkel metod för att isolera och kultur endotelceller från en mus aorta utan någon särskild utrustning. Den immunofluorescensfärgning indikerade att majoriteten av celler var endoteliala celler efter den andra passagen. Det föreslås att celler vid andra till tredje passage är lämpliga för in vitro- och in vivo-experiment för att studera endotelial biologi.
Nyckeln Anteckningar från detta protokoll
Det finns fem kritiska punkter i förfarandet. Först vaskulära lumen spolas med PBS innehållande heparin för att minimera endotelcellaktivering och proppbildning. För det andra, tiden mellan hjärtstillestånd och sådd av aortasegmentet på matrisen är avgörande för endotel lönsamhet. Medan rensa peri-arteriella fettvävnad och bindväv, undvika sträckning aorta och begränsa den tid som spenderas på detta steg till 10 - 15 min. För det tredje, hällbara tillräckligt media för att täcka segmenten när de ympas. Alltför mycket media kommer att orsaka de aortasegmenten att flyta. För det fjärde innehåller odlingsmediet en hög koncentration av endotelcelltillväxt supplement, vilket gör endotelceller växer mycket snabbare än vid odling i endotel tillväxtmedium-2. Utväxt av endotelceller kommer att undertrycka andra celltyper, såsom glatta muskelceller och fibroblaster. Femte, är också avgörande för renheten hos endotelceller tidpunkten för att avlägsna aortasegment från matrisen. Detta steg förhindrar förorening av fibroblaster och glatta muskelceller. Segmentet bör avlägsnas innan utvecklingen av röret nätverket. Fördröjd avlägsnande av aortasegment kommer att resultera i kontaminering av andra celltyper, såsom fibroblaster eller glatta muskelceller. Observera att denna metod också användas för att studera angiogenes in vitro och bildningen av kapillär liknande strukturer indikerar angiogenes kapacitet aorta segmentet. Baserat på vår experience, om segmenten avlägsnas efter kapillären liknande struktur fullständigt utvecklar, incidensen av glatta muskelceller förorenings ökar dramatiskt. Därför anser vi att det bästa tidpunkten för att ta bort segmentet är när nätverket börjar bli synlig, men är inte fullt utvecklad. På detta sätt har vi möjlighet att skörda så många endotelceller som möjligt och samtidigt hålla kontamination av glatta muskelceller till ett minimum.
Begränsningarna i detta protokoll
Det finns vissa begränsningar av de beskrivna metoderna. För det första finns det chanser för kontaminering av fibroblaster och glatta muskelceller, om aorta segment inte tas bort innan röret nätverk utvecklas. De fibroblaster eller glatta muskelceller kan börja att fästa till matrisen och proliferera 3 till 5 dagar efter sådd. Därför alltid bort aortasegmenten i tid. Som en sekundär försiktighetsåtgärd, ändra mediet 2 timmar efter re -plating cellerna på en ny kolv också hjälper till att eliminera den möjliga kontamineringen av fibroblaster och glatta muskelceller. För det andra, dessa celler odlas in vitro under 7 - 10 dagar efter isolering. Det är möjligt att deras fenotyper kan skilja sig från nyligen isolerade endotelceller. Till exempel om endotelcellerna från en musmodell av hyperlipidemi odlas i endotelcell-tillväxtmedium utan en hög koncentration av lipider, är de inte utsatta för det hyperlipidemiska miljön som de var i djur. De odlade endotelceller kan bete sig annorlunda från nyisolerade endotelceller 8. Detta problem förekommer i alla in vitro-odlade primära celler och cellinjer. Tillsats av de patologiska stimuli i odlingsmediet för att efterlikna in vivo-miljön kan vara en lösning.
Endotelceller demonstrera olika Fenotyper i olika Kärl grenar
e_content "> kärlsystemet är en hierarkisk struktur bestående av artärer, vener och kapillärer. heterogenitet endotelceller som finns i de specifika" zoner "i kärl spelar en stor roll i att skapa funktionella mångfalden i kärlsystemet 9,10. även i en enda kärlbädd, såsom aorta, föreligger endotelial heterogenitet. Laminär blodflöde med hög skjuvspänning i den raka delen av aorta inducerar endotelial kväveoxidsyntas och trombomodulin 11. Därför, endotelceller som finns i den raka delen av aorta demonstrera antikoagulant, anti-lim, och antiinflammatoriska egenskaper 12,13. däremot turbulent blodflöde i områden där artärer gren eller sväng skarpt (aortabågen) minskar endotel kväveoxidsyntas uttryck och inducerar aterogena gener i endotelceller celler, dvs., monocyt kemotaktiskt protein-1 (MCP-1), och blodplättshärledda tillväxtfaktorer (PDGF), Vilket resulterar i en pro-inflammatorisk och aterosklerotisk endotel fenotyp 6. Dessutom endotelceller i kärlen i varje organ genomgår anatomiska och funktionella adaptiva förändringar som är specifika för att organ funktioner 14,15. Det finns dock en enighet om att flera cellytmarkörer, funktionella gener och cellaktiviteter kan användas för att karakterisera endotelceller härstamning. Dessa cellytmarkörer inkluderar Platelet endotelial celladhesionsmolekyl (pCAM-1, CD31), von Willebrand-faktor (vWF), Vascular Endothelial-cadherin (VE-cadherin, CD144). De vanligaste funktionella gener inkluderar endotel kväveoxidsyntas (eNOS) och Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR). Cell aktiviteter som vanligtvis ses i endotelceller härstamning innefattar upptag av Dil-ad-LDL och lektin, som bildar strängliknande strukturer på matrisen.Betydelsen och framtida tillämpningar av Primary Cultured Mouse aortaendotelceller
Den här beskrivna metoden används för att studera makrovaskulära endotelceller. Betydelsen av detta protokoll är att det ger en stor möjlighet att studera endotelceller specifika aktiviteter riktade molekyler och kan göras på knockout och transgena musmodeller, vilket gör det mycket användbart i kardiovaskulär forskning. Förmågan att växa stort antal mus aortaendotelceller under definierade förhållanden gör detta ideal teknik för att bättre definiera de fenotyper och funktioner endotel. Denna teknik förbättrar praktiska att testa blivande potential endotel cellbaserad terapi i musmodeller, antingen genom intravenös injektion eller ympning av endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4- or 6-week-old mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Growth factor reduced matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-mouse vascular endothelium-cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-mouse calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG | Sigma | F6005 | |
| 1 mL syringe fitted with 25-G needle | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Peri dishes | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Six-well cell culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 culture flask | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anesthesia machine with isoflurane | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| heating lamp | |||
| Centrifuge machine | |||
| Inverted phase-contrast microscope | |||
| inverted fluorescence microscope |
References
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
