Summary
Canais de iões expressas em epitélio tubular renal, desempenha um papel significativo na patologia da doença poliquística do rim. Aqui nós descrevemos protocolos experimentais utilizados para a realização de análises e medições de nível de cálcio intracelular de patch-clamp no epitélio cístico recentemente isoladas de rins de roedores.
Abstract
Iniciação cisto e expansão durante a doença renal policística é um processo complexo, caracterizado por anormalidades na proliferação celular tubular, acúmulo de líquido luminal e formação de matriz extracelular. Atividade de canais iônicos e sinalização intracelular de cálcio são parâmetros fisiológicos fundamentais que determinam funções do epitélio tubular. Foi desenvolvido um método adequado para observação em tempo real da actividade de canais de iões com a técnica de patch-clamp e registo de Ca2 + intracelular em monocamadas epiteliais nível isolados de fresco a partir de quistos renais. PCK ratos, um modelo genético de doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR), foram usados aqui para ex vivo análise de canais iônicos e fluxo de cálcio. Aqui descrito é um procedimento detalhado passo-a-passo projetado para isolar monocamadas cística e túbulos não dilatado de PCK ou ratos normais Sprague Dawley (SD), e monitorar a atividade de canal único e de Ca 2+ intracelular dinâmica.Este método não exige processamento enzimático e permite a análise de uma configuração nativa isolada de fresco de monocamada epitelial. Além disso, esta técnica é muito sensível a alterações de cálcio intracelular e gera imagens de alta resolução para medições precisas. Finalmente, isolado epitélio cística pode ser ainda utilizado para a coloração com anticorpos ou corantes, preparação de culturas primárias e purificação por vários ensaios bioquímicos.
Introduction
Canais de iões desempenhar um papel importante em muitas funções fisiológicas, incluindo crescimento e diferenciação celular. Doenças policística dominante autossómica recessiva e nos rins (ADPKD e ARPKD, respectivamente) são doenças genéticas caracterizadas pelo desenvolvimento de quistos renais cheios de fluido da origem nas células epiteliais tubulares. ADPKD é causada por mutações de genes PKD1 ou PKD2 codificam polycystins 1 e 2, proteínas de membrana envolvidas na regulação da proliferação e diferenciação celular. PKD2, por si só ou como um complexo com PKD1, também funcionar como um catião de Ca2 + -permeable canal 1. As mutações do gene que codifica PKHD1 fibrocystin (uma proteína do tipo receptor-associado cílios envolvidos na tubulogenesis e / ou manutenção da polaridade do epitélio) são o impulso genética da ARPKD 2. Crescimento do cisto é um fenômeno complexo, acompanhado de proliferação perturbado 3,4, angiogênese 5, desdiferenciação e perda de polardade de células tubulares 6-8.
Reabsorção defeituoso e secreção aumentada no epitélio cístico contribuir para o acúmulo de líquido no lúmen e cisto expansão 9,10. Fluxo-dependente prejudicada [Ca2 +] i sinalização também tem sido associada a cistogénese durante PKD 11-15.
Aqui, nós descrevemos um método adequado para medições de patch-clamp da actividade do canal único e níveis intracelulares de Ca 2+ em monocamadas epiteliais císticas isolados de ratos PCK. Este método foi aplicado com sucesso por nós para caracterizar de actividade do canal de Na + epitelial (ENaC) e 10 [Ca 2+] i induzidas por processos dependentes de Ca 2+ e TRPV4 -permeable purinérgico cascata de sinalização 13.
Nestes estudos utilizou-se ratos PCK, um modelo de ARPKD causada por uma mutação espontânea no gene PKHD1. A cepa PCK foi originally derivada a partir de ratos 16 ratos SD, assim, são utilizados como um controlo apropriado para comparação com a estirpe PCK Sprague-Dawley (SD). Como resultado, ambos os segmentos dos néfrons de ratos SD e dutos não dilatado coleta isolados de ratos mesmas PCK pode servir como dois grupos de comparação diferentes para fazer experimentos sobre epitélio cística.
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Protocol
Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional no Medical College of Wisconsin e University of Health Science Center Texas em Houston e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1 demonstra os passos principais do processo de isolamento e processamento do tecido. Resumidamente, os rins de ratos SD ou PCK são utilizados para o isolamento manual das monocamadas epiteliais de recolha de condutas, quer a partir de túbulos ou cistos não-marcado saudáveis. Aqui nós estudados rins de 4-16 semanas de idade ratos PCK 10,13.
1. Isolamento de renais Cistos e Palhinha Conexão (CNT) / ductos coletores (CD) Segmentos
- Anestesiar animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade O 2 ou outro método aprovado. Os animais devem ser continuamente monitorado para garantir le adequadavel da anestesia. Reação taxa e toe pitada respiratório estável são utilizados para confirmar a anestesia adequada.
- Execute laparotomia e liberar os rins com tampão fosfato salino (PBS) através da aorta abdominal 17.
- Prepare um cateter tubo de polietileno (PE50) e conectá-lo a uma bomba de seringa preenchida com PBS. Corte a pele e parede abdominal ao longo da linha alba, em seguida, fazer uma incisão abdominal transversa através do abdômen de lado a lado e deslocar os órgãos abdominais com cotonetes para obter o acesso à aorta descendente com ramificações mesentéricas e celíacas artérias. Umedeça os órgãos internos com solução salina quente durante procedimentos adicionais para impedir a sua secura.
- Coloque uma ligadura (# 1) em torno das artérias mesentéricas e celíacas e outra ligadura (# 2) em torno da aorta sob o diafragma (não amarrar). Delicadamente separar a. abdominalis por Blunt dissecar os tecidos conectivos em torno dela com uma pinça fina e colocar duas ligaduras ~ 3mm abaixo da artéria renal esquerda (# 3) e acima da bifurcação artérias ilíacas (# 4).
- Amarre ligadura # 4 e anexar uma braçadeira navio ao redor da aorta, entre a artéria renal esquerda e ligadura # 3. Faça uma incisão entre o grampo e ligadura # 4 a cateterização da aorta, use ligadura # 3 para fixar firmemente o cateter.
- Solte a braçadeira e certifique-se que o pulso de sangue é visível no cateter para garantir a instalação adequada. Comece a perfusão a um caudal de 6 ml / min, o laço ligaduras # 1 e # 2, e cortar a veia renal esquerda. Continue lavando por 1-2 min até que os órgãos estão completamente empalideceu.
- Corte vasos sanguíneos renais, uretra e que cercam tecidos conjuntivos e adiposas com uma tesoura para recolher os rins. Em seguida, faça uma pequena lágrima em cápsula renal e descasque os rins a decapsulate-los. Colocar os rins em PBS gelado. Eutanásia é confirmada através de uma toracotomia.
- Prepare 5 x 5 mm chips de vidro de cobertura revestidas com poli-L-lisina. Corte uma tampa glass com um lápis e diamante lugar aproximadamente 20 ul de solução esterilizada por filtração de poli-L-lisina em cada chip de vidro de 0,01%. Prepare salina e duas pinças de relojoeiro para dissecção.
- Cortar os rins com uma lâmina de barbear ao longo do plano frontal em fatias de ~ 1-2 mm de espessura. Coloque uma das fatias sob um microscópio estereoscópico. Isolamento de tecidos deve ser feito em solução salina gelada.
- Localize cistos sob microscópio estereoscópico como cavidades em forma redonda (Figura 2A); suas paredes contêm frequentemente proeminente rede de vasos sanguíneos proliferaram. Utilizando uma pinça de ponta fina dissecar a camada epitelial interno de um quisto tão fino quanto possível para obter uma área de monocamada. Una-o a um chip de vidro cobertos com poli-L-lisina. Pegajosa superfície Poli-L-Lisina permite ao pesquisador posicionar firmemente a camada interna cisto no vidro. Exponha o cisto com o lado apical para fornecer acesso para as pipetas (Figura 2B).
- Use PCK ou SD rato criançafatias centrais ney contendo papila para o isolamento de não dilatados CNT / CCDsegments 18-21.
NOTA: tecidos papilares são mais duráveis do córtex e segurando faixas tubulares papilar, com uma pinça e rasgando ao longo eixo radial a fatia pode ser clivada em setores finas. Túbulos individuais são visíveis e podem ser puxado para fora para ser colocado em chips de vidro capa. - Identificar os segmentos CNT / CCD por bifurcações, maior transparência do que túbulos proximais e células proeminentemente visíveis grandes (Figura 2C). Coloque o chip de vidro com tampa túbulos anexados sob um microscópio equipado com micromanipuladores adequadas para micropipetas condução. Usando micropipetas afiadas túbulos split-abertos e anexar suas bordas ao vidro para tornar a superfície apical acessível (Figura 2D).
Eletrofisiologia 2. Single Canal patch-clamp
- Encha a câmara de patch-clamp com solução de banho e transfira o chip tampa de vidrocom tecidos isolados para a câmara. Certifique-se de que as micropipetas de patch-clamp têm resistência de 10/07 mohms para medições confiáveis sobre células-anexado (celulares).
- Para as medições ligado de células, definir a relação de ganho do amplificador de 20x e de baixo passar as correntes em 300 Hz por um filtro de oito pólos Bessel. Para a monitorização canais ENaC, usar uma solução de banho, em mM: NaCl 150, CaCl2 1, MgCl2 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipeta: 140 LiCl, 2 de MgCl2 e 10 HEPES (pH 7,4).
- Realizar um experimento patch-clamp convencional em um modo ligado à célula 10. Seleccionar uma célula na monocamada epitelial e aproximar a pipeta para a membrana apical. Formar uma vedação de alta resistência entre uma pipeta e membrana celular através da aplicação de sucção suave. Uma vez que um selo gigaohm resistente de alta é formado, um protocolo livre de gap em um potencial de realização deve ser iniciado para a atividade de monitoramento do canal de interesse.
- Loja gap-livres únicos dados atuais do canal de gigaSelos Ohm para análise posterior. Analisar os eventos de canal utilizando um pacote de software geralmente fornecidos com configurações de patch-clamp 18. Calcular a actividade de canal como npo em que N se refere ao número de canais activos na amostra e P é o probabilidade média aberta dos canais.
NOTA: Use cistos isolados ou túbulos em experimentos de patch-clamp para não mais de 30 min.
3. Raciometrico epifluorescência Medidas de intracelular concentração de cálcio nas células epiteliais
- Use 5 mM Fura-02:00 dissolvido em DMSO. Solução estoque alíquota em 500 mL tubos cônicos individuais (cerca de 10 mL). Proteger da luz e armazenar no congelador a -20 ° C por até seis meses.
- Incubar cistos isolados e túbulos dividir-aberto para 30-40 min no PSS (em mM: NaCl 145, KCl 4,5, 2 MgCl2, CaCl2 2 e 10 HEPES a pH 7,35) contendo 5 mM Fura-02:00 corante e 0.05% de ácido plurónico para ajudar a dispersar os ésteres de acetoximetilo. Para que, no lugar dos tecidos 3,5 cm de placa de carregamento cocktail contendo, proteger da luz e incubar num agitador lento à temperatura ambiente.
- Mudar Fura-2 AM contendo meios para limpar PSS após incubação e colocar o tecido sob um microscópio para executar mais imagiologia de epifluorescência.
- Ligue câmara CCD e fonte de luz estável (sistema de monocromador) equipado com roda de filtro (cada posição do filtro pode ser associado com o seu próprio nível de atenuação, seleccionado cada vez que o filtro é chamado).
- Encontre o tecido no campo brilhante. Mudar para detecção do sinal de fluorescência e ajustar a intensidade da fonte de luz usando filtros de densidade neutra e potência da lâmpada para evitar a saturação do sinal.
- Monitorar Fura-2 AM de fluorescência na amostra de tecido com excitação a 340/380 nm raciométrica com uma frequência de 0,125 Hz ou superior. Use um / NA 1.3 ou similar lente objetiva de 40 × para resolu adequadação imagem.
- Para o processamento e cálculos imagem importar a seqüência de imagens. Certifique-se de dividir os canais e usar um modo hyperstack em tons de cinza. Seleccione várias regiões de interesse (células únicas quisto ou áreas seleccionadas de tecido cístico) e o cálculo dos valores de intensidade para cada um dos canais (340 e 380 nm) para o software de análise de dados preferido; valores de intensidade fundo subtrair de cada ponto de dados.
- Para cada ponto de tempo de calcular a relação entre as intensidades de Fura-2 AM 340 a 380 canais. Gráfico de dispersão / linha mudanças em tempo ponto de Ca 2+ transitória para cada região e calcular valores médios / SE.
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Representative Results
Potencial envolvimento ENaC em cistogénese tem sido demonstrada em vários estudos que observadas factor de crescimento epidérmico interrompido (FEG) de sinalização na progressão de PKD 22-25 e a reabsorção de sódio anormal na ARPKD modelos murinos e de culturas de tecidos 26-28. Por exemplo, Veizis et al. Mostraram que a absorção sensíveis ao amiloride Na + é diminuída em células CD a partir do modelo não-ortólogas rato BPK de ARPKD 29. Nós demonstramos recentemente que prejudicada reabsorção de sódio e água em cistos é um fator importante no agravamento cistogénese 10. Especificamente, utilizamos a análise eletrofisiológica e imuno-histoquímica e descobriu que cistos exercer a reabsorção de sódio embotada. Uma abordagem farmacológica demonstraram que o bloqueio selectivo ENaC agrava significativamente a progressão cisto 10.
Demonstramos ainda mais o efeito da administração de benzamil, um bloqueador ENaC, oN actividade dos canais na parede do cisto. 4 semanas de idade os ratos foram PCK fornecido com o veículo ou água contendo benzamilo (15 mg / ml) de beber ad libitum. Após 12 semanas de tratamento, os animais foram tratados de acordo com o protocolo descrito acima. Patch-clamp foi realizada sobre as monocamadas císticas isoladas de veículo e benzamilo grupos tratados. A Figura 3 mostra vestígios de corrente representativa da actividade de ENaC gravado a partir de membranas apicais. O gráfico demonstra que a actividade resumo média ENaC (NP S) foi de 0,91 ± 0,15 10 nos cistos de grupo de controlo, enquanto que a administração benzamilo diminuiu a actividade do canal para 0,32 ± 0,05. Concluímos que, em ARPKD (caracterizada por distensão de êxtase de CDs para formar numerosos cistos renais fusiformes 30) benzamil dada na água potável atinge cistos renais com o fluxo de urina 30. Este efeito permite benzamilo para diminuir a recaptação de sódio a partir de fluido do cisto, contr ibuting para cistogénese 10.
Em adição à via de EGF, o trifosfato de adenosina (ATP) e outras purinas também foram identificados como um componente crítico parácrina de sinalização que é modulada de forma inadequada em modelos de PKD e em doentes com esta doença. Foi relatado que a sinalização purinérgico desempenha um papel importante em ambos cistogénese durante ADPKD e ARPKD 31,32. Cisto células de ratos PCK tenham sido previamente mostrado para exibir baixo basal [Ca2 +] i e perda de fluxo-mediada [Ca2 +] i sinalização em comparação com não-saudáveis dilatados dutos coletores de ratos SD 13. Agonistas do receptor p2 modular o desenvolvimento de quistos renais num modelo in vitro de formação de cistos derivado do rato cpk / CPK 33. ATP concentração elevada foi encontrada no líquido cística de pacientes DPRAD 34 e em meios condicionados por epitélios renais císticas cultivadas a partir de ratos cpk / CPK 35.
_content "> Testamos fluxo de cálcio em resposta à administração de ATP exógeno. cistos PCK e condutas corticais normais de ratos SD foram isolados para as medições de cálcio antes e após a aplicação de 10 uM de ATP. Os dados ilustrados na figura 4, revelam o efeito de 10 uM de ATP nos túbulos císticas de ratos PCK estudado com duas abordagens diferentes: a Figura 4A mostra as medições de Fura-2:00 intensidade de fluorescência a 340 e 380 nm numa configuração de epifluorescência equipado com um monocromador, e a Figura 4B representa registo de Fluo-8 coloração corante com confocal microscopia. Ambas as técnicas demonstrar cinética semelhante de cálcio resposta transitória do ATP para aplicação no epitélio cística 10.
Figura 1:. Representação esquemática do protocolo experimental Apóso animal está devidamente anestesiados e preparados para a cirurgia, os rins são lavadas com PBS para remover o sangue. Então, os rins são excisadas, decapsulated, e monocamadas cística ou túbulos não dilatada são isolados manualmente com uma pinça sob um microscópio estereoscópico. Túbulos não dilatados são divididos-aberto com micropipetas impulsionado por micromanipuladores enquanto epitélio cística como a superfície interna dos cistos seria aberta para ter acesso ao lado apical.
Figura 2: Isolamento e preparação de monocamadas ducto cístico e coleta de (A) Uma fatia representativa de rim a partir de 16 semanas de idade rato PCK.. (B) uma monocamada cística num chip tampa de vidro transferido para um microscópio de análise de patch-clamp de cálcio ou de imagem (60X). Segmento / CCD (C) Um CNT com bifurcação a partir de um isolado de rato SD. ( 
Figura 3: Efeito do tratamento sobre a actividade ENaC benzamilo no epitélio cística. (A) os traços atuais representativos para a atividade ENaC medido em celulares ligados manchas de cistos recentemente isolados a partir de 16 semanas de idade ratos PCK administrado 12 semanas de benzamil na água potável. Essas manchas foram realizadas em um potencial teste de V h = -V p = -40 mV. Inward correntes Li + são para baixo. As linhas a tracejado indicam o respectivo estado actual com um "C" e "o n" denota os estados fechado e aberto. (B) Resumo gráfico de atividade observada ENaC (NP o) (parcialmente reproduzida de 10 com permissão). * P <0,05 veRSUs veículo. 
Figura 4: Efeitos do ATP sobre o influxo de cálcio nas células císticos dos ratos PCK (A) Imagens representativas de monocamada cística carregadas com Fura-2 AM, antes e após a aplicação de 10 uM de ATP.. Gráfico sumarizando o efeito de ATP em níveis de cálcio na monocamada de células de ratos PCK e SD recolha de condutas (n = 38 células). (B) monocamada cística carregado com Fluo-8 corante antes e depois da aplicação de 10 mM de ATP e resumo gráfico de resposta de cálcio intracelular.
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Discussion
Descrevemos aqui aplicações da técnica de patch-clamp convencional e imagiologia de epifluorescência cálcio para monocamadas epiteliais císticas derivados de um modelo murino de ARPKD genética. O protocolo consiste em três etapas, das quais a maior atenção deve ser dada ao isolamento dos cistos (passo 1.5 da seção de protocolos) e aos estudos eletrofisiológicos. Estes procedimentos fundamentais requerem treinamento extenso e paciência, eo leitor não deve ser frustrado ao mesmo tempo.
Primeiro de tudo, o mais atenção deve ser dada ao processo de isolamento cisto monocamada. Esta parte da preparação requer habilidades manuais e impacta significativamente os trabalhos futuros, como a espessura da amostra e seu mesmo apego a um chip de vidro é fundamental para a visibilidade das células. Espessura da parede dos cistos isolados varia em diferentes partes do espécime, e recomenda-se a se concentrar em cistos maiores, com maiores áreas de monocamada convenientes para work. Para ajudar a limpar a amostra e acessar a monocamada, tecidos circundantes devem ser descascados com uma pinça sob um microscópio estereoscópico. Deve ser enfatizado que a técnica implica a utilização de um microscópio estereoscópico de alta qualidade caracteriza-se por uma profundidade de campo e uma significativa capacidade para alterar a ampliação de uma vasta gama para acomodar diferentes tamanhos de objectos durante a dissecção. Uma outra limitação do método é que tais técnicas sofisticadas como patch-clamp e imagiologia de cálcio requerem pessoal familiarizado com estes métodos. Sugerimos que a experiência inicial pode ser obtido na coleta de culturas de células do duto, como comercialmente disponíveis células M1 e IMCD medular corticais como eles formam monocamada epitelial semelhante ao cistos.
Nossa abordagem permite medir a atividade canais iônicos e [Ca 2 +] i níveis no ambiente nativo de tecidos recentemente isolados. A principal vantagem deste procedimento é que a preparação de espécimes para singlanálise de e-canal ou corante de carga não necessita de tratamento enzimático, danificando procedimentos mecânicos ou outros passos potencialmente prejudiciais. É realizada manualmente com uma pinça em solução salina e fornece grandes espécimes não danificadas. Tais amostras podem ser usadas não só para as técnicas descritas. Na verdade, isolado epitélio cística representa película fina de células tubulares puras e mantém as propriedades monocamada nativas, que faz com que seja um objecto intacta valiosa para experiências em tempo real que produz fisiologicamente observações pertinentes. Se o isolamento de cistos parece difícil um procedimento para o pesquisador ou uma grande quantidade de tecido cístico é necessária de uma só vez, o tratamento enzimático (por exemplo, com dispase e colagenase, tal como descrito aqui 38 para o coletor cortical túbulos duto) pode ser utilizada para simplificar o processo de isolamento. No entanto, o pesquisador deve ter muito cuidado ao realizar este tratamento, como enzimas, principalmente proteases, podem afetar significativamente channe ionatividade 'ls ou danificar os receptores de membrana. Este é, por exemplo, muito importante para os estudos de sinalização purinérgico, uma vez que estas proteínas de membrana são muito bem conhecidos por degradar rapidamente sob tratamento enzimático 39,40.
Para além disso, o epitélio cística pode ser usado para outros fins, tais como imuno-histoquímica, ou a coloração de uma monocamada fixo com corantes (por exemplo, faloidina com rodamina), ou o carregamento do tecido fresco com marcadores de substâncias intracelulares, tais como DAF-FM para a ausência de detecção ou vários corantes às monitorar a produção espécies reativas de oxigênio. Sugere-se usar a fração de pura isolado epitélio cístico para borrar ocidental para eliminar o impacto de fatores não-específicos presentes em lisados totais nos rins. Também sugerem que o epitélio cística pode ser igualmente isolado a partir de murganhos ou outras espécies que estão disponíveis para os estudos de vários modelos de ARPKD não só, mas também ADPKD. Espécimes de cistos recentemente isolados têm indubitavelmentevantagens para a biologia molecular abordagens comparação com as células cultivadas cística, uma vez que melhor manter as propriedades do tecido cístico dentro do órgão, e, sem dúvida, proporcionar dados mais justificada quanto os processos patológicos in vivo.
Uma das vantagens significativas desta técnica é a possibilidade de usar (o fundo genético nestes ratos compartilhar com ratos PCK) Normal não-dilatado recolha de condutas a partir dos mesmos, ou rins de ratos SD túbulos, como tecidos de controlo. Similar patch-clamp e cálcio medições em segmentos do néfron são amplamente utilizados em rins não-císticas em muitos laboratórios 41-43. Dependendo ião tipo canais, diferentes modificações do método de patch-clamp podem ser utilizados (de células inteiras, de dentro para fora, no exterior-fora); por exemplo, ENaC e ROMK (canal medular exterior renal de potássio) a actividade pode ser avaliada pela configuração de célula inteira 44,45. A imagem de cálcio Fura-02:00 proposto na epifluorescência de campo amplo com monochromator pode também ser realizado com qualquer outra modificação semelhante de imagiologia de cálcio, tais como a análise com microscopia confocal ou dois fotões com outros corantes de cálcio. Estes sistemas de microscopia são menos acessíveis, mas fornecer imagens de qualidade superior e são mais sensíveis do que a microscopia de campo amplo. Uma aproximação similar foi também utilizada para estudar a actividade de canais de trpC e sinalização de cálcio em podócitos isolada de fresco de glomérulos 17,46,47. Outras imagens de cálcio que poderia ser aplicada incluem a utilização de Fluo-8 como demonstrado na Figura 4B ou medição confocal raciométrica com Fluo4 / corantes fluorescentes FuraRed como descrito no Ilatovskaya et al. 46 Tecnicamente, é possível executar tanto de patch-clamp e imagiologia de cálcio simultaneamente na mesma célula se microscópio é equipado com duas configurações. Assim, a técnica descrita é uma abordagem viável para a observação de alta qualidade no campo de PKD, que pode ser flexivelmente modificado de acordo com the necessidades de sua pesquisa e disponibilidade do equipamento específico. Além disso, várias modificações de imagiologia de cálcio podem ser utilizados aqui, incluindo as medições confocais raciométrica com Fluo4 / corantes fluorescentes FuraRed (como descrito em Ilatovskaya et ai. 46) ou de Fluo-8 como demonstrado na Figura 4B.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 HL108880 (a AS), R01 DK095029 (para OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (para OPO) e o Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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