Summary
Les canaux ioniques exprimés dans l'épithélium tubulaire rénal jouent un rôle important dans la pathologie de la maladie polykystique des reins. Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux utilisés pour effectuer l'analyse et le niveau de calcium intracellulaire mesures patch-clamp dans l'épithélium kystique fraîchement isolées à partir de reins de rongeurs.
Abstract
Cyst initiation et l'expansion au cours de la maladie polykystique des reins est un processus complexe caractérisé par des anomalies dans la prolifération des cellules tubulaire, l'accumulation de fluide luminal et formation de la matrice extracellulaire. L'activité des canaux ioniques et la signalisation intracellulaire de calcium sont des paramètres physiologiques clés qui déterminent les fonctions de l'épithélium tubulaire. Nous avons développé une méthode appropriée pour l'observation en temps réel de l'activité des canaux ioniques avec la technique de patch-clamp et l'enregistrement de Ca2 + intracellulaire niveau dans les monocouches épithéliales fraîchement isolés à partir de kystes rénaux. Rats PCK, un modèle génétique autosomique récessive de la maladie polykystique des reins (ARPKD), ont été utilisés ici pour l'analyse ex vivo de canaux ioniques et des flux de calcium. Décrit ici est une procédure étape par étape détaillé destiné à isoler monocouches kystiques et tubules non dilatée de PCK ou rats normaux Sprague Dawley (SD), et de surveiller l'activité de canal unique et dynamique intracellulaire de Ca2 +.Cette méthode ne nécessite pas de traitement enzymatique et permet une analyse dans un cadre natif de monocouche épithéliale fraîchement isolés. De plus, cette technique est très sensible aux variations de calcium intracellulaire et génère des images à haute résolution pour des mesures précises. Enfin, isolé épithélium kystique peut encore être utilisé pour la coloration avec des anticorps ou des colorants, la préparation des cultures primaires et la purification de différents dosages biochimiques.
Introduction
Les canaux ioniques jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. Les maladies rénales autosomiques dominants et récessifs polykystiques (PKRAD et PKRAR, respectivement) sont des troubles génétiques caractérisées par le développement de kystes remplis de fluide rénal de l'origine des cellules épithéliales tubulaires. PKD est causée par des mutations de gènes codant pour PKD1 ou PKD2 polycystines 1 et 2, des protéines membranaires impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et la différenciation. PKD2 par lui-même ou sous forme de complexe avec PKD1 fonctionnent également en tant que cation -permeable canal 1 de Ca2 +. Les mutations du gène codant fibrocystine PKHD1 (une protéine de type récepteur cils associés impliqués dans le tubulogenèse et / ou maintien de la polarité de l'épithélium) sont l'impulsion génétique de ARPKD 2. La croissance de kyste est un phénomène complexe accompagnée de la prolifération perturbée 3,4, 5 l'angiogenèse, la dédifférenciation et la perte de polairelité de cellules tubulaires 6-8.
Réabsorption défectueuse et la sécrétion augmentée dans l'épithélium kystique contribuent à l'accumulation de liquide dans la lumière et l'expansion kyste 9,10. Facultés dépendant du débit [Ca2 +] i la signalisation a été également liée à kystogenèse cours PKD 11-15.
Ici, nous décrivons une méthode appropriée pour la mesure de patch-clamp de l'activité de canal unique et les niveaux intracellulaires de Ca2 + dans des monocouches epitheliales kystiques isolés de rats PCK. Cette méthode a été appliquée avec succès par nous pour caractériser l'activité du canal Na + épithélial (ENAC) et 10 [Ca2 +] i dépendante processus induits par le Ca 2+ TRPV4 -permeable et purinergique cascade de signalisation 13.
Dans ces études, nous avons utilisé des rats PCK, un modèle de ARPKD causée par une mutation spontanée dans le gène PKHD1. La souche PCK était originallY provenant de rats 16 rats ainsi SD sont utilisés comme un contrôle approprié pour la comparaison avec la souche PCK Sprague-Dawley (SD). En conséquence, les deux segments de rats SD néphron et des conduits non dilaté collecte isolés à partir de rats PCK mêmes peuvent servir de deux groupes de comparaison différents pour des expériences sur l'épithélium kystique.
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Protocol
Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité de soin et l'utilisation institutionnelle animale au Collège médical du Wisconsin et de l'Université du Health Science Center Texas à Houston et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1 montre principales étapes de la séparation des tissus et la procédure de traitement. En bref, les reins des rats PCK ou SD sont utilisés pour l'isolation manuelle de monocouches épithéliales des canaux collecteurs soit de tubes ou des kystes non-composé en bonne santé. Ici, nous avons étudié les reins à partir de 4-16 semaines vieux rats PCK 10,13.
1. Isolement des kystes rénaux et tubules communicantes (CNT) / des tubes collecteurs (CD) Segments
- Anesthetize animal expérimental avec de l'isoflurane (5% induction, 1,5 à 2,5% de maintenance) / note 2 O médical ou autre méthode approuvée. Les animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer le suffisantevel de l'anesthésie. Respiratoires vitesse de réaction et de pincement de l'orteil Stable sont utilisés pour confirmer l'anesthésie appropriée.
- Laparotomie et rincer les reins, avec un tampon phosphate salin (PBS) à travers l'aorte abdominale 17.
- Préparer un cathéter de tuyaux en polyéthylène (PE50) et le connecter à une pompe seringue remplie de PBS. Couper la peau et la paroi abdominale le long de la ligne blanche, puis faire une incision abdominale transversale à travers l'abdomen de droite à gauche et déplacer les organes abdominaux avec des cotons-tiges pour obtenir l'accès à l'aorte descendante avec branchement mésentériques et coeliaques artères. Humidifiez les organes internes avec une solution saline au chaud pendant d'autres procédures pour empêcher leur sécheresse.
- Placez une ligature (# 1) autour des artères mésentériques et la maladie cœliaque et une autre ligature (n ° 2) autour de l'aorte sous le diaphragme (ne pas attacher). Séparez délicatement un. abdominalis par émousser disséquer les tissus conjonctifs autour de lui avec des pinces fines et placez deux ligatures ~ 3mm au-dessous de l'artère rénale gauche (n ° 3) et au-dessus de la bifurcation artères iliaques (n ° 4).
- Attachez ligature N ° 4 et attacher un collier de récipient autour de l'aorte entre l'artère rénale gauche et ligature # 3. Faire une incision entre la pince et la ligature # 4 à sonder l'aorte, utiliser ligature n ° 3 pour fixer fermement le cathéter.
- Relâchez la pince et assurez-vous que l'impulsion de sang est visible dans le cathéter pour assurer une bonne installation. Commencez la perfusion à un débit de 6 ml / min, cravate ligatures # 1 et # 2, et couper la veine rénale gauche. Continuer à rincer pendant 1-2 min jusqu'à ce que les organes sont complètement blanchis.
- Couper les vaisseaux sanguins rénaux, l'urètre et autour des tissus conjonctifs et adipeux avec des ciseaux pour recueillir les reins. Ensuite, faire une courte déchirure dans capsule rénale et éplucher les reins pour les décapsuler. Placez les reins en PBS glacé. L'euthanasie est confirmée par une thoracotomie.
- Préparer 5 x 5 mm éclats de verre de recouvrement revêtues de poly-L-Lysine. Coupez un gla de couvertureSS avec un crayon de diamant et lieu environ 20 pi de solution à 0,01% stérile filtrée Poly-L-lysine sur chaque puce de verre. Préparer une solution saline et deux paires de pinces horloger pour la dissection.
- Couper les reins avec une lame de rasoir le long du plan frontal en tranches d'épaisseur 2/1 ~ mm. Placez l'une des tranches sous un stéréomicroscope. Isolement de tissus devrait être fait dans une solution saline glacée.
- Localiser kystes sous un stéréomicroscope comme cavités forme arrondie (figure 2A); leurs murs contiennent souvent important réseau de vaisseaux sanguins proliféré. Aide d'une pince à pointe fine dissèquent la couche épithéliale interne d'un kyste aussi mince que possible pour obtenir une zone de monocouche. Attacher à une puce en verre recouvert de poly-L-Lysine. Collant surface Poly-L-lysine permet au chercheur de positionner fermement la couche interne du kyste sur verre. Exposer le kyste avec le côté apical pour fournir un accès pour les pipettes (figure 2B).
- Utilisez PCK ou SD rat enfanttranches centrales ney contenant papille pour l'isolement de non dilatées CNT / CCDsegments 18-21.
REMARQUE: tissus papillaires sont plus durables que le cortex et en maintenant des bandes tubulaires papillaires avec une pince et déchirant le long axe radial de la tranche peut être clivée en secteurs minces. Tubules individuels sont visibles et peuvent être retirées pour être placé sur des puces de verre de couverture. - Identifier les segments CNT / CCD par bifurcations, de transparence plus élevé que les tubules proximaux et grandes cellules bien visible (figure 2C). Placez la puce de verre de couverture avec tubules fixés sous un microscope équipé d'micromanipulateurs appropriés pour micropipettes conduite. Utilisation micropipettes pointus tubules split-ouvertes et joindre leurs bords pour le verre pour rendre la surface apicale accessible (figure 2D).
Électrophysiologie 2. Single Channel patch-clamp
- Remplir la chambre de patch-clamp avec une solution de bain et transférer la puce de verre de couvertureavec des tissus isolés à la chambre. Veiller à ce que les micro-pipettes de patch-clamp ont une résistance de 7-10 MQ pour des mesures fiables (cellule attachée) sur des cellules.
- Pour les mesures cellule attachée, définir le taux de gain de l'amplificateur à 20x et passe-bas les courants à 300 Hz par un filtre à huit pôles Bessel. Pour les canaux ENaC surveillance, utiliser une solution de bain, en mm: 150 NaCl, CaCl2 1, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipette: 140 LiCl, MgCl 2 2 et 10 HEPES (pH 7,4).
- Mener une expérience de patch-clamp conventionnel dans un mode cellule attachée 10. Sélectionner une cellule dans la monocouche epitheliale et l'approche de la pipette à la membrane apicale. Former un joint haute résistance entre une pipette et la membrane cellulaire en appliquant une aspiration douce. Une fois un joint gigaohm haute résistance est formée, un protocole sans interstice à un potentiel de maintien devrait être lancé pour l'activité de surveillance du canal d'intérêt.
- Simples données actuelles Channel Store écart-libres de gigaPhoques Ohm pour analyse ultérieure. Analyser les événements de canaux en utilisant un logiciel généralement fourni avec des configurations de patch-clamp 18. Calculer l'activité du canal que NPo où N désigne le nombre de canaux actifs dans le patch et P o est ouverte probabilité moyenne des canaux.
REMARQUE: Utilisez des kystes ou des tubules isolés dans des expériences de patch-clamp pour pas plus de 30 min.
3. Ratiométrique épifluorescence mesures de la concentration intracellulaire de calcium dans les cellules épithéliales
- Utilisez 5 mM Fura-2 heures dissous dans le DMSO. Solution aliquote du stock dans des tubes coniques de 500 pi individuels (environ 10 pi). Protéger de la lumière et de stocker dans le congélateur à -20 ° C pour un maximum de six mois.
- Incuber kystes isolés et les tubules dédoublé ouvert pour 30-40 min dans PSS (en mm: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, CaCl 2 2 et 10 HEPES à pH 7,35) contenant 5 uM de Fura-2 heures colorant et 0.05% d'acide pluronique pour aider à disperser les esters acétoxyméthyliques. Pour cela, placez les tissus dans le 3,5 cm plat contenant le chargement cocktail, protéger de la lumière et incuber sur un agitateur lent à la température ambiante.
- Changer Fura-deux heures contenant les médias à nettoyer PSS après incubation et placez le tissu sous un microscope pour effectuer une imagerie complémentaire à épifluorescence.
- Tournez sur la caméra CCD et source de lumière stable (système de monochromateur) équipé de roue à filtres (chaque position du filtre peut être associé à son propre niveau d'atténuation, sélectionné chaque fois que le filtre est appelé).
- Trouver le tissu dans le champ lumineux. Commutateur de détection du signal de fluorescence et régler l'intensité de la source de lumière en utilisant des filtres de densité neutre et puissance de la lampe pour éviter la saturation du signal.
- Surveiller Fura-2 AM fluorescence dans l'échantillon de tissu avec une excitation à 340/380 nm ratiométrique avec une fréquence de 0,125 Hz ou plus. Utilisez un 40 × / NA 1.3 ou similaire objectif pour bon résolutionsimage tion.
- Pour le traitement et les calculs d'image importer la séquence d'images. Assurez-vous de séparer les canaux et utiliser un mode HyperStack en niveaux de gris. Sélectionnez plusieurs régions d'intérêt (cellules simple kyste ou des zones sélectionnées de tissu kystique) et de calculer les valeurs d'intensité pour chaque canal (340 et 380 nm) dans le logiciel d'analyse de données pratique; valeurs d'intensité de fond soustraire de chaque point de données.
- Pour chaque point de temps de calculer le rapport des intensités des Fura-2 AM 340 à 380 canaux. Terrain scatter / ligne des changements de point de temps de la Ca transitoire pour chaque région et de calculer des valeurs moyennes / SE.
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Representative Results
Implication potentielle dans ENaC cystogénèse a été démontrée par de nombreuses études qui observe perturbé le facteur de croissance épidermique (EGF) de signalisation dans la progression PKD 22-25 et la réabsorption du sodium dans anormal ARPKD Les modèles murins et les cultures de tissus 26-28. Par exemple, Veizis et al. Ont montré que l'absorption de Na + sensible à l'amiloride est diminuée dans les cellules CD à partir du modèle de non-orthologue de souris BPK ARPKD 29. Nous avons récemment démontré que les troubles de réabsorption du sodium et de l'eau dans les kystes est un facteur important dans l'aggravation de la cystogénèse 10. Plus précisément, nous avons utilisé l'analyse électrophysiologique et immunohistochimique et trouvé que les kystes exercent la réabsorption du sodium émoussée. Une approche pharmacologique démontré que sélective blocus ENaC aggrave nettement la progression de kyste 10.
Nous avons démontré encore l'effet de l'administration de benzamil, un bloqueur de l'ENAC, on activité des canaux dans la paroi du kyste. 4 semaines rats PCK ont été fournis avec le véhicule ou de l'eau contenant benzamil (15 mg / ml) ad libitum potable. Après 12 semaines de traitement les animaux ont été traités selon le protocole décrit ci-dessus. Patch-clamp a été effectuée sur les monocouches kystiques isolés à partir de benzamil véhicule et les groupes traités. La figure 3 montre des traces de courant représentatif de l'activité de ENaC enregistré à partir de membranes apicales. Le graphique de synthèse démontre que l'activité d'ENaC moyenne (NP o) était de 0,91 ± 0,15 dans les 10 kystes de groupe de contrôle, alors que l'administration benzamil diminué l'activité du canal à 0,32 ± 0,05. Nous concluons que, dans ARPKD (caractérisée par une distension extatique de CD pour former de nombreux kystes rénaux en forme de fuseau 30) benzamil donnée dans l'eau potable atteint kystes rénaux avec écoulement de l'urine 30. Cet effet permet benzamil pour diminuer la recapture de sodium à partir du fluide de kyste, contr ibuting cystogénèse à 10.
En plus de la voie de l'EGF, l'adénosine triphosphate (ATP) et d'autres purines ont également été identifiés en tant que composant essentiel de signalisation paracrine qui est modulé de façon inappropriée dans des modèles PKD et chez les patients atteints de cette maladie. Il a été rapporté que la signalisation purinergique joue un rôle important dans la cystogénèse pendant deux ADPKD et ARPKD 31,32. Il a été démontré précédemment cellules à kyste de rats PCK présenter une faible basale [Ca2 +] i et la perte de médiée par le flux [Ca2 +] i la signalisation par rapport à conduits sains non dilatées collecte de rats SD 13. Des agonistes des récepteurs P2 modulent le développement de kystes rénaux dans un modèle in vitro de la formation de kystes provenant de la souris CPK / 33 CPK. Concentration d'ATP haut a été trouvé dans le liquide kystique de patients PKRAD 34 et dans les médias conditionnée par l'épithélium kystique cultivés de souris cpk / cpk 35.
_content "> Nous avons testé le flux de calcium en réponse à l'administration de l'ATP exogène. kystes PCK et les conduits corticales normales de rats SD ont été isolés pour les mesures de calcium avant et après l'application de 10 pM d'ATP. Les données illustrées sur la figure 4 révèle l'effet de 10 uM d'ATP dans les tubules kystiques de rats PCK étudié avec deux approches différentes: la figure 4A montre les mesures de Fura-2 heures intensité de fluorescence à 340 et 380 nM dans une configuration à épifluorescence équipé d'un monochromateur, et la figure 4B représente une session de Fluo-huit colorant coloration avec confocal microscopie. Les deux techniques montrent une cinétique similaire de calcium réponse transitoire à l'application de l'ATP dans l'épithélium 10 kystique.
Après Représentation schématique du protocole expérimental: la figure 1.l'animal est correctement anesthésié et préparé pour la chirurgie, les reins sont rincées avec du PBS pour éliminer le sang. Ensuite, les reins sont excisées, décapsulés et monocouches kystique ou tubules non dilatée sont isolés manuellement avec une pince sous un stéréomicroscope. Tubules non dilatées sont divisés-ouvert avec micropipettes entraînés par micromanipulateurs tandis que l'épithélium kystique surface interne des kystes serait ouvert à avoir accès à la partie apicale.
Figure 2: Isolement et préparation de monocouches de canal cystique et de collecte (A) Un rein tranche représentant 16 semaines vieux rat PCK.. (B) Une monocouche kystique sur une puce de verre de recouvrement transféré à un microscope pour l'analyse de patch-clamp ou l'imagerie de calcium (60X). Changements / CCD (C) A CNT avec bifurcation isolée d'un rat SD. ( 
Figure 3: Effet du traitement benzamil sur l'activité ENaC dans l'épithélium kystique. (A) traces de courant représentatifs pour l'activité ENaC mesurée dans des parcelles fixé cellulaires des kystes fraîchement isolés à partir de 16 semaine vieux rats PCK administré 12 semaines de benzamil dans l'eau potable. Ces patchs ont eu lieu à un potentiel de test de V h = -V p = -40 mV. Li + courants entrants sont vers le bas. Les lignes pointillées indiquent l'état actuel respectif avec un «c» et «o n" désignant les états fermé et ouvert. (B) Résumé graphique de l'activité observée de ENaC (NP o) (partiellement reproduit à partir de 10 avec la permission). * P <0,05 vevéhicule UAR. 
Figure 4: Effets de l'ATP sur l'influx de calcium dans les cellules kystiques des rats PCK (A) des images représentatives de monocouche kystique chargé avec Fura-2 heures avant et après l'application de 10 uM d'ATP.. Graphique résumant l'effet de l'ATP sur les niveaux de calcium dans la monocouche cellulaire de rats PCK et SD canaux collecteurs (n = 38 cellules). (B) monocouche kystique chargé avec Fluo-8 colorant avant et après l'application de 10 uM d'ATP et le résumé graphique de réponse du calcium intracellulaire.
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Discussion
Nous avons décrit ici applications de la technique de patch-clamp conventionnel et imagerie épifluorescence de calcium à des monocouches épithéliales kystiques dérivées d'un modèle génétique murine de ARPKD. Le protocole se compose de trois étapes, dont la plus grande attention devrait être accordée à l'isolement des kystes (étape 1.5 de la section des protocoles) et les études électrophysiologiques. Ces procédures clés nécessitent une formation approfondie et de patience, et le lecteur ne devrait pas être frustré à la fois.
Tout d'abord, le plus d'attention devrait être accordée au processus de l'isolement kyste monocouche. Cette partie de la préparation exige des compétences manuelles et un impact significatif sur la poursuite des travaux, que l'épaisseur de l'échantillon et son attachement même à une puce de verre est critique pour la visibilité des cellules. Épaisseur de parois des kystes isolés varie dans différentes parties de l'échantillon, et il est recommandé de se concentrer sur les grands kystes avec de plus grandes zones monocouches pratiques pour work. Pour aider à nettoyer l'échantillon et accéder à la monocouche, tissus environnants doivent être pelées avec une pince sous un stéréomicroscope. Il convient de souligner que la technique implique l'utilisation d'un stéréomicroscope de haute qualité, caractérisé par une profondeur de champ importante et une capacité de changer le grossissement dans une large gamme pour recevoir différentes tailles d'objets lors de la dissection. Une autre limitation du procédé est que de telles techniques sophistiquées comme patch-clamp et imagerie calcique nécessitent un personnel familier avec ces méthodes. Nous suggérons que l'expérience initiale peut être obtenue sur la collecte des cultures de cellules conduit comme disponible dans le commerce cellules M1 et IMCD médullaire corticales comme ils forment monocouche épithéliale similaire à kystes.
Notre approche permet de mesurer l'activité des canaux ioniques et [Ca2 +] i niveaux dans l'environnement natif de tissus fraîchement isolés. Le principal avantage de cette procédure est que la préparation de spécimens pour singlAnalyse e-canal ou teindre le chargement ne nécessite pas de traitement enzymatique, endommageant des procédés mécaniques ou d'autres mesures potentiellement néfastes. Il est effectué manuellement avec une pince dans une solution saline et offre de grands spécimens intacts. De tels échantillons peuvent être utilisés non seulement pour les techniques décrites. En fait, isolé épithélium kystique représente film mince de cellules tubulaires purs et maintient propriétés monocouches indigènes, ce qui en fait un objet intacte précieux pour des expériences en temps réel qui produit physiologiquement observations pertinentes. Si l'isolement des kystes semble difficile une procédure pour le chercheur ou une grande quantité de tissu kystique est nécessaire à la fois, un traitement enzymatique (par exemple, à la dispase et de la collagénase, comme décrit ici 38 pour le collecteur cortical tubules de conduits) peut être utilisé pour simplifier le processus d'isolement. Cependant, le chercheur doit être très prudent tout en effectuant ce traitement, que des enzymes, en particulier des protéases, peuvent affecter de manière significative Channe ionL'activité de ls ou endommager les récepteurs membranaires. Ceci est, par exemple, très important pour les études de la signalisation purinergique, que ces protéines membranaires sont très bien connus pour dégrader rapidement sous traitement enzymatique 39,40.
En outre, l'épithélium kystique peut être utilisé à d'autres fins, comme l'immunohistochimie ou coloration d'une monocouche fixe avec des colorants (par exemple, la phalloïdine de la rhodamine), ou le chargement du tissu frais avec des marqueurs de substances intracellulaires, tels que DAF-FM pour NO détection ou divers colorants à surveiller production d'espèces réactives de l'oxygène. Il est suggéré d'utiliser la fraction pure isolée épithélium kystique pour western blot pour éliminer l'impact de facteurs non spécifiques présents dans le total des lysats rénaux. Nous suggérons également que l'épithélium kystique peut être isolé de manière similaire à partir de souris ou d'autres espèces qui sont disponibles pour les études de différents modèles de non seulement ARPKD, mais aussi ADPKD. Spécimens kyste fraîchement isolés ont indéniableavantages pour la biologie moléculaire approches comparées aux cellules kystiques culture, comme ils mieux soutenir les propriétés du tissu kystique au sein de l'organe, et sans doute fournir des données plus justifiées concernant les processus pathologiques in vivo.
Un des avantages importants de cette technique est la possibilité d'utiliser non dilatée canaux collecteurs des mêmes reins, ou des rats SD tubules (ces rats partagent fond génétique des rats PCK) normal, que les tissus de contrôle. Patch-clamp et de calcium mesures similaires dans des segments de néphron sont largement utilisés sur les reins non-kystiques dans de nombreux laboratoires 41-43. Selon ions de type chaînes, différentes modifications de la méthode patch-clamp peut être utilisé (cellule entière, dedans-dehors, dehors-out); par exemple, l'ENAC et à ROMK (canal médullaire rénale de potassium externe) l'activité peuvent être évalués par la configuration cellule entière 44,45. La Fura-2 heures imagerie calcique proposé en grand champ épifluorescence avec Monochromator peut également être effectuée avec toute autre modification similaire de l'imagerie de calcium tels que l'analyse par microscopie confocale à deux photons ou avec d'autres colorants de calcium. Ces systèmes de microscope sont moins abordables, mais fournissent des images de qualité supérieure et sont plus sensibles que la microscopie à champ large. Une approche similaire a également été appliqué pour étudier l'activité des canaux de TRPC et la signalisation du calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés 17,46,47. Autres imagerie calcique qui pourrait être appliqué incluent l'utilisation de Fluo-8 comme montré sur la mesure confocale ratiométrique avec Fluo4 / colorants fluorescents FuraRed la figure 4B ou de la manière décrite dans Ilatovskaya et al. 46 Techniquement, il est possible d'effectuer à la fois de patch-clamp et imagerie calcique simultanément sur la même cellule si microscope est équipé de deux configurations. Ainsi, la technique décrite est une approche réalisable pour des observations de haute qualité dans le domaine de la PKD, qui peut être modifié de manière flexible en fonction de ebesoins de e de votre recherche et la disponibilité de l'équipement spécifique. En outre, diverses modifications de l'imagerie de calcium peuvent être utilisés ici, y compris les mesures de ratiométrique confocales avec Fluo4 FuraRed / colorants fluorescents (tels que décrits dans Ilatovskaya et al. 46) ou Fluo-8 comme montré sur la figure 4B.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Cette étude a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (à OPO) et K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), l'American Heart Association 13GRNT16220002 (à OPO) et Ben Lipps J. bourse de recherche de l'American Society of Nephrology (DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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