Summary
Dannelsen af en ortotopisk rottemodel for pleural malignt mesotheliom efter implantation af II-45 mesotheliom celler i pleurahulen af immunkompetente rotter præsenteres. En flowcytometrisk metode til at analysere syv immuncelleundergrupper i disse dyr fra en 25 pi blodprøve er også beskrevet.
Abstract
Den enorme stigning i interesse i immun-baserede behandlinger for cancer, såsom vacciner og immune checkpoint inhibitorer og øget forståelse af den rolle, tumormikromiljøet i behandlingsrespons, tilsammen peger på behovet for immun-kompetente ortotopisk modeller for præklinisk afprøvning af disse nye behandlinger. Dette papir viser, hvordan at etablere en orthotopisk immun-kompetent rotte model af pleura malignt mesotheliom. Overvågning sygdomsprogression i ortotopisk modeller er forvirret af den interne placering af tumorer. Til længderetningen overvåge sygdommen og dens virkning på cirkulerende immunceller i denne og andre rottemodeller af cancer, et enkelt rør flowcytometriassayet kræver kun 25 pi helblod beskrives. Dette giver nøjagtig kvantificering af syv immunparametre: Samlet lymfocytter, monocytter og neutrofiler, samt T-celle-undergrupper CD4 og CD8, B-celler og naturlige dræberceller. Forskellige subsets af disse parametre er nyttige i forskellige forhold og modeller, med neutrofil til lymfocyt-forhold har den største anvendelighed til overvågning sygdomsprogression i mesotheliom model. Analyse cirkulerende immun celle niveauer ved hjælp af denne enkelt rør metode kan også hjælpe med at overvåge responsen på immun-baserede behandlinger og forstå de underliggende mekanismer, der fører til succes eller fiasko af behandlingen.
Introduction
Malignt mesotheliom (MM) er en aggressiv malignitet, der opstår fra transformerede celler i membranen (mesothelium) at linjer lungerne og bughule, hjerte og indre kønsorganer, og er den mest almindelige primære tumor i lungerne hulrum eller lungehinden 1,2 . Udsættelse for asbestfibre udgør 80% af al MM, og mens forbud mod brug af asbest blev indført årtier siden i de fleste vestlige lande, har den udbredte anvendelse i samfundet efterladt en dødelig arv. WHO har anslået, at 107.000 mennesker verden over dør hvert år af asbestrelaterede sygdomme, med dødelighed fortsætter med at stige. En ny ikke-erhvervsmæssig forekomst bølge også at opstå, og der er lidt forståelse af, hvornår og på hvilket niveau det vil toppe 3.
De fleste mennesker med MM er diagnosticeret sent, når systemisk kemoterapi udgør en af de eneste levedygtige muligheder 4. De fleste effective kemoterapi og nuværende "standard for pleje« (pemetrexed sammen med cisplatin 5) blev identificeret over 10 år siden. Men svigt af denne behandling er uundgåelig, og der er ingen dokumenterede anden linje muligheder, der forlader patienter med en grum prognose og median overlevelse på kun 12 måneder 2. Derfor er der et presserende uopfyldt behov for mere effektive behandlinger. På trods af den undersøgelse af en række nye behandlinger i kliniske forsøg ingen har medført ændringer i praksis. Dette skyldes til dels lav (5%) overførsel af prækliniske resultater, udføres generelt i xenograft musemodeller, til den kliniske indstilling 6-8. Sådanne modeller ikke trofast rekapitulere de komplekse aspekter af tumormikromiljøet forekommer i ikke-fysiologiske steder, ofte i fravær af et fungerende immunsystem 9.
Syngene ortotopisk modeller skaber et betydeligt mere realistisk tumor miljøet end commonly anvendes subkutane xenograftmodeller som forekommer tumorer i den korrekte fysiologiske placering med et intakt immunsystem 10,11. Den større størrelse af rotte forbedrer dets anvendelse som en gnaver sygdomsmodel, især i narkotika undersøgelser, hvor serielle blodprøver skal vurdere behandlingsrespons og toksicitet 12. Endvidere i modeller, hvor overvågning sygdomsprogression er vanskelig på grund af placeringen af tumorer (såsom i pleurahulen), muligheden for at overvåge sygdomsprogression ved hjælp af faktorer findes i cirkulationen, er yderst attraktiv. Frembringelsen af en syngen ortotopisk model af pleural mesotheliom hjælp immun-kompetente rotter er beskrevet. Desuden er en let og relativt ikke-invasiv metode til overvågning af pleural sygdomsprogression ved at måle cirkulerende immunceller også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i den australske Code of Practice for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål. Protokollen for denne undersøgelse blev godkendt af Royal North Shore Hospital Animal Care og etiske komité. Kvindelige Fischer 344 rotter (F344, 150-200 g) blev fastholdt på Kearns Facility, Kolling Institute under standardbetingelser (12 t lys / mørke cykler og fri adgang til mad og vand).
Bemærk: et rutediagram for alle forsøgsprocedurer er beskrevet i figur 1.
1. Fremstilling af celler til implantation
- Kultur rotte mesotheliom II-45 cellelinie (også kendt som IL-45; afledt ved peritoneal indførelse af crocidolit asbest) i RPMI 1640 (RPMI) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og vokse i standardbetingelser (37 ° C befugtet inkubator med 5% CO 2). Maintai ved passage og sub-dyrkning ved ca. 1:50 to gange om ugen i en 75 cm2 kolbe.
- Forbered reagenser til cellekultur og varme portioner ved 37 ° C. Nødvendige reagenser omfatter serumfri RPMI-medium (SFM), RPMI med 10% FBS, phosphatbufret saltvand (PBS) og 0,5% trypsin-EDTA.
- Dyrke celler til implantation til ca. 70-80% konfluens. Dette sikrer, at de er i den lineære vækstfase.
- Harvest celler ved at kassere medierne, vaskning én gang med 5 ml sterilt PBS og derefter tilsætning af 3 ml 0,5% trypsin-EDTA.
- Retur kolber til inkubatoren i ca. 5 minutter, indtil alle celler bliver ikke-klæbende.
- Når cellerne er ikke-klæbende, tilsættes 3 ml RPMI med 10% FBS til inaktivering af trypsin. Indsamle og centrifuger celler ved 300 xg i 3 min.
- Vask cellepelleten i 10 ml SFM og centrifugeres igen ved 300 x g i 3 min.
- Vask cellepelleten igen med 10 ml SFM og centrifugeres som ovenfor.
- Resuspender cellerne i 10 ml SFM og udføre en celletælling under anvendelse af et hæmocytometer eller lignende instrumenter.
- Fortynd celler, således at 100 pi indeholder mængden af celler, der skal implanteres.
Bemærk: Tumorvækst er blevet påvist ved en dosis så lav som 100 celler i 100 pi, men en standard dosis er 500.000 celler i 100 pi. - Forbered tilstrækkelige celler i medier for antallet af rotter, der skal implanteres (dvs. 100 pl / rotte), plus mindst 0,5 ml ekstra for at kompensere for tab fra priming og døde volumen af nålen.
- Forbered tilstrækkelig SFM (uden celler), der skal implanteres i kontrolrotter (dvs. 100 pl / rotte), plus mindst 0,5 ml ekstra.
Bemærk: Cellerne og SFM er nu klar til implantation. De skal opbevares ved 37 ° C og implanteret i 2 timer af høsten for at bevare levedygtigheden.
2. In vivo Implantation af celler
- Placer F344 rotter (> 13 uger gamle) i induktion kammeret og bedøver hjælp 1,4% isofluran inhalation (eller metode, der anvendes i anlægget). Når rotten synes at være i søvn flytte det fra kammeret til en næse kegle (med 1,4% isofluran flyder), placere den på ryggen med brystet opad (ventral visning). Dette tillader de indre organer at afvikle væk fra brysthulen. Check reflekser efter institutionelle protokoller til at sikre, at rotten er fuldt bedøvet.
- Barbere den rigtige regio costalis (bryst) området for at fjerne pelsen.
- Rengør barberede område med 80% v / v ethanol.
- Identificer injektionsstedet: på højre side, find den 2. kirtel starter craniale. Injektionsstedet er 0,5 cm proksimalt for denne, mellem 3. og 4. ribben fra kaudale ende af brystkassen. (Figur 2A).
- Bland forsigtigt II-45-celler for at resuspendere. Langsomt trækker cellesuspensionen (eller SFM til kontrol rotter) i en 1 ml &# 160; injektionssprøjte uden nål påsat. Hvis en nål er fastgjort til udarbejdelse af celler der er potentiale for celler at vokse langs nålen injektion linje. Vedhæft en 23G x 1¼ nål. Prime nålen og fjerne eventuelle luftbobler.
- Når sprøjten og kanylen er primet, placere en 20 mm lang og 5 mm spacer over nåleskaftet. Dette bruges til at forhindre nålen i at trænge for dybt ind i pleurahulen under injektionen. Ca. 5 mm-12 mm blotlagt nålen er tilstrækkelig til gennemførelse af ribbenene uden at beskadige andre organer.
- Sæt langsomt nålen mellem ribbenene, trække tilbage på sprøjten for at sikre et blodkar er ikke blevet punkteret (ingen blod skal vises i sprøjten) derefter injicere 100 celler pi eller SFM. (Figur 2B).
- Fjern kanylen og rul forsigtigt rotten fra side til side for at sprede celler i brysthulen.
- Placer rotte i et bur, og tjekke for genopretning. The rotte bør være vågen inden for 1 min og begynder at bevæge sig rundt.
- Gentag for hver rotte ved hjælp af en ny nål. Genbrug samme p vil resultere i cellevækst langs indsprøjtningsledningen af nålen.
- Overvåg trivsel af dyrene dagligt.
- Aflive dyr på etisk definerede endepunkter som styres af den institutionelle dyreetik udvalg. De etiske endepunkter for rotterne i disse eksperimenter var vægttab på mere end 10% eller besværet vejrtrækning.
3. halevenen Blodprøvetagning
- Hvis blodet skal opsamles umiddelbart efter celle implantation holde rotten bedøvet. Hvis prøveudtagning blod på et andet tidspunkt, bedøver rotten hjælp 1,4% isofluran inhalation. Check reflekser efter institutionelle protokoller til at sikre, at rotten er fuldt bedøvet.
- Placer rotte på siden, og finde en lateral halevene.
- Sterilisere halen med 80% ethanol og mærke et 0,5 ml EDTA collection rør.
- At indsamle blod, altid starter ved den kaudale ende af halen (ca. en tredjedel af vejen langs). Dette giver yderligere forsøg tættere på craniale ende af halen i tilfælde det første forsøg mislykkes. Aldrig resample kaudalt da dette kan forårsage en blodprop.
- Placer en 23G x 1¼ nål parallelt med den laterale venen og skub det ind i venen i en flad vinkel, så det trænger ca. 10 mm (figur 3A).
- Bemærk: Hvis venen er blevet punkteret blod vil kunne ses i vedhæftede ende af nålen (figur 3B).
- En dråbe blod vil dannes på halen på stedet af nålestik. Saml dette blod ved hjælp af en pipette og overførsel til de mærkede 0,5 ml (eller mindre) EDTA-samling rør. For immuncellen assay 25 pi er tilstrækkelig. Påfør gaze med pres for at punktere stedet, indtil blødningen stopper.
- Flick blodet røret at blande blod og EDTA til PRbegivenhed koagulation. Hold tiden mellem blodprøvetagning og blanding med EDTA så korte som muligt for at forhindre koagulation.
- Når opsamling af blod fra flere rotter butik EDTA-blodprøver i et rack ved RT indtil analyse. Proces blod inden 2 timer for indsamlingen.
4. Prøve Forberedelse til Immun Cell Profilering Brug af perle-baserede metode
Bemærk: Denne fælles platform Metoden bygger på anvendelse af kommercielt tilgængelige absolutte tælleglas, der har et kendt antal perler til hver prøve. Disse rør indeholder frysetørrede piller, der opløses under prøveforberedelse, frigiver perlerne. Perlerne fluorescensmærket og ved gating på perlepopulationen kan absolutte tællinger beregnes.
- Sørg for EDTA-fuldblod prøve er godt blandet ved at placere den på en langsom roterende mixer til flere minutter. Mærk en absolut tælling rør for hver prøve. En pille, der indeholder perlerne skal være synlig under tHan metal bead holder på bunden af glasset.
- Overfør 25 pi EDTA fuldblod i en mærket absolutte tælling rør. Perlen pellet opløses ved tilsætning af blodet.
- Til hvert rør tilsættes 20 pi anti-rotte T / B / Natural Killer (NK) celle cocktail, 10 pi anti-rotte CD8a PE, 10 pi anti-rotte-CD4 (domæne 1) FITC og 10 pi anti-rotte CD45 PE / Cy7 (figur 4A). Fluoroforer er defineret i tabel 1.
- Centrifuger røret kortvarigt (300 xg) for at sikre antistofferne og cellerne er i bunden af røret og ikke sidder fast på siden af røret. Vortex for at blandes og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- At lysere røde blodlegemer tilsættes 400 pi 10 mM Tris, 0,15 M til ammoniumchlorid-buffer (pH 7,5) og vortex blandes. Lysis er færdig, når prøven synes gennemskinnelige og ikke uklar (figur 4B og C). Manglende lysere prøven helt vil føre til stigningd baggrund og falsk forhøjede tæller, når man analyserer ved flowcytometri.
5. flowcytometrisk behandling af prøver
Bemærk: Udfør på en 4 farve flowcytometer.
- Åbn softwaren i dataopsamling og en ny skabelon med 8 parceller som afbildet i figur 5.
- Justere indstillinger instrument til de i tabel 1 og oprette gate R1 (FITC [FL-1] versus APC [FL-4]), figur 5Ai) for at tælle de fluorescerende perler. De andre porte er ikke så vigtigt på dette tidspunkt, men købet vil være behov for analyse. De absolutte tælle perler, der anvendes i denne protokol indeholder fluorescerende farvestoffer og kan påvises i en hvilken som helst kanal, selv er svagest i den blå kanal.
- Ved hjælp af en forberedt kontrol blodprøve, vortex og læg på cytometret og køre ved lav hastighed (12 ul / min) på setup tilstand, så datafangst porte kan justeres.
- Indstil erhvervelsen tilindsamle 10.000 begivenheder i R1 perle gate.
- Opsæt en mappe til at registrere data og indstille filnummer og label prøve fil i menuen erhvervelse.
- Indlæse analyseprøven på cytometeret og indstille strømningshastigheden til medium (35 pl / min). Kør hver prøve ved den samme strømningshastighed. Strømningshastigheden kan være nødvendigt at varieres til lav (12 pl / min) eller høj (60 pl / min), men mediet er generelt passende. På denne sats, det tager ca. 90 til 120 sek at erhverve 10.000 perle begivenheder for hver prøve.
- Når prøven er indlæst se scatter plots for at sikre begivenheder vises i R1 perle porten. Der kan i første omgang være en vis ustabilitet i prøven trykket forårsager afdrift i scatter plots. Vent til dette at stabilisere sig.
- Når stabiliseret, skal du klikke på erhverve og tillade prøve at køre. Når cytometret er færdig erhverve 10.000 perle begivenheder i R1 cytometeret vil stoppe erhverve og gemme alle data.
- Fjern prøven og kassér flow tuvære. Cytometret er nu klar til den næste prøve. Kør alle prøver og derefter gå videre til analyse-mode.
6. Immune celleanalyse
Bemærk: gating strategier og boolsk algebra anvendes til at definere hver celle population. Boolsk algebra er en logik baseret analysemetode, der giver mulighed for flere operationer i en enkelt definition. Analysen software af flowcytometer (f.eks BD CELLQuest) tillader anvendelse af boolsk algebra. De ligninger anvendes til aktivt at tage højde for den betydelige negative reaktivitet, der hjælper med at definere cellen til mere specifikt at identificere hver cellepopulation. 'Regioner' er bruges til at definere en "gate". Regioner definerer en 2 dimensionelle rum henviser porte kan være sammensat af mange regioner forbundet af algebraiske operatører (+, *, -, er defineret i tabel 2).
- Skift softwaren til analysen tilstand. En analyse skabelon skal genereres til at matche
- Analysere hver enkelt fil (dvs. hver enkelt prøve) hver for sig. Opsæt porte R1 igennem til R9 og derefter oprette algoritmer for hver celle type som defineret i tabel 2 (også vist i figur 5).
- Anvender cell statistik counter at beregne individuelle cellepopulationer defineret af porte og algoritmer (tabel 2 og figur 5). Algoritmerne vil justere celletal automatisk i cellen statistik tæller.
- Beregn celleundergrupper hjælp af følgende ligning:
Bemærk: Antallet af celle- begivenheder tælles (f.eks CD4 T-celle begivenheder) er opregnet ved anvendelse af ovenstående ligning at give celletal pr pi blod. Eksempler er vist i figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den anvendte metode i dette dokument til frembringelse af en ortotopisk model af pleural mesotheliom hjælp II-45-celler resulterede i dyr bukke under for mesotheliom på en reproducerbar og hurtig tidsramme, med ingen rotter døde på grund af implantation metode. Titrering af antallet af celler implanteret fastslået, at 1x 10 3 celler var den krævede minimum for en fuldt penetrerende model (100% engraftment). De forskellige antal celler implanteret i rotterne ændret tidsforløbet af sygdommen uden at synes at påvirke sygdommens sværhedsgrad. Dyr, der modtog 1 x 10 3, 1 x 10 4 og 5 x 10 5 celler nåede etisk definerede endepunkter ved dag 40, 30 og dag 20 (figur 6).
Blod blev indsamlet fra rotter ca. dobbelt hver uge med nogen komplikationer observerede relateret til samlingen. Det er vigtigt at bemærke, at ikke mere end 10% af den samlede blodvolumen (ellercirka 2 ml) skal indsamles på en 2 ugers periode. En flowcytometrisk assay, der kombineret gating strategier og boolsk algebra blev etableret for at identificere lymfocytter, monocytter og neutrofile og lymfocytundergrupper T, CD4-T, CD8 T, B og NK-celler. Middelværdien og interval for hver celletype blev etableret under anvendelse kontrolrotter (n = 5) og blev sammenlignet med den gennemsnitlige og omfanget af II-45 implanterede rotter ved endpoint (tabel 3). Endpoint værdier blev først sammenlignet for at afgøre, om forskelle eksisterede i immune celletal mellem sunde og syge dyr. I sammenligning med raske kontrolrotter, total lymfocytter, CD4 T-celler, B-lymfocytter og NK-celler faldt i II-45 implanterede rotter ved endepunktet henviser monocytter, neutrofiler og neutrofil til lymfocyt-forhold (NLR) steg.
For at bestemme om disse immuncellepopulationer parametre også ændret med sygdomsprogression og kunne således anvendes som surrogatmarkører feller overvågning sygdom, blev prøver langsgående også sammenlignet (figur 7). Den mest informative langsgående parameter var NLR med stigninger detekteret op til 7 dage før etiske endpoints (figur 7A). For rotter med højdosis celler blev høje NLRs detekteret mellem dag 7 og dag 12 efter implantation, mens der for rotter med lav-dosis celler, begyndte NLR at stige mellem dag 18 og 22. I alt lymfocyttal faldt med sygdomsprogression i rotter med en længere sygdomsfri tidsforløb model (dosis lav celle: 1 x10 4, figur 7B). Dette fald var ikke indlysende i rotter med en hurtig tidsforløb (dosis høj celle: 5 x10 5). Monocytter forblev på et normalt niveau, indtil terminalen samling, når groft øgede tællinger blev der ofte observeres (figur 7C). De andre immune celletal (neutrofiler, NK, B-celle- og CD4 og CD8 T-celler) var mere variabel og dermed mindre informative.
Figur 1. Flow diagram af eksperimentelle procedure. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Placering og sted for implantation. Rotten først bedøvet, placeret på ryggen og retten regio costalis (bryst) område er barberet for at fjerne pels. På højre side er 2. nippel fra toppen identificeret og injektionsstedet er placeret 0,5 cm proksimalt i forhold til denne, mellem 3. og 4. ribben fra bunden af brystkassen (A). En spacer derpå placeret over den forberedte nål og sprøjte for at forhindre nålen i at trænge for dybt ind i pleural hulrum og 100 ul celler eller SFM injiceres (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sampling teknik til opsamling af blod fra halen. Placer en 23G x 1¼ nål parallelt med den laterale vene (A). Skub nålen ind i venen i en flad vinkel, ca. 10 mm dyb, og hold der for et par sekunder, indtil blodet er synlig (B) og fjern nålen. Indsamle blod under anvendelse af en pipette (C). Hvis det er nødvendigt forsigtigt slagtilfælde halevenen for at sikre blodet fortsætter med at strømme. Pipette blod i et 0,5 ml EDTA opsamlingsrør (D), blanding som du går for at forhindre koagulation. arge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mærkning af blodprøven i en absolut tælling rør til flowcytometrisk analyse. Blood (25 pi), og antistoffer tilsættes til et absolut tælling rør (A). Røret derefter hvirvlet og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. Før tilsætning af ammoniumchlorid-buffer til lysering af røde blodlegemer, vises prøven uklar eller uigennemsigtig (B). Når lyseret, vises prøven gennemskinnelige og er klar til flowcytometri analyse (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
es / ftp_upload / 53019 / 53019fig5.jpg "/>
Figur 5. gating strategi for flowcytometri-analyse. En 6-dimensional datasæt kan identificere lymfocytter, monocytter og neutrofiler og lymfocytundergrupper T, CD4 T, CD8 T, B og NK-celler. De definerede gating strategier og algoritmer inkorporere både den negative og positive reaktivitet, der definerer hver celletype muliggør specifik identifikation. Antallet af perler i hvert absolutte tælling rør (findes på posen for hvert rør) registreres for hver prøve og er nødvendig til beregning af antallet af celler pr pi blod for hver delmængde som vist. Den komplette gating algoritme for hver celle delmængde er angivet til højre for analyse plots. (Ai) Perler (R1) er oprindeligt tælles af FITC (FL-1) versus APC (FL-4). Erhvervelse er sat til ca. 10.000 begivenheder (9960 for dette eksempel). (Aii) Debris (R2) er identificeret ved FSC versus SSC og fjernet fra alle efterfølgende gating. (Bi) Efter fjernelse af affald (R2) FSC versus SSC adskiller hvide blodlegemer befolkning i lymfocytter (R3), monocytter (R4) og neutrofiler (R5). (bii) De cellepopulationer identificeret i (Bi) bekræftes ved hjælp af den fælles leukocyt antigen CD45 gating på PE / Cy7 (FL-3) versus SSC. (BIII) Lymfocytpopulationen (R3) yderligere differentieret i T-celler (R6) under anvendelse af CD3 gating på APC (FL-4) versus SSC. ( BIV) CD8 T-celler er lymfocytter (R3) differentieret i T-celle (R6), som også udtrykker CD8a (R9) og gated på PE (FL-2) versus SSC. (Ci) B-celler og NK-celler er defineret som lymfocytter ( R3), som er CD3 negative. B-celler (R7) adskiller sig fra NK-celler som de udtrykker CD45RA og gated af APC (FL-4) versus FITC (FL-1). (CII) CD4 T-celler er defineret som lymfocytter (R3), der co-udtrykker CD3 (T-celler, R6) ogCD4 (R8), men udtrykker ikke nogen af de andre anvendte markører. De er differentieret ved hjælp af FITC (FL-1) versus PE (FL-2) gating. NK-celler er defineret som eventuelt resterende lymfocyt, der ikke allerede er defineret som også udtrykker CD161a. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Survival kurven for rotter implanteret med forskellige doser af II-45 mesotheliom celler. Grupper af rotter blev pleuralt implanteret med 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) eller 1 x 10 2 (n = 4) II-45 mesotheliom celler i 100 pi volumen og derefter overvåges, indtil etisk endpoint, da de blev aflivet. Overlevelse blev afbildet ved hjælp af log-rank (Mantel-Cox) Gehan-Breslow-Wilcoxon-metoden. p>
Figur 7. Langsgående cirkulerende immun celletal fra rotter med mesotheliom forhold til middelværdien og intervallet for raske kontrolpersoner rotter. Den sunde kontrol betyder for hver celletype er vist som en vandret ubrudt sort streg (værdi vises på højre Y-akse hver graf), og området er vist ved det grå skraverede område. Y-aksen viser tællinger pr pi af blod til den angivne celletype, eller værdien for NLR. X-aksen er tidsforløbet for sygdomsprogression, hvor dag 0 er den dag i implantation. Langsgående resultater for 2 rotter implanteret med 1 x 10 4 celler (A, B) og 2 rotter implanteret med 5 x 10 5 celler (C, D) er vist. (A) NLR, (B) totale lymfocyttal, (C) monocyttal.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Detektor | Fluorophor | Detaljer | Volt | Tilstand |
| FSC | --- | --- | E00 | Lineær |
| SSC | --- | --- | 450 | Lineær |
| FL-1 | FITC | 533/30 nm | 670 | Log |
| FL-2 | PE | 585/40 nm | 675 | Log |
| FL-3 | PE / Cy7 | 670 nm (lang pasning) | 600 | Log |
| FL-4 | APC | 675/25 nm | 735 | Log |
Tabel 1: Spænding detektor indstillinger for flow cytoerhvervelse metriske data ved hjælp af en 4 farve flowcytometer. Amplitude gevinst sættes til 1 for alle detektorer. FSC: forward scatter, SSC: sidespredning, FITC: Fluorescein isothyocyanante, PE: phycoerythrin, APC: Allophycocyanine.
| Celleundergruppe | Cellemarkører | Gating Algoritme |
| Perler | R1 | |
| Debris | R2 | |
| Celler (pan-leukocytter) | CD45 + | -R2 |
| Lymfocytter | CD45 + FSC versus SSC | R3 * -R2 |
| Monocytter | CD45 + FSC versus SSC | R4 * -R2 |
| Neutrofiler | CD45 + FSC versus SSC | R5 * -R2 |
| T-celler (i alt) | CD45 + / CD3 + | R6 * R3 * -R2 |
| CD8 positive T ceLLS | CD45 + / CD3 + / + CD8a | R9 * R6 * R3 * -R2 |
| B-celler | CD45 + / CD3- / CD45RA + | R7 * R3 * -R2 |
| CD4-positive T-celler | CD45 + / CD3 + / CD4 + | R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 *-R2) |
| Naturlige dræberceller | CD45 + / CD3- / CD161a + | R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 *-R2)] |
Tabel 2: Cell markører og gating algoritmer til at karakterisere hver immun celle delmængde For gating algoritme, på '+' symbol betyder «eller» og giver mulighed for to adskilte populationer skal lægges sammen, selvom deres reaktioner ikke overlapper hinanden.. Den '-' symbol betyder "ikke", og kan trække en befolkning indefra anden definerede population eller det modsatte af en tidligere beskrevet befolkning. Den '*' symbol betyder "og" og definerer et rum, der er til stede, når to reaktioner overlapper hinanden.
Tabel 3:. Middelværdien og vifte af immunceller i raske kontrolpersoner rotter (n = 5) og II-45 implanterede rotter ved endpoint (n = 4) Resultater pr pi blod er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en fremgangsmåde til generering af en rotte syngen model af ortotopisk pleural mesotheliom og en simpel metode til overvågning af sygdomsprogression ved langsgående blodprøvetagning.
Den II-45 modellen blev udviklet ved at udsætte Fischer 344 rotter for asbestfibre 13. Selv om denne eksponering repræsenterer den sande dynamik host-asbest-immunsystem interaktioner for lungehindekræft patogenese, det har en lang forsinkelse tid (under år at generere), og kan være farligt for forskerne på grund af den potentielle eksponering for asbestfibre. Ortotopisk implantation af II-45 celler i pleurahulen dyr giver en sikker og hurtig model af cancer progression, der efterligner den humane sygdom i en immun-kompetent vært 11. Men de nøjagtige metoder og principper til at overholde i løbet af disse eksperimentelle procedurer ikke er veldefinerede. Fremgangsmåden beskrevet resulterer i en meget reproducerbar model, der er relativt uafhængigt af oplevelsen af operatøren. De kritiske trin er 1, høst II-45 celler i den eksponentielle vækstfase og nøjagtig tælling af levedygtige celler; 2, korrekt positionering af implantationsstedet og sikre, at nålen ikke trænger for dybt og punktere lungerne eller beskadige hjertet og 3, vedligeholdelse og overvågning trivsel for dyrene.
Den II-45 cellelinie er hurtigt voksende og kræver passage hver 3 til 4 dage i kultur, derfor når forberedelserne til implantation, bør celler være sub-kultiveret og vækst overvåges dagligt. Cellerne skal høstes og tælles, når i den eksponentielle vækstfase, dvs. ved ca. 70% konfluens. Ophvirvling af celler i serumfrit medium i stedet for PBS reducerer belastningen på cellerne mens tælle og forberedelse til implantation. Nøjagtige celletal er afgørende for reproducerbarhed, især når dosering med lavt celletal (f.eks 100 til 1000). SUSpension skal være homogen og består af enkelte celler (ingen klumper). En implantation volumen på 100 pi muliggør nøjagtig dosering uden at forringe lungeudvidelse gennem overdreven væske i pleurahulen. De vigtigste trin ved implantation er korrekte positionering og begrænsning af nålepenetration til en dybde på ikke mere end 12 mm. Korrekt positionering af nålen på injektionsstedet er yderst vigtigt at sikre, at cellerne implanteres i pleurahulen og ikke ind i bughulen. Forkert implantering celler for lavt, kan resultere i mesotheliom tumorer vokser gennem membranen, ind i leveren og bughulen. En begrænsning af indtrængningsdybden af nålen er også ekstremt vigtigt at forebygge dødelighed som følge af skader indre organ. Denne begrænsning kan opnås ved anvendelse af en spacer over en lang nål (som vist) eller anvendelse af en kortere nål med en aksel længde på 5 mm til 12 mm. I vores hænder, er der ikke indtruffet bivirkningerunder celleimplantation. Det er også vigtigt at erstatte nålen efter hver implantation. I modsat fald kan resultere i tumorer vokser ud af brysthulen langs injektionen linje. En sådan vækst uden for pleurahulen skyldes tilbageværende celler på nåleskaftet og kan resultere i forlænget overlevelse.
I vores hænder denne model har en tumor engraftment på 100% ved administration af ≥ 1 x 10 3 celler. Sygdomsprogression i II-45 mesotheliom model er ganske hurtig, er mindre end 40 dage, hvor 1 x 10 4 celler implanteres og mindre end 20 dage for en dosis på 5 x 10 5 celler. Dette kan begrænse anvendeligheden af denne model til præklinisk afprøvning af nogle behandlinger. De II-45 celler, mens ikke kommercielt tilgængelige kan købes med tilladelse fra ophavsmanden 13. Imidlertid kan de samme implantationsmetoder og principper også anvendes på andre rotte mesotheliom cellelinjer tilgængelige fra cellelinje repositories når matchet med de relevante syngene rotte stammer. Den optimale dosis celle kan variere med cellelinje og vil skulle fastlægges for hver linje.
Overvågning sygdomsprogression og trivsel for dyrene er vanskelig, da tumorerne er interne og kan ikke overvåges efter størrelse. Derfor har vi søgt at udvikle en metode til overvågning af dyr, som forudsiger forværring af deres tilstand, såsom en stigning i NLR eller andre ændringer i immun cellemarkører, før fysiske symptomer blev synlige. Blodet skærmen udviklet bruger kun 25 pi perifert blod så regelmæssig prøveudtagning kan udføres med minimal gene for dyret. Teknikken prøveudtagning beskrevet kræver øvelse at få den nødvendige ekspertise. Men når det er styr hurtig og minimalt invasiv.
Et kritisk trin i analysen blodet er at forhindre koagulation af blodprøven ved hurtig overførsel til et EDTA-rør. Koagulerede prøverskal kasseres, da tællinger vil være unøjagtige. Et andet afgørende skridt er lyse af røde blodlegemer før celleanalyse. Hvis de røde blodlegemer ikke er fuldt lyseres, vil den øgede baggrunden falsk ophøje tællingerne. Mens den første opsætning af dot plots og gating er tidskrævende, når indstillingerne og skabelon gemmes, analysen kræver lidt justering. Gating anvendte strategi benytter en multi-parameter Boolean algebraisk tilgang til deconvolute dataene. Ved at bruge kendte kombinationer af eksklusive og delte antigener algoritmer for hver linje af porten strategi definerer den diskrete celletype i denne seks-dimensionelle data matrix 14. Dette kombineret med etablerede nøjagtighed ratiometriske perle-baseret teknologi 15-17 har den fordel gøre det muligt for tælling af en defineret celletype som både en andel af celler og en absolut kimtallet pr pi.
Det bliver i stigende grad anerkendt, at immunsystemet pindeholder en vigtig rolle i patogenesen af cancer 18. Både svigt af immunsystemet til at genkende og ødelægge maligne celler og undertrykkelse af immune celler ved tumorer kan føre til ukontrolleret tumorvækst. Således optagelsen af et immun-kompetent tumormikromiljøet er en kritisk betragtning, når modellering kræft og er en stor fordel af syngene kræftmodeller. Disse immun-kompetent modeller skabe en realistisk og klinisk relevant miljø for tumorvækst og immun interaktion, som er mangelfuld i xenogene modeller.
De immunparametre identificeret i denne undersøgelse, ledsaget sygdomsprogression, dvs lymfocyttal, monocyt tæller og NLR, har også vist sig at korrelere med dårlig prognose i menneskelig lungehindekræft 19-21 levere bevis for relevansen af den model og den blodprøve . I de modeller, der præsenteres, den kliniske anvendelighed af overvågning af immunparametre øget with længere tidsforløb (lavere dosis) og kan forbedres yderligere ved hyppigere prøveudtagning på senere stadier af sygdommen. Mens dette papir fokuserer på en model af lungehindekræft, kan evnen til at overvåge tumor progression gennem prøvetagning perifert blod anvendes til alle syngene kræftmodeller. Endvidere kan assayet også anvendes til at vurdere den immunologiske reaktion på forskellige behandlinger. Tidligere har vi anvendt dette assay til at overvåge reaktionen på anti-cancer vaccine terapi i en syngen model gliom (9L) 22. I denne undersøgelse, CD4 og CD8 T-celler var de mest informative markører. Vi har også anvendt dette assay og II-45 mesotheliom model til at identificere forskelle i immunresponset på tumorer er resistente over for forskellige kemoterapeutika 11. I denne undersøgelse, alle parametre undtagen CD8 T-celler viste signifikante forskelle. Den langsgående overvågning under sygdomsprogression beskrevet her fremhæves det potentiale, forskellige immun celle parametre correlatere med kræft progression og trivsel af dyr, når virksomheden syngene ortotopisk modellering af kræft hos rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA Collection tube (0.5 ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur 4 color | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail? Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
