Summary
Genereringen av en ortotopisk råttmodell av pleura malignt mesoteliom genom implantering av II-45 mesoteliom celler i den pleurala håligheten hos immunkompetenta råttor presenteras. En flödescytometrisk metod för att analysera sju immuncellundergrupper i dessa djur från ett prov 25 | al blod beskrivs också.
Abstract
Den enorma våg av intresse för immunbaserade behandlingar för cancer såsom vacciner och immun checkpoint-hämmare, och ökad förståelse för den roll av tumören mikromiljö i behandlingssvar, tillsammans peka på behovet av immunkompetenta orthotopic modeller för preklinisk testning av dessa nya terapier. Denna uppsats visar hur man kan upprätta en orthotopic immunkompetenta modell av pleural malignt mesoteliom råtta. Övervakning sjukdomsprogression i orthotopic modeller förvirrad av den inre placeringen av tumörer. Till längdled övervaka sjukdomsutveckling och dess effekt på cirkulerande immunceller i denna och andra råttmodeller av cancer, ett enda rör flödescytometri analys kräver endast 25 pl helblod beskrivs. Detta ger noggrann kvantifiering av sju immunparametrar: total lymfocyter, monocyter och neutrofiler, samt T-cellunderuppsättningar CD4- och CD8, B-celler och naturliga mördarceller. Olika subsets av dessa parametrar är användbara i olika situationer och modeller, med neutrofila till lymfocyter förhållande med den största nyttan för att övervaka sjukdomsprogression i mesoteliom modellen. Analysera cirkulerande immunceller nivåer med hjälp av denna enda rör Metoden kan även hjälpa till att övervaka svaret på immunbaserade behandlingar och förstå de bakomliggande mekanismer som leder till framgång eller misslyckande i behandlingen.
Introduction
Malignt mesoteliom (MM) är en aggressiv malignitet som härrör från transformerade celler i membranet (mesothelium) som linjer lungan och bukhålan, hjärta och inre könsorgan, och är den vanligaste primära tumör i lungan hålrum eller pleura 1,2 . Exponering för asbestfibrer står för 80% av all MM, och medan förbud mot användning av asbest infördes för flera årtionden sedan i de flesta västländer, har dess utbredda användning i samhället lämnat ett dödligt arv. Världshälsoorganisationen har uppskattat att 107.000 människor i världen dör varje år av asbestrelaterade sjukdomar, med dödstal fortsätter att öka. En ny icke-yrkes incidens vågen också fram och det finns liten förståelse för när och på vilken nivå detta kommer topp tre.
De flesta människor med MM diagnostiseras sent när systemisk kemoterapi utgör en av de enda livskraftiga alternativ 4. De flesta effective kemoterapi och nuvarande "standardbehandling" (pemetrexed i kombination med cisplatin 5) identifierades över 10 år sedan. Men misslyckas med denna behandling är oundviklig och det finns inga beprövade andra alternativ linje, lämnar patienter med en bister prognos och medianöverlevnad på endast 12 månader 2. Därför finns det ett akut ej uppfyllt behov av mer effektiva behandlingar. Trots undersökning av ett antal nya behandlingar i kliniska prövningar ingen har medfört förändringar i praktiken. Detta beror delvis på den låga (5%) överföring av prekliniska resultat, i allmänhet i modeller xenograft mus, till den kliniska inställning 6-8. Sådana modeller inte troget rekapitulera de komplexa aspekterna av tumörens mikromiljö som förekommer i icke-fysiologiska platser, ofta i frånvaro av ett fungerande immunsystem 9.
Syngena orthotopic modeller skapar en betydligt mer realistisk tumörmiljön än commonly används subkutana xenograft-modeller som tumörerna uppträder i den korrekta fysiologiska läge med ett intakt immunsystem 10,11. Den större storleken på råttan ökar dess användning som en gnagare sjukdomsmodell, särskilt i läkemedelsstudier där serie blod drar krävs för att bedöma behandlingssvar och toxicitet 12. Vidare där övervakning sjukdomsförloppet är i modeller svår på grund av placeringen av tumörer (t.ex. i pleurahålan), möjlighet att övervaka sjukdomsförlopp med användning av faktorer funna i cirkulationen är mycket attraktiv. Alstringen av en syngen ortotopisk modell av pleuramesoteliom användning immunkompetenta råttor beskrivs. Dessutom är ett enkelt och relativt icke-invasiv metod för att övervaka pleura sjukdomsprogression genom att mäta cirkulerande immunceller beskrivs också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla som deltar i djurförsök genomfördes i enlighet med rekommendationerna i den australiska uppförandekoden för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål. Protokollet för studien godkändes av Royal North Shore Hospital Animal Care och etikkommittén. Kvinna Fischer 344 råttor (F344, 150-200 g) hölls i Kearns Facility, Kolling Institute under standardförhållanden (12 h ljus / mörker cykler och fri tillgång till mat och vatten).
Obs: Ett flödesschema för alla experimentella förfaranden presenteras i Figur 1.
1. Beredning av celler för implantation
- Kultur råtta mesoteliom II-45-cellinjen (även känd som IL-45; härledd genom peritoneal införande av krokidolit) i RPMI 1640 (RPMI) medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och växa i standardförhållanden (37 ° C fuktad inkubator med 5% CO2). Maintai genom passage och sub-odling vid ca 1:50 två gånger i veckan i en 75 cm 2 kolv.
- Förbered reagenser för cellodling och varma alikvoter vid 37 ° C. Nödvändiga reagens innefattar serumfritt RPMI-medium (SFM), RPMI med 10% FBS, fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 0,5% trypsin-EDTA.
- Kulturceller för implantering till cirka 70-80% konfluens. Detta säkerställer att de är i den linjära tillväxtfasen.
- Harvest celler genom att kassera mediet, tvättning en gång med 5 ml steril PBS och därefter tillsätta 3 ml 0,5% trypsin-EDTA.
- Återgå kolvar till inkubatorn under ca 5 min tills alla celler bli icke-vidhäftande.
- När celler är icke-vidhäftande, tillsätt 3 ml RPMI med 10% FBS för att inaktivera trypsinet. Samla och centrifugera celler vid 300 xg under 3 min.
- Tvätta cellpelleten i 10 ml SFM och centrifugera igen vid 300 xg under 3 min.
- Tvätta cellpelleten igen med 10 ml av SFM och centrifugera enligt ovan.
- Resuspendera cellerna i 10 ml SFM och utför en cellräkning med användning av en hemocytometer eller liknande instrument.
- Späd celler så att 100 | il innehåller den mängd celler som skall implanteras.
Obs: Tumörtillväxten har visats vid en dos så låg som 100 celler i 100 fil men en standarddosen är 500.000 celler i 100 pl. - Förbered tillräckligt många celler i medier för antalet råttor som ska implanteras (dvs 100 ul / råtta), plus åtminstone 0,5 ml extra för att kompensera för förluster från priming och döda volymen av nålen.
- Förbered tillräckligt SFM (utan celler) som ska implanteras i kontrollråttor (dvs 100 l / råtta), plus åtminstone 0,5 ml extra.
Obs: Cellerna och SFM är nu redo för implantation. De bör hållas vid 37 ° C och implanteras inom 2 timmar för skörd för att bibehålla viabiliteten.
2. In vivo-Implantation av celler
- Placera F344 råtta (> 13 veckors ålder) i induktionskammaren och söva att använda 1,4% isofluran inandning (eller metod som används i anläggningen). När råttan verkar vara sovande flytta den från kammaren till en noskon (med 1,4% isofluran flyter), placera den på rygg med bröst uppåt (ventrala vy). Detta tillåter de inre organen för att reglera bort från brösthålan. Kontrollera reflexer enligt institutionella protokoll för att säkerställa råttan helt bedövad.
- Raka rätt regio costalis (bröst) område för att ta bort pälsen.
- Rengör rakade området med 80% volym / volym etanol.
- Identifiera injektionsstället: på höger sida, hitta den 2: a körtel börjar hjärn. Injektionsstället är 0,5 cm proximalt till detta, mellan 3: e och 4: e revbenet från kaudala änden av bröstkorgen. (Figur 2A).
- Blanda försiktigt II-45 celler för att resuspendera. Sakta drar cellsuspensionen (eller SFM för kontrollråttor) i en 1 ml &# 160; spruta utan nål fastsatt. Om en nål fäst för utarbetandet av celler det finns risk för cellerna att växa längs nålen injektion linjen. Bifoga en 23G x 1¼ nål. Prime nålen och avlägsna eventuella luftbubblor.
- När sprutan och nålen är primas, placera en 20 mm lång och 5 mm diameter spacer över nålaxeln. Detta används för att förhindra nålen från att penetrera för djupt in i pleurahålan under injektionen. Cirka 5 mm-12 mm exponerade nålen är tillräcklig för penetrering genom revbenen utan att skada några organ.
- Sakta in nålen mellan revbenen, dra tillbaka på sprutan för att säkerställa ett blodkärl inte har punkterats (inget blod ska visas i sprutan) sedan injicera 100 ul celler eller SFM. (Figur 2B).
- Ta bort nålen och försiktigt rulla råttan från sida till sida för att sprida celler i brösthålan.
- Placera råttan i en bur och kontrollera för återvinning. The råtta bör vara vaken inom 1 minut och börjar flytta runt.
- Upprepa för varje råtta med en ny nål. Återanvändning samma nål kommer att resultera i celltillväxt längs injektionslinje nålen.
- Övervaka välbefinnande djuren dagligen.
- Avliva djur på etiskt definierade ändpunkter som styrs av institutionella djuretisk kommitté. De etiska endpoints för råttorna i dessa experiment var viktminskning större än 10% eller ansträngd andning.
3. svansvenen Blood Collection
- Om blod skall samlas direkt efter cellimplantation, hålla råttan sövd. Om provtagning blod vid en annan tidpunkt, söva råttan med användning av 1,4% isofluran inandning. Kontrollera reflexer enligt institutionella protokoll för att säkerställa att råttan är helt bedövad.
- Placera råttan på sidan och hitta en lateral svansven.
- Sterilisera svansen med 80% etanol och märka en 0,5 ml EDTA collection röret.
- För att samla blod, alltid börja på den bakre änden av svansen (ungefär en tredjedel av vägen längs). Detta medger ytterligare försök närmare den kraniala änden av svansen i det fall det första försöket misslyckas. Sampla aldrig caudally eftersom detta kan orsaka en blodpropp.
- Placera en 23G x 1¼ nål parallellt med den laterala venen och skjut in det i venen i en flack vinkel så det tränger cirka 10 mm (figur 3A).
- Obs: Om venen har framgångsrikt punkterade blod kommer att vara synlig i fäst änden av nålen (Figur 3B).
- En droppe blod kommer att bildas på svansen vid platsen för den nålstick. Samla detta blod med hjälp av en pipett och överföring till de märkta 0,5 ml (eller mindre) EDTA provrör. För immuncellanalys 25 pl är tillräcklig. Applicera gasbinda med tryck att punktera plats tills det slutar att blöda.
- Flick blodet röret för att blanda blod och EDTA till prhändelse koagulering. Håll tiden mellan bloduppsamling och blandning med EDTA så kort som möjligt för att förhindra koagulering.
- När uppsamling av blod från flera råttor butiks EDTA-blodprov i ett rack vid RT tills analys. Process blod inom 2 timmar för insamlingen.
4. Provberedning för immunceller profilering Använda Bead baserad metod
Obs: Denna enda plattform metod förlitar sig på användning av kommersiellt tillgängliga absolut räkna rör som har ett känt antal kulor för varje prov. Dessa rör innehåller frystorkade pellets som löser under provberedningen, släppa kulorna. Pärlorna fluorescerande och genom grind på pärlan befolkningen, kan absolut räknas beräknas.
- Se till prov EDTA helblod blandas väl genom att placera den på en långsam rotationsblandare för flera minuter. Märk ett absolut räkna rör för varje prov. En pellet innehållande pärlorna ska synas under tHan metallpärla hållare i botten av röret.
- Överför 25 ul EDTA helblod i en märkt absolut räkna röret. Vulsten pelleten löses upp vid tillsats av blodet.
- Till varje rör tillsätt 20 | il av anti-rått-T / B / naturliga mördarceller (NK) cell-cocktail, 10 pl av anti-rått-CD8a PE, 10 pl av anti-rått-CD4 (domän 1) FITC och 10 pl anti-rått CD45 PE / Cy7 (Figur 4A). Fluoroforer definieras i Tabell 1.
- Centrifugera röret kortvarigt (300 xg) för att säkerställa antikropparna och celler är i botten av röret och inte fastnat vid sidan av röret. Vortex för att blanda och inkubera under 15 min vid RT.
- Att lysera röda blodkroppar ska 400 pl av 10 mM Tris, till 0,15 M ammonium-kloridbuffert (pH 7,5) och virvel blanda. Lys är fullständig när provet visas genomskinligt och inte grumlig (figurerna 4B och C). Underlåtenhet att lysera provet helt kommer att leda till ökadd bakgrund och falskt förhöjda räknar vid analys genom flödescytometri.
5. Flödescytometriska Behandling av prov
Obs: Utför på en 4 färg flödescytometer.
- Öppna programvaran i inställningsmoden och en ny mall med 8 tomter såsom avbildas i Figur 5.
- Justera instrumentinställningar till de som anges i tabell 1 och ställa in gate R1 (FITC [FL-1] kontra APC [FL-4]), figur 5Ai) för att räkna fluorescerande pärlor. De övriga portar är inte lika viktig vid förvärvet skede, men kommer att krävas för analys. Den absoluta räknings pärlor som används i detta protokoll innehåller fluorescerande färgämnen och kan detekteras i någon kanal men är svagast i den blå kanalen.
- Med användning av en beredda provet kontrollblod, virvel och sedan lasta på cytometern och kördes vid en låg hastighet (12 ul / min) på inställningsläget så datainsamlings grindar kan justeras.
- Ställ förvärvet attsamla 10.000 händelser i R1 pärla porten.
- Inrätta en mapp för att registrera data och ange filnummer och etikett exempelfilen i förvärvs menyn.
- Ladda provet som skall analyseras på cytometern och ställ in flödeshastigheten till mediet (35 ul / min). Kör varje prov vid samma flödeshastighet. Flödeshastigheten kan behöva varieras för att låg (12 | j, l / min) eller hög (60 ul / min), men mediet är i allmänhet lämpligt. I den här takten tar det cirka 90 till 120 sek att förvärva 10.000 pärla händelser för varje prov.
- När provet är laddad titta scatter tomter för att se till att händelser som förekommer i R1 pärla porten. Inledningsvis kan det finnas en viss instabilitet i provtrycket orsakar drift i scatter tomter. Vänta på att denna ska stabiliseras.
- När stabiliserats, klicka på förvärva och låt provet att köra. När cytometern har slutat att förvärva 10.000 pärla händelser i R1 cytometern kommer att sluta förvärva och spara alla data.
- Ta provet och kassera flödet tuvara. Cytometern är nu redo för nästa prov. Kör alla prover och sedan vidare till analysläge.
6. Immuncellanalys
Obs: Gating strategier och boolesk algebra används för att definiera varje cellpopulation. Boolean algebra är en logik bygger analysmetod som gör det möjligt för flera operationer i en enda definition. Den analysmjukvara av flödescytometern (t.ex., BD Cellquest) möjliggör användning av Boolesk algebra. De ekvationer används för att aktivt svara för den betydande negativa reaktiviteten som hjälper till att definiera cellen för att mer specifikt identifiera varje cellpopulation. "Regioner" används för att definiera en "gate". Regioner definierar en 2 dimensionell rymd medan grindar kan vara sammansatt av många regioner som förbinds med algebraiska operatörer (+, *, -, definieras i Tabell 2).
- Växla programvaran till analysläge. En mall analys bör skapas för att matcha
- Analysera varje enskild fil (dvs varje enskilt prov) separat. Ställ upp grindar R1 fram till R9 och sedan ställa in algoritmer för varje celltyp enligt tabell 2 (även visas i figur 5).
- Använd statistik cellräknaren att beräkna individuella cellpopulationer som definieras av grindar och algoritmer (tabell 2 och figur 5). Algoritmerna kommer att justera cellantal automatiskt i statistikcellräknaren.
- Beräkna cellgrupper med hjälp av följande ekvation:
Obs: Antal cellhändelser räknas (t.ex. CD4 T-cells händelser) är uppräknade med hjälp av ovanstående ekvation för att ge cellantalet per il blod. Exempel visas i Figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metod som används i detta dokument för att generera en ortotopisk modell av pleuramesoteliom användning II-45-celler resulterade i djur ge efter för mesoteliom på ett reproducerbart och snabb tidsram, med inga råttor dör på grund av implantering metoden. Titrering av antalet celler implanterade fastställt att 1x 10 3-celler var det minsta antal som krävs för en helt penetrant modell (100% ympning). De olika antal celler implanterade i råttorna ändrade tiden sjukdomsförloppet utan ser ut att påverka sjukdomens svårighetsgrad. Djur som erhöll 1 x 10 3, 1 x 10 4 och 5 x 10 5 celler nådde etiskt definierade slutpunkter vid dag 40, 30 och dag 20 respektive (figur 6).
Blod samlades från råttor ungefär två gånger i veckan med några komplikationer observerade relaterad till samlingen. Det är viktigt att notera att inte mer än 10% av den totala blodvolymen (ellerca 2 ml) bör samlas i en 2 veckors period. En flödescytometrisk analys som kombinerade grind strategier och Boolean algebra inrättades för att identifiera lymfocyter, monocyter och neutrofiler och lymfocytundergrupper T, CD4 T, CD8 T, B och NK-celler. Medelvärde och intervall för varje celltyp fastställdes med användning av kontrollråttor (n = 5) och jämfördes med medelvärdet och intervallet II-45 implanterade råttor vid behandling (tabell 3). Endpoint värdena först jämförs för att bestämma huruvida det fanns skillnader i immunkroppar mellan friska och sjuka djur. I jämförelse med friska kontrollråttor totala lymfocyter, CD4 T-celler, B-lymfocyter och NK-celler minskade under II-45 implanterade råttor vid endpoint, medan monocyter, neutrofiler och neutrofiler till lymfocyter förhållande (NLR) ökade.
För att avgöra om dessa immuncellparametrar ändras också med sjukdomsutveckling och därmed skulle kunna användas som surrogatmarkörer feller övervakning sjukdom, har längsgående prover jämfördes också (figur 7). Den mest informativa längd parameter var NLR med ökningar upptäckts upp till 7 dagar innan etiska endpoints (Figur 7A). För råttor med höga doser celler, höga NLRs upptäcktes mellan dag 7 och dag 12 efter implantation, medan för råttor med lågdos-celler, började NLR öka mellan dag 18 och 22. Totalt lymfocyttal minskade med sjukdomsprogression hos råttor med en längre kurs sjukdomsmodell tid (låg celldos: 1 x10 4, figur 7B). Denna minskning var inte självklart hos råttor med en snabb tidsförlopp (hög cell dos: 5 x10 5). Monocyter kvar på normala nivåer fram till terminalen samlingen när grovt ökade räknar ofta observeras (Figur 7C). De andra immunkroppar (neutrofiler, NK, B-cell och CD4 och CD8 T-celler) var mer varierande och därmed mindre informativ.
Figur 1. Flödesschema av experimentell förfarande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Placering och implantationsstället. Råttan först bedövas, lämnade på rygg och rätt regio costalis (bröst) område är rakat att avlägsna päls. På höger sida, den 2: a nippel från toppen identifieras och injektionsstället ligger 0,5 cm proximalt till detta, mellan 3: e och 4: e revben från botten av bröstkorgen (A). Ett distansorgan placeras därefter över den preparerade nål och spruta för att förhindra att nålen penetrera för djupt in i pleura hålrum och 100 pl celler eller SFM injiceras (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Provtagning teknik för insamling av blod från svansen. Placera en 23G x 1¼ nål parallellt med den laterala ven (A). Skjut in nålen i venen i en flack vinkel, ungefär 10 mm djup, och håll där i några sekunder tills blod är synligt (B) sedan bort nålen. Samla blod med användning av en pipett (C). Vid behov försiktigt stroke svansvenen att säkerställa blodet fortsätter att flöda. Pipett blod i en 0,5 ml EDTA provrör (D), blandning när du går för att förhindra koagulering. arge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Märkning av blodprovet i en absolut räknings rör för flödescytometrisk analys. Blod (25 pl) och antikroppar sättes till en absolut räknings rör (A). Röret virvlades sedan och inkuberades under 15 min vid rumstemperatur. Före tillsatsen av ammoniumkloridbuffert för att lysera de röda blodkropparna, visas provet grumligt eller opakt (B). När lyserade, visas provet genomskinligt och är redo för flödescytometrianalys (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
es / ftp_upload / 53019 / 53019fig5.jpg "/>
Figur 5. Gating strategi för flödescytometrianalys. En 6-dimensionell datamängd kan identifiera lymfocyter, monocyter och neutrofiler och lymfocytundergrupper T, CD4 T, CD8 T, B och NK-celler. De definierade grind strategier och algoritmer införliva både negativa och positiva reaktivitet som definierar varje celltyp som möjliggör specifik identifiering. Antalet kulor i varje absolut räkna rör (finns på påsen för varje rör) registreras för varje prov och krävs för beräkning av antalet celler per il blod för varje rubrik som visas. Den kompletta grind algoritm för varje cell delmängd listas till höger om analys tomter. (Ai) Pärlor (R1) initialt räknas av FITC (FL-1) jämfört med APC (FL-4). Förvärvet är satt till cirka 10.000 evenemang (9960 i detta exempel). (Aii) Debris (R2) identifieras med FSC kontra SSC och bort från alla efterföljande grande. (Bi) Efter avlägsnande av skräp (R2) FSC kontra SSC skiljer vita blodkroppar befolkningen i lymfocyter (R3), monocyter (R4) och neutrofiler (R5). (Bii) De cellpopulationer som anges i (Bi) bekräftas med hjälp av den gemensamma leukocytantigen CD45 grind på PE / Cy7 (FL-3) kontra SSC. (BIII) Lymfocytpopulationen (R3) är ytterligare differentieras till T-celler (R6) med CD3 grind på APC (FL-4) kontra SSC. ( Biv) CD8 T-celler är lymfocyter (R3) differentieras till T-cell (R6) som också uttrycka CD8a (R9) och gated på PE (FL-2) kontra SSC. (Ci) B-celler och NK-celler definieras som lymfocyter ( R3) som är CD3 negativa. B-celler (R7) är differentierade från NK-celler som de uttrycker CD45RA och grindas av APC (FL-4) i förhållande till FITC (FL-1). (CII) CD4-T-celler definieras som lymfocyter (R3), som sam-uttryck CD3 (T-celler, R6) ochCD4 (R8) men inte uttrycka någon av de andra markörer används. De differentierade använder FITC (FL-1) jämfört med PE (FL-2) grind. NK-celler definieras som all återstående lymfocyter som inte redan har definierats som också uttrycker CD161a. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Överlevnadskurva för råttor som implanterats med olika doser av II-45 mesoteliom celler. Grupper med råttor pleurally implanterades med 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) eller 1 x 10 2 (n = 4) II-45 mesoteliom celler i 100 mikroliter volym och övervakas sedan tills etisk endpoint då de avlivades. Överlevnaden ritas med hjälp av log-rank (Mantel-Cox) Gehan-Breslow-Wilcoxon-metoden. p>
Figur 7. Längs cirkulerande immunkroppar från råttor med mesoteliom i förhållande till medelvärdet och intervallet för friska kontrollråttor. Den friska kontroll betyda för varje celltyp visas som en horisontell obruten svart linje (värde visas på den högra Y-axeln varje graf) och sortimentet är avbildad av grå skuggade området. Y-axeln visar de pulser per il blod för den angivna celltypen, eller värdet för NLR. X-axeln är tidsförloppet för sjukdomsprogression, där dag 0 är dagen för implantation. Longitudinella resultat för 2 råttor implanterade med 1 x 10 4 celler (A, B) och 2 råttor implanterade med 5 x 10 5 celler (C, D) visas. (A) NLR, (B) totalt lymfocyttal, (C) monocyt räknas.ge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Detektor | Fluorofor | Detaljer | Spänning | Läge |
| FSC | --- | --- | E00 | Linjär |
| SSC | --- | --- | 450 | Linjär |
| FL-1 | FITC | 533/30 nm | 670 | Log |
| FL-2 | PE | 585/40 nm | 675 | Log |
| FL-3 | PE / Cy7 | 670nm (lång passning) | 600 | Log |
| FL-4 | APC | 675/25 nm | 735 | Log |
Tabell 1: Spänning detektor inställningar för flödes cytometriska datainsamling med hjälp av en 4-färg flödescytometer. Amplitude förstärkningen är satt till 1 för alla detektorer. FSC: framåtspridning, SSC: side scatter, FITC: Fluorescein isothyocyanante, PE: Phycoerythrin, APC: Allophycocyanine.
| Cell delmängd | Cellmarkörer | Gating Algoritm |
| Pärlor | R1 | |
| Debris | R2 | |
| Celler (pan-leukocyter) | CD45 + | -R2 |
| Lymfocyter | CD45 + FSC kontra SSC | R3 * -R2 |
| Monocyter | CD45 + FSC kontra SSC | R4 * -R2 |
| Neutrofiler | CD45 + FSC kontra SSC | R5 * -R2 |
| T-celler (totalt) | CD45 + / CD3 + | R6 * R3 * -R2 |
| CD8 positiva T cells | CD45 + / CD3 + / CD8a + | R9 * R6 * R3 * -R2 |
| B-celler | CD45 + / CD3- / CD45RA + | R7 * R3 * -R2 |
| CD4-positiva T-celler | CD45 + / CD3 + / CD4 + | R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2) |
| Naturliga mördarceller | CD45 + / CD3- / CD161a + | R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * -R2)] |
Tabell 2: Cell markörer och grind algoritmer för att karakterisera varje immunceller delmängd För grind algoritmen, den "+" symbol betyder "eller" och låter två separata populationer som ska läggas samman, även om deras reaktioner inte överlappar varandra.. Den "- symbolen betyder" inte "och kan dra en befolkning inifrån en annan definierad befolkning eller baksidan av en tidigare beskriven population. Den "*" symbolen betyder "och" och definierar ett utrymme som är närvarande endast när två reaktioner överlappar varandra.
Tabell 3:. Medelvärde och utbudet av immunceller hos friska kontrollråttor (n = 5) och II-45 implanterade råttor vid endpoint (n = 4) Resultat per il blod visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna uppsats detaljer en metod för generering av en rått syngen ortotopisk modell av pleuramesoteliom och en enkel metod för att övervaka sjukdomsförloppet genom längsgående blodprovtagning.
II-45-modellen har utvecklats genom att exponera Fischer 344 råttor för asbestfibrer 13. Även om denna exponering representerar de verkliga dynamiken i värdasbestimmunsystemet interaktioner för mesoteliom patogenes, den har en lång fördröjning (ta år att generera) och kan vara farligt för forskarna på grund av den möjliga exponeringen för asbestfibrer. Orthotopic implantation av II-45 celler i pleurahålan djur ger en säker och snabb modell av cancer progression som efterliknar människo sjukdomen i en immunkompetent värd 11. Men de exakta metoder och principer att följa under dessa experimentella procedurer inte är väl definierade. Den procedur som beskrivits resulterar i en mycket reproducerbar modell som är förhåldevis oberoende av erfarenheterna från operatören. De kritiska stegen är 1, skörd II-45-celler i den exponentiella tillväxtfasen och noggrann räkning av viabla celler; 2, korrekt placering av implantationsstället och se till att nålen inte penetrerar alltför djupt och punktera lungorna eller skada hjärtat, och 3, underhåll och övervakning välbefinnande hos djuren.
II-45-cellinjen är snabbväxande och kräver passage var 3 till 4 dagar i kultur, därför när de förbereder för implantation bör cellerna subodlas och tillväxt övervakas dagligen. Celler bör skördas och räknas när i den exponentiella tillväxtfasen, dvs vid ungefär 70% konfluens. Resuspension av celler i serumfria media snarare än PBS minskar belastningen på cellerna samtidigt räkna och förbereda för implantation. Exakta celltal är avgörande för reproducerbarhet, särskilt vid dosering med låga cellantal (t.ex. 100 till 1000). SUSpension bör vara homogen och består av enskilda celler (inga klumpar). En implantation volym av 100 pl möjliggör noggrann dosering utan att försämra lung expansion genom överdriven vätska i lungsäcken. De viktigaste stegen vid implantation är korrekt placering och begränsa Nålpenetrationen till ett djup av högst 12 mm. Korrekt placering av nålen vid injektionsstället är mycket viktigt att se till att cellerna implanteras i pleurahålan och inte in i bukhålan. Felaktigt implantera celler för lågt kan resultera i mesoteliom tumörer växer genom membranet, in i levern och bukhålan. En begränsning av penetrationsdjupet av nålen är också oerhört viktigt att förhindra dödlighet till följd av skador på inre organ. Denna begränsning kan uppnås genom användning av ett distansorgan under en lång nål (såsom visas) eller användning av en kortare nål med en axellängd på 5 mm till 12 mm. I våra händer, har inga negativa händelser har inträffatunder cellimplantation. Det är också viktigt att ersätta nålen efter varje implantation. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i tumörer som växer ut ur brösthålan längs injektionslinjen. Sådan tillväxt utanför pleurahålan beror på kvarvarande celler på nålskaftet och kan resultera i förlängd överlevnad.
I våra händer den här modellen har en 100% tumör engraftment hastighet vid administrering ≥ 1 x 10 3 celler. Sjukdomsprogression i II-45 mesoteliom modellen är ganska snabb, är mindre än 40 dagar när 1 x 10 4 celler implanteras och mindre än 20 dagar för en dos av 5 x 10 5 celler. Detta kan begränsa användbarheten av denna modell för preklinisk testning av vissa behandlingar. De II-45-celler, även om de inte är kommersiellt tillgängliga kan anskaffas med tillstånd från upphovsmannen 13. Emellertid kan samma implantation tekniker och principer även tillämpas på andra rått mesoteliom cellinjer tillgängliga från cellinje reporitories när matchas med de relevanta syngena råttstammar. Den optimala cell dos kan variera med cellinjen och skulle behöva bestämmas för varje linje.
Övervakning sjukdomsutveckling och välbefinnande hos djuren är svårt eftersom tumörerna är interna och kan inte övervakas av storlek. Därför försökte vi att utveckla en metod för att övervaka de djur som kan förutsäga försämring av deras tillstånd såsom en ökning av NLR eller annan förändring i immuncellmarkörer innan fysiska symptom blev synliga. Blod skärmen utvecklat använder endast 25 il perifert blod så att regelbunden provtagning kan utföras med minimal lidande för djuret. Provtagnings beskrivna tekniken kräver övning att få nödvändig kompetens. Men när behärskar den är snabb och minimalt invasiva.
Ett kritiskt steg i analysen av blodet är att förhindra koagulering av blodprovet genom snabb överföring till ett EDTA-rör. Koagulerade provska kasseras eftersom räkningarna kommer att vara felaktiga. En annan avgörande steg är den röda cellys före cellanalys. Om de röda blodkropparna inte är helt lyseras, kommer ökad bakgrunds falskt höja räkningarna. Medan den första installationen av punktdiagram och grind är tidskrävande, när inställningar och mall sparas kräver analysen lite justering. Grind strategi användes använder en multi-parameter Boolean algebraiska syn på deconvolute data. Genom att använda kända kombinationer av exklusiva och delade antigener algoritmerna för varje rad i grindstrategi definiera den diskreta celltypen i sex-dimensionella datamatris 14. Detta i kombination med etablerade noggrannheten hos ratiometrisk pärla-baserad teknik 15-17 har fördelen av att möjliggöra räkning av någon definierad celltyp som både en andel av celler och en absolut talet per pl.
Det blir alltmer erkänt att immunsystemet plägger en viktig roll i patogenesen av cancer 18. Både misslyckandet hos immunsystemet att känna igen och förstöra maligna celler och undertryckandet av immunceller av tumörer kan leda till okontrollerad tumörtillväxt. Således, är införandet av ett immunkompetenta tumörmikro en kritisk faktor när modellering cancer och är en stor fördel med syngena cancermodeller. Dessa immunkompetenta modeller skapar en realistisk och kliniskt relevant miljö för tumörtillväxt och immun interaktion, som är bristfällig i xenogena modeller.
Immun parametrar som anges i denna studie som följde sjukdomsprogression, dvs lymfocyttal, monocyt räknas och NLR, har också visat sig korrelera med dålig prognos vid human mesoteliom 19-21 fram bevis för relevansen av modellen och blodprov . I de modeller som presenterats, den kliniska nyttan av att övervaka immun parametrar ökade with längre tidsförloppet (lägre dos) och kan förbättras ytterligare genom mer frekvent provtagning i senare skeden av sjukdomen. Även om detta dokument fokuserar på en modell av mesoteliom, kan förmågan att övervaka tumörprogression genom perifert blodprov utnyttjas för alla syngena cancermodeller. Vidare kan analysen också användas för att bedöma det immunologiska svaret på olika behandlingar. Tidigare har vi använt denna analys för att övervaka svaret på en anticancervaccinterapi i en syngen gliom modell (9L) 22. I den studien, CD4 och CD8 T-celler var de mest informativa markörer. Vi har också använt denna analys och II-45 mesoteliom modell för att identifiera skillnader i immunsvaret mot tumörer som är resistenta mot olika kemoterapeutiska 11. I den studien, alla parametrar utom CD8 T-celler uppvisade signifikanta skillnader. Den längsgående övervakning under sjukdomsprogression beskrivs här belyser potentialen i olika immuncellparametrar för att correlatera med cancerutveckling och välbefinnande av de djur som företaget syngen orthotopic modellering av cancer hos råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA Collection tube (0.5 ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur 4 color | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail? Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
