Summary
Jonkanaler uttrycks i tubulär epitel spelar en viktig roll i patologin av polycystisk njursjukdom. Här beskriver vi experimentella protokoll som används för att utföra patch-clamp analys och intracellulär kalcium nivå mätningar i cystisk epitel nyisolerade från gnagare njurar.
Abstract
Cysta initiering och expansion under polycystisk njursjukdom är en komplex process som kännetecknas av avvikelser i tubulär celltillväxt, luminal vätskeansamling och extracellulär matrisbildning. Aktivitet av jonkanaler och intracellulärt kalcium signalering är viktiga fysiologiska parametrar som bestämmer funktioner av tubulärt epitel. Vi utvecklade en metod som lämpar sig för realtidsobservation av jonkanaler aktivitet med patch-clamp-tekniken och registrering av intracellulär Ca2 + nivå i epiteliala monoskikt nyisolerade från njurcystor. PCK råttor, en genetisk modell för autosomal recessiv polycystisk njursjukdom (ARPKD), användes här för ex vivo analys av jonkanaler och kalciumflöde. Beskrivs här är en detaljerad steg-för-steg förfarande för att isolera cystisk monolager och icke-vidgade tubuli från PCK eller normala Sprague Dawley (SD) råttor, och övervaka enda kanal aktivitet och intracellulära Ca2 + dynamik.Den här metoden kräver inte enzymatisk bearbetning och möjliggör analys i en infödd miljö av nyligen isolerade epitelial monolager. Dessutom är denna teknik mycket känslig för intracellulära kalciumförändringar och genererar bilder med hög upplösning för exakta mätningar. Slutligen kan isolerade cystisk epitel användas vidare för färgning med antikroppar eller färgämnen, beredning av primärkulturer och rening av olika biokemiska analyser.
Introduction
Jonkanaler spelar en viktig roll i många fysiologiska funktioner, inklusive celltillväxt och differentiering. Autosomalt dominant och recessiva polycystiska njursjukdomar (ADPKD och ARPKD, respektive) är genetiska sjukdomar som kännetecknas av utveckling av njurvätskefyllda cystor av den rörformiga epitelceller ursprung. ADPKD orsakas av mutationer i PKD1 eller PKD2 gener som kodar polycystins 1 och 2, membranproteiner är involverade i regleringen av celltillväxt och differentiering. PKD2 i sig eller som ett komplex med PKD1 fungerar också som en Ca2 + -permeable ning kanal 1. Mutationer av PKHD1 genen som kodar fibrocystin (en cilier associerad receptorliknande protein involverat i tubulogenesis och / eller underhåll av polariteten hos epitel) är den genetiska impulser av ARPKD 2. Cysta tillväxt ett komplext fenomen tillsammans med störd spridning 3,4, angiogenes 5, dedifferentiering och förlust av poläraten av tubulära celler 6-8.
Defekt reabsorption och förstärkt sekretion i cystisk epitel bidra till vätskeansamling i lumen och cysta expansions 9,10. Nedsatt flödesberoende [Ca2 +] i signaleringen har också kopplat till cystogenesis under PKD 11-15.
Här beskriver vi ett förfarande som är lämpligt för patch-clamp mätningar av enstaka kanalaktivitet och intracellulära Ca2 + nivåer i cystisk epiteliala monoskikt isolerade från PCK råttor. Denna metod har framgångsrikt tillämpats av oss för att karakterisera aktiviteten hos epitelial Na * kanal (ENAC) 10 och [Ca2 +] i -beroende processer som induceras av Ca2 + -permeable TRPV4 och Purinergic signaleringskaskad 13.
I dessa studier använde vi PCK råttor, en modell av ARPKD orsakas av en spontan mutation i PKHD1 genen. Den PCK-stammen var originally härrörande från Sprague-Dawley (SD) råttor 16 därigenom SD-råttor används som en lämplig kontroll för jämförelse med PCK stammen. Som ett resultat kan både SD råtta nephron segment och icke-dilaterade samlingsrör isolerade från samma PCK-råttor tjänar som två olika jämförelsegrupper för experiment på cystisk epitel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentella förfaranden som beskrivs nedan godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Medical College of Wisconsin och University of Texas Health Science Center i Houston och var i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Figur 1 visar huvudstegen i vävnads isolering och förfarande för förädling. I korthet njurar från PCK eller SD-råttor som används för manuell isolering av epitelceller monolager att samla kanaler antingen från friska icke-uppringda tubuli eller cystor. Här har vi studerat njurar från 4-16 veckor gamla PCK råttor 10,13.
1. Isolering av njurcystor och anslutnings Sugrör (CNT) / Samla kanaler (CD) segment
- Söva försöksdjur med isofluran (5% induktion, 1,5 till 2,5% underhåll) / medicinsk kvalitet O2 eller annan godkänd metod. Djur måste övervakas kontinuerligt för att säkerställa tillräcklig level av anestesi. Stabil andningsfrekvens och tå nypa reaktion används för att bekräfta korrekt anestesi.
- Utför laparotomi och spola njurarna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom bukaortan 17.
- Förbered en polyetylenslang kateter (PE50) och ansluta den till en sprutpump fylld med PBS. Skär huden och bukväggen längs linea alba, sedan göra en tvärgående buksnitt över buken från sida till sida och skifta bukorganen med tops för att få tillgång till den nedåtgående aorta med förgrening mesenteriska och celiaki artärer. Fukta de inre organen med varm koksaltlösning under ytterligare försök att förhindra deras torrhet.
- Placera en ligatur (# 1) runt mesenteriska och celiaki artärer och en annan ligatur (# 2) runt aorta under membranet (inte binda). Separera försiktigt a. abdominalis genom trubbig dissekera bindväv runt den med tunna pincett och placera två ligaturer ~ 3mm under den vänstra njurartären (# 3) och ovanför höftartärerna bifurkationen (# 4).
- Knyt ligatur # 4 och bifoga ett fartyg klämma runt aortan mellan den vänstra njurartären och ligatur # 3. Gör ett snitt mellan klämman och ligaturen # 4 att ANVÄNDA KATETER aortan, använd ligatur # 3 för att fixera katetern.
- Frigöra klämman och se till att blodet pulsen syns i katetern för att säkerställa korrekt installation. Börja perfusion med en hastighet av 6 ml / minut, tie ligaturer # 1 och # 2, och skär den vänstra njurvenen. Fortsätt att spola under 1-2 min tills organen är helt blancheras.
- Skär njur blodkärl, urinröret och omgivande bindväv och fettvävnad med sax för att samla njurarna. Gör sedan en kort tår i njurkapseln och skala njurarna att decapsulate dem. Placera njurarna i iskall PBS. Eutanasi bekräftas av en torakotomi.
- Bered 5 x 5 mm täckglaschips belagda med poly-L-lysin. Skär ett lock glass med en diamant penna och plats ca 20 pl 0,01% steril filtrerad Poly-L-lysin-lösning på varje glaschip. Förbered saltlösning och två par urmakare pincett för dissekering.
- Skär njurarna med ett rakblad längs frontalplanet i skivor av ~ 1-2 mm tjocklek. Placera en av skivorna under ett stereomikroskop. Isolering av vävnader bör göras i iskall saltlösning.
- Lokalisera cystor under ett stereomikroskop som rundformhåligheter (figur 2A); deras väggar innehåller ofta framträdande nätverk av förökade blodkärl. Använda spetsig pincett dissekera inre epiteliala skikt av en cysta så tunn som möjligt för att erhålla ett monoskikt område. Bifoga det till ett glas chip täckt med Poly-L-lysin. Klibbiga poly-L-Lysin ytan tillåter forskaren att stadigt positionera inre cysta skikt på glas. Exponera cysta med den apikala sidan upp för att ge åtkomst för pipetterna (figur 2b).
- Använd PCK eller SD-råtta kidNey centrala skivor innehållande papilla för isolering av icke-vidgade CNT / CCDsegments 18-21.
OBS: papillära vävnader är mer hållbara än cortex och genom att hålla papillära rörformiga band med pincett och riva längs radiella axeln segmentet kan klyvas till tunna sektorer. Enskilda tubuli är synliga och kan dras ut för att släppas ut på omslaget glaschips. - Identifiera CNT / CCD segment genom förgreningar, större öppenhet än proximala tubuli och stora framträdande synliga celler (figur 2C). Placera täckglaset chip med tillhörande tubuli under ett mikroskop utrustat med mikromanipulatorer lämpliga för att driva mikropipetter. Med vassa mikropipetter delad öppna tubuli och bifoga sina kanter till glaset för att göra apikalytan Vänligt (figur 2D).
2. Single Channel Patch-clamp elektrofysiologi
- Fyll patch-clamp kammaren med badlösningen och överföra täckglaset chipetmed isolerade vävnader till kammaren. Se till att patch-clamp mikropipetter har motstånd på 7-10 MQ tillförlitliga på cell (cell bifogas) mätningar.
- För celllösa mätningar, ställa in förstärkningen förstärkaren förhållandet till 20x och låg-pass strömmarna vid 300 Hz med en åtta-polig Bessel-filter. För ENAC kanaler övervakning, använd en badlösning i mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipett: 140 LiCl, 2 MgCl2 och 10 HEPES (pH 7,4).
- Genomföra en konventionell patch-clamp experiment i en cell-anslutna läge 10. Markera en cell i den epiteliala monoskiktet och närma pipetten till det apikala membranet. Bilda en hög resistans tätning mellan en pipett och cellmembran genom ett lätt sug. När en hög resistent gigaohm försegling bildas, bör en lucka fritt protokoll vid en hållpotential startas för att övervaka aktiviteten hos kanalen av intresse.
- Butiks gap fria enkanaliga aktuella data från gigaOhm tätningar för efterföljande analys. Analysera kanal händelser med ett programpaket i allmänhet levereras med patch-clamp inställningar 18. Beräkna kanalaktivitet som NPO där N avser antalet aktiva kanaler i lappen och Pq är genomsnittliga öppen sannolikhet av kanalerna.
OBS: Använd isolerade cystor eller tubuli i patch-clamp-experiment för högst 30 minuter.
3. Propportionell epifluorescence Mätningar av intracellulär kalciumkoncentration i epitelceller
- Använd 5 mM Fura-02:00 löst i DMSO. Alikvotera stamlösning i enskilda 500 pl koniska rör (ca 10 pl). Skyddas från ljus och förvara i frysen vid -20 ° C i upp till sex månader.
- Inkubera isolerade cystor och split öppna tubuli för 30-40 min i PSS (i mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 och 10 HEPES vid pH 7,35) innehållande 5 iM Fura-02:00 färgämne och 0,05% pluronsyra att hjälpa dispergera acetoximetylestrar. För att placera vävnader i 3,5 cm skål innehållande last cocktail, skydda mot ljus och inkubera på en långsam skak vid rumstemperatur.
- Ändra Fura-02:00 innehållande media för att rengöra PSS efter inkubation och placera vävnaden i mikroskop för att ytterligare utföra epifluorescence avbildning.
- Slå på CCD-kamera och stabil ljuskälla (monokromator system) försedd med filterhjul (kan varje filterposition vara associerad med sin egen dämpningsnivå, vald varje gång filtret kallas).
- Hitta vävnaden i ljusa fält. Växla till detektion av fluorescenssignalen och justera intensiteten hos ljuskällan med användning av neutrala täthetsfilter och lampeffekten för att undvika mättning av signalen.
- Övervaka Fura-2:00 fluorescens i vävnadsprov med ratiometrisk excitation vid 340/380 nm med frekvensen 0,125 Hz eller högre. Använd en 40 × / NA 1.3 eller liknande objektiv för korrekt resolution image.
- För bildbehandling och beräkningar importera bildsekvensen. Se till att dela upp kanalerna och använda en Hypers gråskala läge. Välj flera områden av intresse (enda cysta celler eller utvalda områden av cystisk vävnad) och beräkna intensitetsvärden för varje kanal (340 och 380 nm) till föredragna dataanalys programvara; Subtrahera bakgrundsintensitetsvärden från varje datapunkt.
- För varje tidpunkt beräkna förhållandet mellan intensiteterna för Fura-2 AM 340 till 380 kanaler. Tomt scatter / linjepunkt tidsändringar Ca2 + gående för varje region och beräkna medel / SE-värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Potentiell ENAC inblandning i cystogenesis har påvisats genom flera studier som observerade sönder epidermal tillväxtfaktor (EGF) signalering i PKD progression 22-25 och onormal natrium reabsorption i ARPKD musmodeller och vävnadskulturer 26-28. Till exempel, Veizis et al. Visade att amilorid känsliga Na + absorption minskas i CD-celler från icke-ortologa BPK musmodell för ARPKD 29. Vi visade nyligen att nedsatt natrium och vatten reabsorption i cystor är en viktig faktor för försvårande cystogenesis 10. Specifikt använde vi elektrofysiologiska och immunohistokemisk analys och fann att cystor utövar trubbig natrium reabsorption. En farmakologisk strategi visade att selektiv ENAC blockad förvärrar markant cysta progression 10.
Vi visade vidare effekten av administrering av bensamil, en ENAC blockerare, on aktiviteten hos kanalerna i cysta väggen. 4 veckor gamla PCK råttor försågs med vehikel eller dricksvatten innehållande bensamil (15 mg / ml) efter behag. Efter 12 veckors behandling djuren bearbetades i enlighet med det protokoll som beskrivits ovan. Patch-clamp utfördes på cystiska monoskikt som isolerats från fordonet och bensamil behandlade grupper. Figur 3 visar representativa aktuella spår av ENAC aktivitet registrerades från apikala membran. Sammanfattningen graf visar att genomsnitts ENAC aktivitet (NP o) var 0,91 ± 0,15 10 i cystor av kontrollgruppen, medan bensamil administrering minskade aktiviteten av kanalen till 0,32 ± 0,05. Vi drar slutsatsen att i ARPKD (kännetecknas av extatisk buk av CD-skivor för att bilda ett flertal spindelformade njurcystor 30) bensamil ges i dricksvatten når njurcystor med urinflödet 30. Denna effekt kan bensamil att minska natriumåterupptag från cystvätska, contr ibuting att cystogenesis 10.
Utöver EGF vägen, var adenosintrifosfat (ATP) och andra puriner också identifierats som en kritisk parakrint signalerande komponent som olämpligt moduleras i PKD modeller och i patienter med denna sjukdom. Det rapporterades att Purinergic signalering spelar en viktig roll i cystogenesis under både ADPKD och ARPKD 31,32. Cysta celler av PCK råttor har tidigare visats uppvisa låg basal [Ca2 +] i och förlust av flödesmedierad [Ca2 +] i signalering jämfört med friska icke vidgade samlingsrör av SD-råttor 13. P2-receptoragonister modulerar utvecklingen av njurcystor i en modell av cystbildning härrör från CPK / cpk mus 33 in vitro. Hög ATP koncentration hittades i cystisk vätska från ADPKD patienter 34 och i media betingade av cystisk njur epitel odlade från cpk / cpk möss 35.
_content "> Vi testade kalciumflöde som svar på exogen ATP administration. PCK cystor och normala kortikala kanaler från SD-råttor isolerades för mätningarna kalcium före och efter applicering av 10 | iM ATP. Data som visas i Figur 4 visar effekten av 10 | iM ATP i cystisk tubuli av PCK råttor studeras med två olika metoder: Figur 4A visar mätningar av Fura-02:00 fluorescensintensitet vid 340 och 380 nm i en epifluorescence installation utrustad med en monokromator, och figur 4B representerar registrering av Fluo-8 färgämne färgning med konfokal mikroskopi. Båda teknikerna visar liknande kinetik av kalcium övergående svar på ATP ansökan cystisk epitel 10.
Figur 1:. Schematisk representation av det experimentella protokollet Efterdjuret är ordentligt nedsövd och förberedda för kirurgi, njurarna spolas med PBS för att tvätta bort blodet. Därefter är njurarna ut, decapsulated och cystisk monolager eller icke-vidgade tubuli isoleras manuellt med pincett under ett stereomikroskop. Icke-vidgade tubuli är delad öppna med mikropipetter som drivs av mikromanipulatorer medan cystisk epitel som ryta cystor skulle vara öppen att få tillgång till den apikala sidan.
Figur 2: Isolering och beredning av cystisk och samla kanalmonolager (A) En representant njur skiva från 16 veckor gamla PCK råtta.. (B) En cystisk monoskikt på ett täckglas chip fördes till ett mikroskop för patch-clamp-analys eller kalciumavbildning (60X). (C) A CNT / CCD-segmentet med bifurkation isolerats från ett SD-råtta. ( 
Figur 3: Effekt av bensamil behandling ENAC aktivitet i cystisk epitel. (A) Representativa strömspår för ENAC aktivitet mättes i cell bifogade fläckar av cystor färskt isolerade från 16 veckor gamla PCK råttor som administrerats 12 veckors bensamil i dricksvatten. Dessa fläckar hölls vid en testpotential V h = -V p = -40 mV. Inåt Li + strömmar är nedåt. Streckade linjer indikerar respektive aktuella läget med en "c" och "o n" anger de stängda och öppna tillstånd. (B) Sammanfattning diagram över observerad ENAC aktivitet (NP o) (delvis återges från 10 med tillstånd). * P <0,05 veRSU fordon. 
Figur 4: Verkan av ATP på kalciuminflöde i cystisk celler av PCK råttor (A) Representativa bilder av cystisk monoskikt innefattande fura-2:00 före och efter applicering av 10 pM ATP.. Diagram som sammanfattar effekten av ATP på kalciumnivåer i cellmonoskikt av PCK råttor och SD samlingsrör (N = 38 celler). (B) Cystisk monoskikt laddad med Fluo-8 färgämne före och efter applicering av 10 pM ATP och sammanfattning diagram över intracellulärt kalciumsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrivs här tillämpningar av konventionell patch-clamp teknik och epifluorescence kalcium avbildning till cystisk epiteliala monolager som härrör från en mus genetisk modell av ARPKD. Protokollet består av tre steg, varav mest uppmärksamhet bör ägnas åt isoleringen av cystor (steg 1,5 avsnitt protokollen) och de elektrofysiologiska studier. Dessa viktiga förfaranden kräver omfattande utbildning och tålamod, och läsaren ska inte vara frustrerad på en gång.
Först och främst bör de mest uppmärksamhet ägnas åt processen av cysta mono isolering. Denna del av förberedelserna kräver manuella färdigheter och väsentligt påverkar det fortsatta arbetet, eftersom tjockleken på provet och dess även anslutning till ett glas chip är avgörande för synligheten av cellerna. Tjocklek av isolerade cysta väggar varierar i olika delar av provet, och det rekommenderas att fokusera på större cystor med större monolagerområden bekvämt för work. Att bidra till saneringen provet och få tillgång till monoskiktet, bör omgivande vävnader skalas med pincett under ett stereomikroskop. Det bör understrykas att tekniken innebär användning av en högkvalitativ stereokännetecknas av en betydande fältdjup och en förmåga att ändra förstoringen i ett brett spektrum för att rymma olika storlekar av objekt under dissekering. En annan begränsning med metoden är att sådana sofistikerade tekniker som patch-clamp och kalcium avbildning kräver personal med dessa metoder. Vi föreslår att de första erfarenheterna kan erhållas på samlingskanal cellkulturer, såsom kommersiellt tillgängliga kortikala M1 och medullär IMCD celler som de bildar epitelial monolager liknar cystor.
Vår strategi tillåter mätning av jonkanaler aktivitet och [Ca2 +] i nivåer i den nativa miljö nyisolerade vävnader. Den största fördelen med detta förfarande är att förbereda prover för single-channel analys eller färga lastning inte kräver enzymbehandling, skadar mekaniska förfaranden eller andra potentiellt skadliga åtgärder. Den utförs manuellt med pincett i saltlösning och ger stora oskadade exemplar. Sådana prover kan användas inte bara för de beskrivna teknikerna. I själva verket utgör isolerade cystisk epitel tunn film av ren tubulära celler och upprätthåller infödda monoskiktegenskaper, vilket gör det till ett värdefullt intakt föremål för realtidsexperiment som producerar fysiologiskt relevanta iakttagelser. Om isoleringen av cystor tycks hårt ett förfarande för forskaren eller en stor mängd av cystisk vävnad krävs på en gång, enzymatisk behandling (till exempel, med dispas och kollagenas, såsom beskrivits här 38 för kortikala uppsamlingsröret tubuli) kan användas att förenkla isoleringsprocessen. Dock bör forskaren vara mycket försiktig när du utför denna behandling, som enzymer, särskilt proteaser, kan väsentligt påverka ion channels aktivitet eller skada membranreceptorer. Detta är till exempel mycket viktigt för studierna av Purinergic signalering, eftersom dessa membranproteiner är mycket väl kända för att snabbt nedbrytes under enzymatisk behandling 39,40.
Dessutom kan cystisk epitel användas för andra ändamål, såsom immunohistokemi eller färgning av en fast monolager med färgämnen (t.ex. rodamin falloidin), eller laddar färsk vävnad med intracellulära substans markörer, såsom DAF-FM för NO detektion eller olika färgämnen till övervaka reaktiva syreproduktion arter. Det föreslås att använda den rena fraktionen av isolerade cystisk epitel för western blotting för att eliminera effekterna av ospecifika faktorer som förekommer i den totala njur lysat. Vi föreslår också att cystisk epitel kan på liknande sätt isoleras från möss eller andra arter som är tillgängliga för studier av olika modeller av inte bara ARPKD, men också ADPKD. Nyligen isolerade cysta exemplar får obestridligafördelar för den molekylära biologimetoder jämfört med de odlade cystiska cellerna, eftersom de bättre upprätthålla egenskaperna hos den cystiska vävnaden inom organet, och utan tvekan ge mer motiverade data rörande processer in vivo sjukdoms.
En av de stora fördelarna med denna teknik är en möjlighet att använda normala icke-vidgade samla kanaler från samma njurar, eller SD-råttor tubuli (dessa råttor delar genetisk bakgrund med PCK råttor), som kontrollvävnader. Liknande patch-clamp och kalciummätningar i nephron segment används allmänt på icke-cystiska njurar i många laboratorier 41-43. Beroende jonkanaler typ, olika modifieringar av patch-clamp-metoden kan användas (hela cell, inifrån och ut, utanför-out); exempelvis ENAC och ROMK (njur yttre medullär kaliumkanal) aktivitet kan bedömas genom hel-cellkonfiguration 44,45. Den föreslagna Fura-02:00 kalcium avbildning i brett fält epifluorescence med monochromator kan även utföras med någon annan liknande modifiering av kalcium avbildning såsom analys med konfokala eller två foton mikroskopi med andra kalcium färgämnen. Dessa mikroskopsystem är mindre överkomlig men ger högre bildkvalitet och är känsligare än brett fält mikroskopi. Liknande tillvägagångssätt tillämpas även för att studera trpC kanaler aktivitet och kalciumsignalering i podocyter av nyligen isolerade glomeruli 17,46,47. Andra kalcium avbildning som skulle kunna tillämpas innefattar utnyttjande av Fluo-8 såsom visas på figur 4B eller ratiometrisk konfokal mätning med Fluo4 / FuraRed fluorescerande färgämnen såsom beskrivits i Ilatovskaya et al., 46 Tekniskt sett är det möjligt att utföra både patch-clamp och kalcium avbildning samtidigt på samma cell om Mikroskopet är utrustat med båda inställningar. Således är den beskrivna tekniken en framkomlig väg för högkvalitativa observationer inom PKD, som kan flexibelt modifieras enligt the behov av din specifika forskning och tillgången på utrustningen. Vidare kan olika modifieringar av kalcium avbildning användas här, inbegripet kvotmetriska konfokala mätningar med Fluo4 / FuraRed fluorescerande färgämnen (såsom beskrivits i Ilatovskaya et al., 46) eller Fluo-8 såsom visas på figur 4B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) och Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) för utmärkt tekniskt bistånd med mikroskopi experiment. Denna studie stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (till OPO) och K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (till OPO) och Ben J. Lipps forskartjänst från American Society of Nephrology (DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
- Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
- Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
- Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
- Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
- Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
- Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
- Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
- Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
- Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
- Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
- Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
- Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
- Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
- Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
- Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
- Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
- Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
- Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
- Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
- Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
- Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
- Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
- Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
- Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
- Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
- Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
- Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
- Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
- Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
- Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
- Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
- Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
- Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
- Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
- Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
- Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
- Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
- Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
- Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
- Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
- Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
- Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).
