Summary
尿細管上皮細胞で発現するイオンチャネルは、多発性嚢胞腎疾患の病理において重要な役割を果たす。ここでは、新たにげっ歯類の腎臓から単離された胆嚢上皮におけるパッチクランプ分析を行うために使用される実験プロトコルおよび細胞内カルシウムレベルの測定を説明します。
Abstract
多発性嚢胞腎嚢胞中の開始と拡大は尿細管細胞増殖の異常、管腔流体の蓄積および細胞外マトリックス形成を特徴とする複雑なプロセスです。イオンチャネルおよび細胞内カルシウムシグナル伝達の活性は、尿細管上皮の機能を決定する重要な生理学的パラメータです。我々は、新たに腎嚢胞から単離された上皮単層における細胞内Ca 2+レベルのパッチクランプ法と登録のイオンチャネル活性のリアルタイム観察に適した方法を開発しました。 PCKラット、常染色体劣性多発性嚢胞腎（ARPKD）の遺伝的モデルは、イオンチャネルおよびカルシウムフラックスの ex vivo分析のためにここで使用しました。ここで説明するには、PCKまたは通常のスプラーグドーリー（SD）ラットから嚢胞性単層と非拡張型細管を分離し、単一チャネル活性および細胞内Ca 2+動態を監視するために設計された、詳細なステップバイステップの手順です。この方法は、酵素処理を必要とし、新たに単離した上皮単層の本来の設定で分析を可能にしません。また、この技術は、細胞内カルシウムの変化に非常に敏感であり、正確な測定のために、高解像度の画像を生成します。最後に、単離された嚢胞上皮はさらに、抗体または染料を用いて、様々な生化学的アッセイのための一次培養および精製の調製物を染色するために使用することができます。
Introduction
イオンチャネルは、細胞の増殖および分化を含む多くの生理学的機能に重要な役割を果たしています。常染色体優性と劣性嚢胞腎疾患（ADPKDおよびARPKD、それぞれ）尿細管上皮細胞由来の腎臓の液体で満たされた嚢胞の開発によって特徴付けられる遺伝性疾患です。 ADPKDはpolycystins 1及び細胞増殖および分化の調節に関与する2は、膜タンパク質をコードするPKD1またはPKD2遺伝子の突然変異によって引き起こされます。それ自体で、またはPKD1との複合体としてPKD2もの Ca 2+ -permeable陽イオンチャネル1として機能します。 PKHD1をコードする遺伝子fibrocystin（細管形成および/ または上皮の極性の維持に関与する繊毛関連受容体様タンパク質）の変異は、ARPKD 2の遺伝子原動力です。嚢胞の成長が乱れた増殖3,4、血管新生5、脱分化および極性の喪失を伴う複雑な現象であります尿細管細胞6-8の性。
嚢胞上皮の欠陥再吸収と増強分泌は、内腔と嚢胞拡大9,10内の流体の蓄積に貢献しています。障害フロー依存の[Ca 2+] iのシグナリングがまた、PKD 11-15の間に嚢胞形成にリンクされています。
ここでは、単一チャネル活性とPCKラットから分離された嚢胞性上皮単層における細胞内Ca 2+レベルのパッチクランプ測定のための適切な方法を説明します。このメソッドは、正常上皮 Na +チャネル（ENaC）10の活性を特徴づけるために私達によって適用し、[Ca 2+] iのの Ca 2+ -permeable TRPV4とプリンシグナリングカスケード13によって誘導されたプロセスを依存しました。
これらの研究では、PCKラット、PKHD1遺伝子における自然突然変異によって引き起こさARPKDのモデルを使用しました。 PCK株はoriginallましたスプラーグ-ドーリー（SD）ラットに由来するY 16それによってSDラットをPCK株と比較するための適切なコントロールとして使用されています。その結果、同じPCKラットから単離されたSDラットのネフロンセグメントと非拡張集合管の両方が、嚢胞上皮での実験のための2つの異なる比較群として機能することができます。
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Protocol
以下に記載の実験手順は、ウィスコンシン医科大学で機関動物実験委員会によって承認され、ヒューストンでのテキサス大学健康科学センター、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従ってありました。 図1は、組織の単離および処理手順の主要ステップを示しています。簡単に言うと、PCKまたはSDラットからの腎臓は健康な非ダイヤルした細管または嚢胞のいずれかから集合管の上皮単層の手動単離のために使用されています。ここでは、4-16週齢PCKラット10,13から腎臓を検討しました。
腎嚢胞との接続細管の1の単離（CNT）/ダクト（CD）セグメントの収集
- イソフルラン（5％誘導、1.5〜2.5％のメンテナンス）/医療グレードのO 2または他の承認された方法で実験動物を麻酔。動物は、継続的に適切なルを確保するために監視されなければなりません麻酔のVEL。安定した呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。
- 開腹術を行い、腹部大動脈17を介してリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で腎臓をフラッシュします。
- ポリエチレン管カテーテル（PE50）を準備し、PBSで充填されたシリンジポンプに接続します。側、腸間膜や腹腔動脈分岐で下行大動脈へのアクセスを取得するために綿棒で腹部臓器をシフトする側から腹部全体の横腹部切開を行い、その後、白線に沿って皮膚や腹壁をカットします。彼らの乾燥を防ぐために、さらに手順の間に温かい生理食塩水で内臓を湿ら。
- 腸間膜や腹腔動脈とダイアフラム下大動脈の周りに他の合字（＃2）（ネクタイしない）の周りに1合字（＃1）を配置します。静かに分離します。細い鉗子でその周りの結合組織を解剖し、2合字を配置することによって鈍ら腹 〜3左腎動脈（＃3）と腸骨動脈の分岐部（＃4）上記下記ミリメートル。
- リガチャー＃4を接続し、左腎動脈結紮＃3との間の大動脈の周りの血管クランプを取り付けます。大動脈のカテーテルを挿入するクランプとリガチャー＃4との間の切開を行い、しっかりとカテーテルを固定するための合字＃3を使用しています。
- クランプを解除し、血液パルスが適切な設置を確実にするためにカテーテルに表示されていることを確認してください。 6ミリリットル/分の速度で灌流を開始し、タイは＃1と＃2を合字、左腎静脈を切りました。臓器が完全にブランチングされるまで1〜2分間フラッシュし続けます。
- 腎臓の血管を切り取り、尿道及び腎臓を収集するためにハサミで結合し、脂肪組織を囲みます。その後、腎臓カプセルに短い涙を作り、それらをカプセル化解除するために腎臓の皮をむきます。氷冷PBSに腎臓を置きます。安楽死は、開胸術によって確認されました。
- ポリ-L-リジンで被覆した5×5 mmのカバーガラスチップを準備します。カバーGLAをカットダイヤモンド鉛筆と場所、各ガラスチップ上に0.01％滅菌濾過したポリ-L-リジン溶液約20μlのssです。解剖のために生理食塩水や時計職人鉗子の二組を準備します。
- 〜1〜2ミリメートルの厚さのスライスに前頭面に沿ってカミソリの刃で腎臓をカットします。実体顕微鏡下でのスライスの1つを配置します。組織の単離を、氷冷生理食塩水で行う必要があります。
- ラウンド形状の空洞（ 図2A）のように実体顕微鏡下嚢胞を見つけ;その壁は、多くの場合、増殖し、血管の顕著なネットワークが含まれています。先の細いピンセットを使用して、単層の面積を得るためにできるだけ薄い嚢胞の内部上皮層を分析。ポリ-L-リジンで被覆されたガラスチップに接続します。スティッキーポリ-L-リジンの表面は、研究者がしっかりとガラスの内部嚢胞層を配置することができます。ピペット（ 図2B）へのアクセスを提供するために、頂端側を上にして嚢胞を公開します。
- PCKまたはSDラットの子供を使用してください非拡張型CNT / CCDsegments 18-21の単離のための乳頭を含むネイ中央スライス。
注：乳頭状の組織は、皮質よりも耐久性があり、鉗子で乳頭管状バンドを保持し、スライス軸、半径に沿って引き裂くことによって薄いセクターに切断することができます。個々の細管が表示され、カバーガラスチップ上に配置されるように引き出すことができます。 - 、分岐によって近位尿細管と大きな目立つ可視セル（ 図2C）より高い透明性のCNT / CCDセグメントを特定します。マイクロピペットを駆動するのに適したマイクロマニピュレータを備えた顕微鏡下で添付細管とカバーガラスチップを置きます。ガラスにそれらのエッジをシャープにマイクロピペットを分割オープン細管を使用し、添付すること（ 図2D）先端面にアクセスできるようにします。
2.シングルチャネルパッチクランプ電気生理学
- 浴溶液でパッチクランプ室を充填し、カバーガラスチップを転送します室に分離された組織と。パッチクランプマイクロピペットが信頼のセル（セル付）測定のための7-10MΩの抵抗を持っていることを確認してください。
- セル付測定では、20倍に増幅利得比を設定し、8極ベッセルフィルタにより300 Hzの電流を低域通過。 ENaCチャネルの監視については、mMの中で、浴溶液を使用する：150のNaCl、1のCaCl 2、2のMgCl 2、10 HEPES（pH7.4）で、ピペット：140のLiCl、2のMgCl 2および10 HEPES（pHは7.4）。
- セル接続モード10で、従来のパッチクランプ実験を行います。上皮単層のセルを選択し、頂端膜にピペットに近づきます。穏やかな吸引を適用することにより、ピペットと細胞膜との間に高抵抗シールを形成します。高抵抗ギガオームのシールが形成されると、保持電位でのギャップのないプロトコルは、関心のあるチャネルの監視活動のために起動する必要があります。
- ギガから店舗ギャップのない単一チャネル電流のデータΩは、その後の分析のために密封します。一般的にパッチクランプのセットアップ18に付属のソフトウェアパッケージを使用してチャネルのイベントを分析します。 Nはパッチ内のアクティブなチャネルの数を参照し、P oはチャネルの平均開口確率であるNPO法人としてのチャンネル活性を計算します。
注：30分以上のパッチクランプ実験で分離された嚢胞または細管を使用してください。
上皮細胞の細胞内カルシウム濃度の3レシオメトリック落射蛍光測定
- DMSOに溶解した5 mMのフラ - 2AMを使用してください。個々の500μlのコニカルチューブに小分け原液（約10μL）。最大6ヶ月間-20℃の冷凍庫で軽く、ストアから保護します。
- 5μMのFura-2 AM色素および0.0を含む：（145のNaCl、4.5のKCl、pHは7.35で2のMgCl 2、2のCaCl 2および10 HEPES mMの中で）、PSSで30〜40分間分離された嚢胞とスプリットオープン細管をインキュベート5％プルロニック酸アセトキシメチルエステルを分散するのに役立ちます。そのため、ローディングカクテルを含む3.5センチメートル皿に入れ組織は、光から保護し、室温でゆっくりと振とう機上でインキュベートします。
- インキュベーション後にPSSをきれいにし、さらに落射蛍光イメージングを実行するために顕微鏡下で組織を配置するために、メディアを含む変更のFura-2 AM。
- フィルターホイールを装備したCCDカメラと安定した光源（モノクロメータシステム）をオンにします（各フィルタの位置はフィルタが呼び出されるたびに、選択し、独自の減衰レベルに関連付けることができます）。
- 明視野で組織を検索します。蛍光シグナルの検出に切り替えて、信号の飽和を回避するために、中性濃度フィルタ及びランプ電力を使用して光源の強度を調整します。
- 0.125ヘルツ以上の周波数で340/380 nmで励起レシオメトリックと組織試料中のFura-2 AMの蛍光を監視します。適切resolu 40×/ NA 1.3または類似の対物レンズを使用してくださいションイメージ。
- 画像処理や計算のためのイメージシーケンスをインポートします。チャンネルを分割し、hyperstackのグレースケールモードを使用するようにしてください。興味のあるいくつかの領域を選択します（シングルシスト細胞または嚢胞性組織の選択された領域）であり、好ましいデータ解析ソフトウェアに、各チャネル（340および380 nm）のための強度値を計算します。各データポイントからバックグランド強度値を減算します。
- 各時点についてのFura-2 AM 340〜380チャンネルの強度の比を計算します。プロットスキャッタ/各地域のの Ca 2+トランジェントのラインポイント時間の変更と計算平均/ SE値。
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Representative Results
嚢胞形成の潜在的な関与のENaCは、PKDの進行22-25とARPKDマウスモデルおよび組織培養26-28における異常なナトリウム再吸収シグナリング破壊上皮成長因子（EGF）を観察し、いくつかの研究によって実証されています。例えば、Veizis らアミロライド感受性のNa +吸収をARPKD 29の非オルソロガスBPKマウスモデルからCD細胞において減少することを示しました。我々は最近、嚢胞における減損ナトリウムと水の再吸収が嚢胞形成10を悪化させる上で重要な要因であることを実証しました。具体的には、電気生理学的および免疫組織化学的分析を採用し、嚢胞が鈍化ナトリウムの再吸収を発揮することがわかりました。薬理学的ア プローチは、選択したENaC遮断が顕著に嚢胞の進行10を悪化させることを実証しました。
我々はさらに、Oベンザミルは、ENaC遮断薬の投与の効果を実証しました嚢胞壁内のチャネルのn個の活動。 4週齢PCKラットをビヒクルまたはベンザミルた（15mg / ml）を随意に含む飲料水を供給しました。治療の12週間後に、動物は、上述のプロトコールに従って処理しました。パッチクランプは、車両とベンザミル処理されたグループから分離された嚢胞性単層上で行った。 図3は 、頂端膜から記録されたENaC活性の代表現在のトレースを示します。サマリグラフは、ベンザミル投与は0.32±0.05にチャネルの活性を減少した平均ENaC活性（NP Oが ）、対照群の嚢胞で0.91±0.15 10であることを示しています。私たちは、飲料水に与えられたベンザミル（多数の紡錘状腎嚢胞30を形成するために、CDの恍惚膨満を特徴とする）ARPKDには、尿流30と腎嚢胞に到達したと結論付けています。この効果は、ベンザミルが嚢胞液、CONTRからナトリウム再取り込みを減少させることを可能にします嚢胞形成10にibuting。
EGF経路に加えて、アデノシン三リン酸（ATP）、および他のプリンも不適切PKDモデルおよびこの疾患を有する患者において変調され、重要なパラ分泌シグナル伝達成分として同定されました。これはプリンシグナリングはADPKDとARPKD 31,32の両方の中に嚢胞形成に重要な役割を果たしていることが報告されました。 PCKラットの嚢胞細胞は、以前の[Ca 2+] iと流れ媒介の損失はの[Ca 2+] iのSDラット13の健康な非拡張型集合管に比べて信号伝達低い基礎を示すことが示されています。 P2受容体アゴニストは、CPK / CPKマウス33に由来する嚢胞形成のインビトロモデルにおける腎嚢胞の発達を調節します。高ATP濃度は34 ADPKD患者からの嚢胞液中に発見され、メディアにCPK / CPKマウス35から培養嚢胞腎上皮により調整しました。
_content ">我々は、外因性のATP投与に応答してカルシウムフラックスをテストした。SDラットからPCK嚢胞および正常な皮質のダクトを10μMのATPの適用前と後のカルシウム測定のために単離された。データは、図4に示す 10μMのATPの効果を明らかにするPCKラットの嚢胞性尿細管に2つの異なるアプローチを用いて研究： 図4Aは、モノクロメーターを装備した落射蛍光セットアップで340および380 nmでのFura-2AMの蛍光強度の測定結果を示し 、図4Bは 、共焦点であるFluo-8色素染色の登録を表し顕微鏡。両方の技術は、嚢胞上皮10におけるATPアプリケーションへのカルシウム過渡応答の同様の動態を示しています。
図1：実験プロトコルの模式図の後。動物が適切に麻酔や手術のために準備され、腎臓は血液を除去するためにPBSでフラッシュされます。その後、腎臓を摘出し、カプセル化を解除、および嚢胞性単層または非拡張型細管は実体顕微鏡下でピンセットを用いて手動で隔離されています。非拡張した尿細管は分割オープンされているマイクロマニピュレーターによって駆動マイクロピペットで嚢胞の内面としての嚢胞上皮は、頂端側へのアクセス権を持ってオープンになる一方。
図2：単離と胆嚢と集合管の単層（A）の調製 16週齢PCKラットからの代表的な腎臓スライス。 （B）パッチクランプ分析又はカルシウムイメージング（60X）のために顕微鏡に移し、カバーガラスチップ上に単分子層嚢胞。 （C）SDラットから分離された分岐部とCNT / CCDセグメント。 （ 
図3：嚢胞性上皮におけるENaC活性にベンザミル処置の効果。 （A）たての飲料水にベンザミルの12週間投与16週齢PCKラットから分離された嚢胞の細胞付着したパッチで測定されたENaC活性のための代表的な電流トレース。これらのパッチは、V H = -V P = -40mVでの試験電位で開催されました。 リチウムイオン（Li +）内向き電流を下向きにしています。破線は、「C」と「O N」クローズドとオープン状態を表すとそれぞれの現在の状態を示します。 （B）、観察されたENaC活性（ のNP O）の概要グラフ（部分的に許可を得て10から再生）。 * P <0.05 VEのRSU車両。 
図4：PCKラットの嚢胞細胞におけるカルシウム流入に対するATPの影響（A）嚢胞性単層の代表的な画像は、10μMのATPの適用前と後のFura-2 AMを負荷しました。 PCKラットとSD集合管（N = 38細胞）の細胞単層中のカルシウム濃度に対するATPの効果をまとめたグラフ。（B）嚢胞性単層は、10μMのATP及び要約グラフの適用前と後のFluo-8色素でロード細胞内カルシウム応答。
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Discussion
私たちは、ARPKDのマウス遺伝モデル由来嚢胞上皮単層に、ここで、従来のパッチクランプ法と落射蛍光カルシウムイメージングのアプリケーションを記述しました。プロトコルは、最も注意が嚢胞（プロトコルセクションのステップ1.5）の単離および電気生理学的研究に支払われるべき3つのステップで構成されています。これらのキーの手順では、広範囲の訓練と忍耐を必要とし、読者は一度挫折してはなりません。
まず、最も注意が嚢胞化単分子膜分離の過程に支払われるべきです。試料の厚さとガラスチップへの付着があっても、細胞の可視性のために重要であるとして、準備のこの部分は、さらなる作業を手動スキルと大きく影響する必要があります。孤立した嚢胞壁の厚さは、試料の異なる部分で変化し、それがWORに便利な大きな単層領域で大きな嚢胞に注力することをお勧めしますK。試料をきれいにし、単層にアクセスしやすくするために、周囲の組織は、実体顕微鏡下でピンセットで剥離する必要があります。それは技術が重要な被写界深度と解剖時にオブジェクトの様々なサイズに対応するために、広い範囲で倍率を変更する機能によって特徴づけられる高品質の実体顕微鏡の利用を意味することが強調されるべきです。この方法のもう1つの制限は、パッチクランプやカルシウムイメージングなどの洗練された技術は、これらの方法に精通している人材を必要とすることです。我々は、初期の経験は、彼らが嚢胞に似た上皮単層を形成するような市販の皮質M1として管細胞培養と髄質IMCD細胞を収集する上で得ることができることを示唆しています。
我々のアプローチは、イオンチャネル活性を測定し、新たに単離した組織のネイティブ環境での[Ca 2+] iのレベルができます。この方法の主な利点は、SINGLのための試料の調製であります電子チャネル解析や色素負荷は、機械的な手順または他の潜在的に有害なステップにダメージを与え、酵素処理を必要としません。これは、生理食塩水に鉗子を使用して手動で行われ、大きなダメージを受けていない試験片を提供しています。このような試料は、記載された技術のためだけでなく、使用することができます。実際には、分離された嚢胞上皮は純粋な尿細管細胞の薄膜を表し、生理学的に関連する観測値を生成し、リアルタイム実験のための貴重な無傷の対象になりますこれは、ネイティブの単層の特性を維持しています。嚢胞の単離は（ダクト尿細管皮質集合のためにここ38記載されているように、ディスパーゼ及びコラゲナーゼで、例えば）ハード研究者または嚢胞性組織の大量のための手順は、一度に酵素処理を必要とされているように思われる場合に使用することができます分離工程を簡略化します。酵素、特にプロテアーゼとして、この治療を行っている間しかし、研究者が大幅にイオンchanneに影響を与えることができ、非常に注意しなければなりませんLSの活動または膜受容体にダメージを与えます。これは、これらの膜タンパク質は、非常によく迅速に酵素処理39,40の下で分解することが知られているように、例えば、プリン作動性シグナル伝達の研究のために非常に重要です。
また、嚢胞上皮はこのような色素（例えばローダミンファロイジン）と固定された単層の免疫組織化学や染色など、他の目的に使用される、またはそのようにNO検出や各種染料用DAF-FMなどの細胞内物質マーカー、と新鮮な組織をロードすることができます活性酸素種の産生をモニターします。それは、全腎臓溶解産物中に存在する非特異的な要因の影響を排除するために、ウェスタンブロッティングのために単離された嚢胞上皮の純粋な画分を使用することが提案されています。また、嚢胞上皮は、同様に、マウスまたはARPKDだけでなく、様々なモデルの研究のために利用可能な他の種から単離することができることを示唆しているだけでなく、ADPKD。新たに単離した嚢胞標本は否定できない持っています培養嚢胞性細胞と比較して、分子生物学的ア プローチのための利点、彼らはより良い器官内嚢胞性組織の特性を維持するように、間違いなくin vivoでの疾患プロセスに関するより正当化データを提供します。
この技術の重要な利点の一つは、対照組織として、同じ腎臓、またはSDラット細管（これらのラットは、PCKラットでの遺伝的背景を共有する）から、通常の非拡張集合管を使用する可能性です。ネフロンセグメントにおける同様のパッチクランプやカルシウムの測定は、広く多くの研究室41-43で非嚢胞腎で使用されています。依存性イオンチャネル型、パッチクランプ法の種々の修飾は、（全細胞、インサイドアウト、アウトサイドアウト）を使用することができます。例えばするENaCおよびROMK（腎髄質外カリウムチャンネル）の活性は、全細胞構成44,45によって評価することができます。 monocと広視野落射蛍光で提案されたのFura-2 AMのカルシウムイメージングhromatorはまた、他のカルシウム色素と共焦点または二光子顕微鏡による解析カルシウムイメージングの他の同様の修正を行うことができます。これらの顕微鏡システムは少ない手頃な価格ですが、高品質の画像を提供し、広視野顕微鏡よりも敏感です。同様のアプローチは、新たに単離された糸球体17,46,47の足細胞でTRPCチャネル活性及びカルシウムシグナル伝達を研究するために適用されました。 FLUO4 / FuraRed蛍光色素で図4Bまたはレシオメトリック共焦点測定に実証されるようにIlatovskayaに記載のように適用することができる他のカルシウムイメージングらのFluo-8の利用を含む。46技術的には、パッチクランプおよびカルシウムイメージングの両方を行うことが可能です同時に同じセルに顕微鏡は、両方のセットアップが装備されている場合。したがって、記載された技術は、柔軟番目に応じて変更することができるPKDの分野において、高品質の観測のための実行可能なアプローチは、ありますあなたの特定の研究や機器の可用性の電子ニーズ。さらに、カルシウムイメージングの種々の変形は 、図4Bに示されているように、またはのFluo-8（Ilatovskaya ら 46に記載されるように）FLUO4 / FuraRed蛍光色素でレシオメトリック共焦点測定を含む、ここで用いることができます。
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Acknowledgments
著者は、顕微鏡実験で優れた技術支援のためにグレン・スローカム（ウィスコンシン医科大学）とコリーンA.ラビン（ニコンインスツルメンツ社）を感謝したいと思います。この研究は、（OPO）はアメリカ心臓協会13GRNT16220002、（TSP）に国立衛生研究所（TSPに）R01 HL108880（AS）は、（OPO）にR01 DK095029とK99 HL116603を付与し、国立腎臓財団IG1724によってサポートされていましたし、 （DVI）に米国腎臓学会からベン・J・リップス研究フェローシップ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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