Introduction
Forstå, hvordan celler opnår specifikke egenskaber under udvikling er afgørende for at forstå kompleksiteten af organer og deres potentielle udvikling mod patologiske tilstande. Der er en stor forskning skub til at dechifrere de regulerende netværk gen, der ligger til grund celle specifikation og differentiering ved unrevealing globale genekspressionsprofiler, Pol II bindende status, transskription-faktor belægning på regulatoriske sekvenser eller post-translationelle modifikationer af histoner.
For at vurdere genekspression på globalt plan microarrays og RNA-seq tilgange anvendes. Microarrays gør det muligt at detektere mRNA overflod, mens RNA-seq er bedre gearet til at informere om de forskellige typer af RNA, herunder kodning og ikke-kodende RNA som microRNA, lncRNAs eller snRNAs. Imidlertid kan disse teknikker ikke skelne aktivt transkriberet steady state mRNA, aktivt-translatoriske mRNA og mRNA ind i nedbrydningsprocessen. Måling steady-stspiste mRNA-niveauer er kendt for at være en dårlig estimering af proteom præparat 1-3. I modsætning, identificere aktivt-oversætte mRNA giver et mere præcist billede af proteinproduktion.
Imidlertid har transkriptom studier primært været ført ved hel-organisme-niveau ved at sammenligne gevinst eller tab af funktion af en specifik årsag til tilstand vildtype 4-7 eller på dissekeret væv, hvilket gør genekspressionsprofiler vanskelige at fortolke. Nylige fremskridt i cellemålrettet værktøjer, affinitetsoprensning og følsomhed forbedringer nu muligt at udføre hele genomet analyser på små cellepopulationer eller endda enkelte celler i en levende organisme.
I Drosophila, store samlinger af transgene linjer sætte specifikke tidsmæssige og rumlige målretning af forskellige væv og celle subpopulationer via GAL4 / UAS systemet 8-10 giver mere præcis kvantificering af de molekylære mekanismer, der er nødvendige for celle funktion.
11. Denne metode er baseret på sucrosegradientcentrifugering muliggør udvælgelse af polysom fraktion og bestemmelse af mRNA oversættes hele genomet ved analyse med mikroarrays eller dybe sekventering. Polysom isolation kan kobles med nucleasefordøjelse at identificere ribosomale fodspor svarende til RNA-fragmenter er beskyttet af ribosomerne under oversættelsesprocessen 12. Ribosomal fodaftryk øger nøjagtigheden af kvantificering af RNA translation og RNA-sekvens-niveauet opløsning og ribosom positionering, gør det muligt at måle hastigheden af oversættelsen. Men til dato det har ikke været anvendt til celle-specifikke isolering af translatomes, primært som følge af det kraftige fald i RNA-udbytte opnået ved afslutningen af ribosomet footprinting processen. Eftersom størrelsen udvalg af RNA kan generere potentielt falsk-positives fra forskellige RNP'er, der også kan beskytte RNA på en lignende måde, er der behov for yderligere udvikling for at forbedre ribosomale footprinting og tilpasse den til celle-specifikke tilgange.
En af disse metoder, kaldet Omsætning Ribosome Affinitetsrensning (TRAP) er blevet beskrevet i 2008 af Heiman et al. og anvendes til at isolere translatome fra en delmængde af neuroner i mus. Ved epitop-mærke et ribosomalt protein i en celle-typespecifik måde kan polysomer oprenses selektivt uden besværlige trin til celledissociering og sortering. I dette tilfælde blev de 60S ribosomale protein L10a på overfladen af ribosomet mærket med eGFP 13. Siden 2008 har flere undersøgelser brugt denne metode i forskellige arter, fra mus 14-19 til X. laevis 20,21, 22,23 og zebrafisk Arabidopsis thaliana 24. TRAP fremgangsmåde er også blevet tilpasset til Drosophila modellen og anvendes til purify celletype-specifikke mRNA'er fra neuronale celler 25 og astrocytter 26. Den alsidige binære GAL4 / UAS blev anvendt til at udtrykke GFP-mærkede RpL10A i en vævsspecifik måde. Lederne af voksne fluer blev dissekeret at udføre polysom markering fra neuronale celler (målrettet af pan-neurale Elav-Gal4 driver) og isolerede RNA blev sekventeret. Det store antal up-regulerede gener svarede til dem, der er kendt for at blive udtrykt i nervesystemet, hvilket indikerer, at tilgangen har god specificitet og spørge os til at tilpasse den til sjældne cellepopulationer (mindre end 1% af celler) til stede i udviklingen af Drosophila embryoner .
Inden for Drosophila model, fosterstadiet er en model af valg for studiet af udviklingsprocesser, som de molekylære aktører og morfogenetiske bevægelser evolutionært er bevaret. De eneste vævsspecifikke transkriptomisk metoder hidtil udførte i denne model er blevet udført under anvendelse af celle eller nuklear sårting og har kun været i stand til at studere steady state transkriptom 27-31, hvilket skaber et behov for metoder dedikeret til væv / celler-specifik translatome profilering i fluen embryo. Her rapporterer vi det første TRAP protokollen dedikeret til Drosophila embryoner. Med denne metode, engageret-in-translation-mRNA i en meget begrænset cellepopulation på omkring 100 muskelceller per embryo blev succesfuldt isoleret med høj kvalitet og specificitet. Den binære GAL4 / UAS system bruges til at drive ekspressionen af GFP-mærkede RpL10A i delpopulation af muskler uden toksicitet, ingen synlige fænotyper eller forsinket udvikling, som vist tidligere 25. Drosophila embryoner besidder 30 muskler pr hemisegment, der vil give anledning til muskulaturen af larve. Ved hjælp af en regulatorisk region opdaget i nærheden af daske identitet genet, er 6 af de 30 multi-kerneholdige muskler målrettet. I dette assay er ribosomer immobiliseret på mRNA under anvendelse oversættelsen forlængelseinhibitor cycloheximid. Cytosoliske ekstrakter derefter anvendt til affinitetsoprensning med GFP-antistof-belagte magnetiske kugler. Kvaliteten af oprenset RNA blev valideret ved anvendelse af Bioanalyzer. Kvantitativ revers transskription-PCR (RT-qPCR) blev anvendt til at bestemme specificiteten og følsomheden af mRNA isolation og viste, at vores forbedrede protokollen er yderst effektive.
Protocol
1. Flueliner Generation
- Generere to forskellige konstruktioner. I den første konstruktion, er RpL10A cDNA (ribosomal proteinunderenheden L10a) klonet nedstrøms for GFP i pUASP-PL-GFP-plasmidet Pil (modificeret version fra 32). Anvendelsen af en kimlinje-promotor tillader en mere polyvalent anvendelse af den transgene linje.
BEMÆRK: Få den anden konstruktion ved kloning den regulatoriske sekvens kørsel vævsspecifik ekspression af det daske genet opstrøms for GAL4 (TF) ved hjælp pPTGAL4 plasmid. - Indsprøjtes plasmider separat i w 1118 fluer og indsætte konstruktioner i fluen genomet ved P-element indføring (ifølge standardprocedure) 33.
- Vælg transformanter for at genvinde flueliner med konstruktioner på to forskellige kromosomer. Den endelige TRAP linje er skabt ved at kombinere disse to linjer (genetiske krydser) for at få en dobbelt-transgen stabilt linje. F0: W; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx vægt-; Cyo / SCU, Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Daske Gal4 / TM6B. Massivt forstærke denne linje og indsamle de ønskede-iscenesat embryoner.
2. Embryo Collection
- Forbered 8 store cylindriske befolkningsundersøgelser bure indeholder omkring 40 g af unge fluer pr bur (ca. 180.000 fluer / bur).
- Fortsæt med såkaldte præ-Lays, der tillader fluer at rydde udviklingslandene embryoner fra deres æggeledere. For at lægge fluer til 1 time på to 11 cm diameter petriskåle indeholdende en blanding af størknet agar og druesaft og dækker ⅓ af overfladen med frisk gjort gær pasta. Efter 3 udvekslinger af druesaft plader indsamle de virkelige embryoner om lignende frisklavede plader.
NB: Inkubationstid vil variere ifølge udviklingsmæssige tidsvindue undersøgt. - Fjern pladerne fra bure og lade dem ved samme temperatur i den nødvendige tid til at opnå den korrekte udviklingsstadiet (f.eks 3 timer af æg-lægning + 10 timer af Additional inkubation giver embryoner fra scenen 10-13 timer efter æglægning (AEL)). Resuspender pladen indhold (embryoner, gær pasta, døde fluer) med 50 ml vand med en børste.
- Gå gennem en række sigter (700 um, 355 um, 112 um) til at adskille embryoner fra døde fluer og øvrige kropsdele og indsamle embryoner opbevares om mindre diameter si den, derefter kort vask i demineraliseret vand. Brug ikke mere end 18 plader pr samling, da det kan blokere de sigter.
- Dechorionate embryoner i 4,5% blegemiddel i deioniseret vand i 2 minutter og skyl grundigt med deioniseret vand i 30-60 sek. Inkuber embryoner i PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml cycloheximid, i 5-10 minutter ved stuetemperatur under omrøring.
- Tørre embryoner på cellulose absorberende ark og overføre dem til mikrocentrifugerør. Rørene vejes og flash-fryse embryoner ved nedsænkning i flydende nitrogen. På dette stadium kan de tørrede embryoner opbevares i flere måneder ved -80 ° C.
- Grundigt resuspender protein G magnetiske perler i den originale flaske ved forsigtig omrøring.
- Transfer 90 pi perler på en RNase-fri rør og samle dem på en magnet (30-60 sek). 90 pi perler er nødvendigt at foretage immunpræcipitering (IP) med 1 ml lysat indeholdende 60-80 mg / ml proteiner. Respektere forhold til at forhindre perle mætning. Brug flere rør i henhold til protein beløb.
- Vask perler med 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 pi) og indsamle perler på magneten til at skille supernatant. Der tilsættes 30 ug GFP-antistof i 350 pi PBS 0,01% Tween 20 til perlerne og inkuberes med langsom ende over ende blanding i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Saml perler på magneten (30-60 sek), kasseres supernatanten og skyl i 500 pi polysom ekstraktionsbuffer (10 mM Hepes, 150 mM KCl, MgCl2 5 mM, 0,5 mM DTT, 1% Triton, cycloheximid 100 ug / ml , Protease inhibitor 1 ×, RNase inhibitor 100 U).
- Indsamle perler på magneten, og der tilsættes 500 pi blokeringspuffer (BSA 0,1 pg / pl, gær-tRNA 0,1 pg / pl, glykogen 0,1 pg / pl i polysom ekstraktionsbuffer).
- Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur og gentage dette trin én gang med frisk blokeringsbuffer.
- Saml perler på magneten og skyl i 500 pi polysom ekstraktionsbuffer, så huske perler og gå straks til immunorensning trin (afsnit 6).
4. Lysat Forberedelse
- Før du starter, opsætte programmet på multi-retningsbestemt hurtig hastighed perler kværn: 2 × 10 sek ved 5.000 omdrejninger i minuttet, 15 sek pause. Overfør tørrede embryoner (1,5 g) til 15 ml rør forafkølet på is indeholdende polysom ekstraktionsbuffer, og homogeniseres straks. Homogenisere 1,5 g af embryoner i 4 ml polysom ekstraktionsbuffer.
- Spread homogeniseret embryoner i to forud afkølet 2 ml rør og male den EmbryOS ved at køre homogenisatoren programmet. Overfør lysatet i frisk forafkølet mikrocentrifugerør på is og udarbejde en postnuclear supernatanten ved centrifugering ved 4 ° C i 10 minutter ved 2.000 g.
- Overfør supernatanten til et frisk forafkølet mikrocentrifugerør på is, tilsæt 1/100 prøvevolumen på 10% Nonidet P-40 til supernatanten (slutkoncentration = 0,1%), og bland det forsigtigt ved at vende røret.
- Pulse-centrifuge prøven i en minifuge at opsamle væske på bunden af røret, tilsæt 1/9 prøvevolumen på 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DHPC) (slutkoncentration = 30 mM ), bland det forsigtigt ved at vende røret, og inkuber blandingen på is i 5 min (blanding ved at vende flere gange under inkubationen).
- Forbered post-mitokondriesupernatant ved centrifugering ved 4 ° C i 10 minutter ved 20.000 g. Mål proteinkoncentration ved Bradford-metoden: koncentrationen i lysat skal være mellem 60-80 mg / ml. Take supernatanten til en frisk ny forafkølet mikrocentrifugerør og fortsæt straks til præ-absorption trin (afsnit 5).
5. Pre-absorption
- Grundigt resuspender de magnetiske perler ved forsigtig omrøring og overføre 30 pi perler i et mikrocentrifugerør ved stuetemperatur (30 pi perler / 1 ml embryonale lysat).
- Saml perler på magneten, pipette off supernatanten og resuspender perlerne i polysom ekstraktionsbuffer (500 pi). Saml perler på magneten, tilføje embryonale lysat og inkuberes i 1 time ved 4 ° C på en rotator.
- Fjern perler og holde supernatanten på is for immunoprensning trin. Før immunooprensning, holde 100 pi supernatant (input) til at sammenligne den globale RNA-prøve med RNA-prøven opsamles efter immunooprensning, ved RT-qPCR f.eks.
6. immunorensning
- Der tilsættes 1 ml (svarende til 60-80 mg / ml protein) ipræabsorberet lysat til en RNase-frit rør indeholdende 90 pi blokerede perler koblet til GFP-antistof. Inkuber prøverne ved 4 ° C i 2 timer under forsigtig ende-over-ende blanding i et rør rotator. Alternativt udføre inkubationen O / N ved 4 ° C.
- Efter inkubation indsamle perler på magneten. Brug en minifuge at spinde ned perlerne, derefter resuspenderes dem i 500 pi vaskepuffer (Hepes 10 mM, KCI 350mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cycloheximid 100 ug / ml RNase inhibitor 100 U ) og samle dem på magneten. Gentag dette trin to gange mere.
- Skifte kuglerne til en ny forafkølet RNase-fri rør og vask to gange. Saml perler på en magnet og fortsæt til RNA-ekstraktion ved at tilsætte 1 ml Trizol direkte til perlerne og følg producentens anvisninger.
7. RNA Oprydning og kvalitetsvurdering
- Brug en RNeasy Micro Kit i henhold til fabrikantens anvisninger. Ved afslutningen elute RNA med (x) pi RNase-frit vand. Varm i 2 minutter ved 60 ° C og opbevares snap-frosne prøver ved -80 ° C. Tjek RNA kvalitet ved hjælp Bioanalyzer (følg producentens anvisninger).
- For at teste specificiteten af TRAPed RNA, udføre revers transkription den 3. ng oprenset RNA (input og IP) i overensstemmelse med producentens instruktioner (hævet III). Brug cDNA opnået for qPCR hjælp genspecifikke primersæt.
Representative Results
Drosophila embryonale somatiske muskel system består af 30 muskler pr hemisegment, og hver muskel har et bestemt sæt af egenskaber: kode identitet gener, stilling, antal fusion begivenheder, vedhæftede sites og innervation. Identifikation oversat mRNA i en specifik muskel delmængde vil give oplysninger om proteinerne kræves for at danne disse specifikke muskelgrupper egenskaber. Brug af TRAP-baserede metode, RNA fra en subpopulation af muskler udtrykker identiteten genet daske blev oprenset (figur 1A-B). En stor bekymring ved denne fremgangsmåde er kvaliteten og specificiteten af det isolerede RNA. Den optimerede protokol rapporteret her aktiveret systematisk genopretning af høj kvalitet RNA vurderes Bioanalyzer analyse. De opnåede profil viser nogen nedbrydning af RNA (figur 1c).
I andre undersøgelser, der er udviklet omkring TRAP metode blev spørgsmål rejst over specificiteten af data. Her har vi improve metoden til at undertrykke baggrund i ikke-specifik binding af RNA til perlerne eller rørene og ved optimering af vaskepufferen. For at vurdere baggrundsniveauet og effektiviteten af isolering daske-udtrykkende celler førte vi RT-qPCR forsøg på 3 gentagelser af den samme fosterstadiet. Fold-berigelser af 4 forskellige gener (MEF2, daske, Prospero, soxNeuro) blev beregnet i forhold til input og normaliseret mod RpL32 genet (figur 1D). Disse resultater viste 2,3 gange berigelse af pan-muskulære gen MEF2 og 5,6 gange berigelse af daske genet. I modsætning hertil blev de to gener udtrykt i neurale system, forarmet forhold til input. Meget lignende fold ændre værdier blev observeret på 3 biologiske gentagelser, hvilket viser, at protokollen er robust. Med Slouch-Gal4 driver og startende med 1,5 g, omkring 1,5x10 ^ 6 embryoner blev opnået som indeholder 100 GFP celler / embryo (i alt 150 × 10 ^ 6 positivceller).
Efter at have kørt TRAP forsøg er udbyttet ca. 25-45 ng specifikt RNA afhængigt af fase-af-interesse. Dette materiale er nok til at køre microarray analyse eller RNA-seq anvendelse af en Amplifikationsprotokollen at opbygge en RNA-seq bibliotek. Effektivitet afhænger stærkt af styrken af føreren bruges til at udtrykke RpL10A-EGFP.
Figur 1. Kvalitet og specificitet vurdering af TRAP-isoleret RNA fra Slouch-GAL4> UASRpL10A-EGFP embryoner.
(AB) Konfokale billeder af en scene-16 embryo viser RpL10A-EGFP-ekspression specifikt i de seks daske muskelceller pr hemisegment (A). Co-lokalisering af RpL10A-EGFP med den generelle muskel markering Beta3tubulin observeres sammenfletning billede (B). (C) Kvalitetskontrol af TRAPed RNA ran på Bioanalyzer viser perfekt integritet rRNA 18S og 28S. (D) RT-qPCR analyse, som viser høj specificitet af TRAP-isolerede mRNA eksperimenter på 3 biologiske gentagelser af Stage-16 embryoner. Fold ændring beregnes i forhold til input og normaliseret mod RpL32 genet. MEF2 udskrifter til stede i alle muskelgrupper slægter er 2,3 gange beriget i forhold til input mens mere begrænsede daske udskrifter er 5,6-fold-beriget. Neurale celler, der udtrykker Prospero og soxN gener udtømte 2,2 gange og 5,5 gange henholdsvis. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dette papir beskriver en modificeret Oversættelse Ribosome Affinitetsrensning protokol (døbt 'TRAP-rc ") dedikeret til studiet af sjældne cellepopulationer i Drosophila embryoner. Er tilvejebragt på de vigtigste skridt for en vellykket isolering af specifikke RNA med et udbytte egnet til microarray eller RNA-seq analyse, dvs. 1) mængden af biologisk materiale kræves og optimeret procedure for embryo lysis og polysom ekstraktion oplysninger; 2) perler / antistof-til-lysat nøgletal for optimal immunpræcipitering; 3) trin tillader reduktion af baggrunden, herunder vaskebuffer sammensætning, således at køre TRAP-rc eksperimenter med høj specificitet og følsomhed.
Denne protokol giver reproducerbare data gør det let anvendes på andre celletyper. Denne teknik gør det muligt at analysere differentiel genekspression på niveau med aktivt-oversætte mRNA og dermed bane vejen for forståelsen protein ekspression i en spec Sp ec ifik celletype på et specifikt tidspunkt vindue. Bemærk dog, at protein overflod vil afhænge af hastigheden af oversættelses- og nedbrydningsprocesser. En væsentlig begrænsning af TRAP metode er dens manglende evne til at måle proteinindholdet på en nøjagtig kvantitativ måde eller til at detektere post-translationel modifikation. Forbedring af kvantificering ved at måle ribosom tæthed langs mRNA kroppen og i den forbindelse, i en celle-typespecifikke måde kan gøre TRAP kombineret med ribosom footprinting et meget kraftfuldt værktøj. I en nylig papir 34 blev denne kombination udført i humane embryonale nyre 293-celler. Forfatterne løb nuklease fodaftryk efterfulgt af affinitetsoprensning af en inducerbar biotinyleret form af RpL10A anvendelse af streptavidin-perler. Dette er et bevis på, at det principielt er muligt at udføre ribosom fodaftryk i en hel organisme er målrettet mod en specifik celletype, begrænsning er mængden af biologisk materiale, der kræves til dette formål.
"> Udførelse TRAP eksperimenter parallelt med globale transkriptom analyser vil gøre det muligt at spore proportioner mellem nyligt transkriberet og actively- oversætte RNA. Dette vil være dybt informativ på de potentielle post-transkriptionelle mekanismer, der finder sted i bestemte udviklingsmæssige sammenhænge eller specifikke cellepopulationer -by microRNA for eksempel.Afslutningsvis, TRAP er en yderst effektiv, specifik og følsom metode til identifikation af RNA'er bundet til aktivt-oversætte ribosomer i en celle-specifik måde. Denne metode kan anvendes i en lang række organismer og vævstyper. Den nye TRAP-rc-protokol beskrevet her blev optimeret til sjældne cellepopulationer (mindre end 1% af det samlede antal celler) og for en mængde af den endelige materiale tilstrækkeligt til efterfølgende analyser på hel-genom-niveau.
En mulig begrænsning af denne metode er kravet om en stærk drivkraft til at producere mærkede ribosomer i tilstrækkelig mængde til compete med endogene umærkede dem i den målrettede celletype. I en nylig undersøgelse 25, anslået forfattere til 10-30% forholdet mellem mærkede versus ukodede ribosomer.
For at overvinde dette problem stigende UAS-RpL10A-EGFP antal kopier vil forbedre denne balance. Alternativt vil tilføje til den beskrevne genetiske baggrund et UAS-GAL4 transgen forstærke produktionen af GAL4 protein og indirekte øger ekspression af RpL10A-EGFP. Dette bør favorisere en bedre belægning på mærkede ribosomer på mRNA.
Bemærk, at dette allerede er effektiv tilgang kan gøres endnu mere kraftfuld ved at tilpasse supplerende metoder til at bringe en mere kvantitativ aspekt eller at opdage og optrævle molekylære mekanismer der er afgørende for genekspression kontrol.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
| 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
| Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
| Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
| Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
| Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
| Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
| Nuclease free water | Nalgene | ||
| Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
| Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
| Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
| Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
| TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
| MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
| Low binding filter tips | ClearLine | ||
| Rnase free tube 1.5 ml | ClearLine | 390689DD | |
| Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
| Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |
References
- Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
- Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
- Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
- Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
- Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).
- Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
- Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
- Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
- Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
- Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605 (2011).
- Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965 (2012).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
- Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419 (2010).
- Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276 (2012).
- Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
- Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
- Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
- Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
- Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).
