Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

doi: 10.3791/53035 Published: September 1, 2015

Summary

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Abstract

Polikistik böbrek hastalığı sırasında Kist başlatma ve genişletme tübüler hücre çoğalması, lümen sıvı birikimi ve hücre dışı matriks oluşumu anormallikleri ile karakterize karmaşık bir süreçtir. Iyon kanalları ve hücre içi kalsiyum sinyalizasyon aktivitesi tübüler epitelyum işlevlerini belirleyen temel fizyolojik parametrelerdir. Biz taze böbrek kistleri izole epitel mono tabakaları hücre içi Ca 2 + düzeyinin patch-kelepçe tekniği ve kayıt iyon kanalları aktivitenin gerçek zamanlı gözlem için uygun bir yöntem geliştirdi. PCK sıçan, otozomal resesif polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek hastalığı) genetik bir modelidir, iyon kanalları ve kalsiyum akışının ex vivo analiz için kullanılmıştır. Burada anlatılan tek kanal aktivitesini ve hücre içi Ca + 2 dinamiklerini kistik mono tabakaları ve PCK veya normal Sprague Dawley (SD) sıçanların olmayan dilate tübüller izole ve izlemek için tasarlanmıştır ayrıntılı bir adım-adım bir yöntemdir.Bu yöntem, enzimatik işleme gerektiren ve taze izole epitel Tek tabakalı bir yerli ortamda analiz izin vermez. Ayrıca, bu teknik, hücre içi kalsiyum değişikliklere çok duyarlı olduğu ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir. Son olarak, izole edilmiş bir kistik epitel Antikorların ya da boyalar, çeşitli biyokimyasal deneyler için birincil kültürleri hazırlanması ve saflaştırılması ile lekeleme için kullanılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İyon kanalları, hücre büyümesi ve farklılaşması dahil olmak üzere bir çok fizyolojik işlevler, önemli bir rol oynamaktadır. Otozomal dominant ve resesif polikistik böbrek hastalığı (sırasıyla ADPKD ve ORPBH) tübüler epitel hücre kökenli böbrek sıvı dolu kistlerin gelişimi ile karakterize genetik bozukluklardır. Polikistik böbrek polycystins 1 ve hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde rol oynayan 2, zar proteinlerini kodlayan PKD1 ya PKD2 genlerin mutasyonu neden olmaktadır. Kendi başına veya PKD1 ile bir kompleks olarak PKD2 da Ca2 + geçirgen katyon kanalı 1 olarak işlev görür. PKHD1 kodlayan genin Fibrosistin (tubulogenesis ve / veya epitel polarite devamını sağlayan bir kirpikler ilişkili reseptör benzeri protein) mutasyonları ORPBH 2 genetik ivme bulunmaktadır. Kist büyümesi karmaşık bir fenomen rahatsız çoğalması 3,4, anjiyogenez 5 dediferansiyasyon ve kutupsal kaybı eşlik etmektedirtübüler hücrelerin 6-8 lık.

Kistik epitel Arızalı reabsorbsiyon ve artırılmış salgı lümen ve kist genişlemesi 9,10 sıvı birikimine katkıda bulunur. Bozulmuş akım bağımlı [Ca 2 +] i sinyal de PKD 11-15 döneminde cystogenesis ile bağlantılı olmuştur.

Burada, tek bir kanal aktivitesi ve PCK sıçanlardan izole edilen kistik epitel mono tabakaları, hücre içi Ca + 2 seviyeleri patch-clamp ölçümleri için uygun bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, başarılı bir epitelyal Na + kanalı (ENaC) 10 aktivitesinin karakterize edilmesi için tarafımızdan uygulandı ve [Ca2 +] i Ca2 + geçirgen TRPV4 ve purinerjik sinyal kaskadı 13 tarafından uyarılan işlemleri bağımlı.

Bu çalışmalarda, biz PCK fareleri PKHD1 geninde kendiliğinden mutasyon nedeniyle ORPBH bir model kullanılır. PCK zorlanma originall olduSprague-Davvley (SD) sıçanlarda 16 böylece SD sıçanlarına PCK soyu ile karşılaştırma için uygun bir kontrol olarak kullanılır türetilen y. Bunun bir sonucu olarak, aynı PCK sıçanlardan izole edilen sıçan SD nefron segment ve Genişletilmemiş toplama kanalları hem kistik epitelyum üzerinde deneyler için iki farklı karşılaştırma grupları olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Wisconsin ve Houston Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi Tıp Koleji'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi. Şekil 1 doku izolasyon ve işleme prosedürünün ana adımları gösterir. Kısaca, PCK veya SD sıçanların böbrekleri sağlıklı olmayan aranan tübüllerden veya kistleri ya oluklar toplama epitel mono tabakaları elle izolasyonu için kullanılır. Burada 4-16 hafta eski PCK sıçanlar 10,13 böbreklerin okudu.

1. Böbrek Kist ve Bağlantı Pipet (CNT) / İzolasyonu Toplama Kanalları (CD) Kesimleri

  1. Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. Hayvanlar sürekli olarak yeterli le sağlamak için izlenmesi gerekirAnestezi vel. Kararlı solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır.
  2. Laparotomi gerçekleştirin ve abdominal aort 17 ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile böbreklerin yıkayın.
    1. Polietilen boru kateteri (PE50) hazırlayın ve PBS ile dolu bir şırınga pompası bağlayın. Yan ve mezenterik ve çölyak arterler dallanma ile inen aorta erişmek için pamuklu karın organları kaydırmaya taraftan karın karşısında çapraz karın bir kesi yapmak, sonra linea alba boyunca cilt ve karın duvarı kesti. Onların kuruluğunu önlemek için daha fazla işlemler sırasında ılık serum fizyolojik ile iç organları nemlendirin.
    2. Tek mezenterik ve çölyak arterler etrafında bitişik harfleri (# 1) ve başka bitişik harfleri (# 2) diyaframın altında aort etrafında (kravat yok) yerleştirin. Yavaşça bir ayrı. İnce forseps ile çevresindeki bağ dokuları diseksiyon ve iki bitişik harfler koyun künt tarafından abdominalis ~ 3Sol renal arter altına mm (# 3) ve iliak arterler bifurkasyon yukarıda (# 4).
    3. Bağ 4. Kravat ve sol renal arter ve bağ # 3 arasında aort etrafında bir gemi kelepçe takın. Sıkıca kateter düzeltmek için bağ 3. kullanın, kelepçe ve aorta kateterizasyonu bağ 4. arasında bir kesi yapmak.
    4. Kelepçe bırakın ve kan nabız düzgün yüklenmesini sağlamak için kateterin görünür olduğundan emin olun. 6 ml 'lik bir oranda perfüzyon başlayın / dak, alaşımlar # 1 ve # 2 kravat ve sol renal damar kesilir. Organlar tamamen beyazlatılmış kadar 1-2 dakika süreyle yıkamaya devam edin.
    5. Makasla böbrek kan damarları, üretra ve çevresindeki bağ ve yağ dokuları kesmek böbrekleri toplamak. Ardından böbrek kapsülü kısa gözyaşı yapmak ve bunları açarlar için böbrekleri soyun. Buz soğukluğunda PBS içine böbrekler yerleştirin. Ötenazi bir torakotomi ile teyit edilir.
  3. Poli-L-lisin ile kaplanmış 5 x 5 mm cam kapak fiş hazırlayın. Bir kapak GLA Cutbir elmas kalem ve yerine, her bir cam çip üzerine% 0.01 steril filtre edilmiş Poli-L-Lizin çözeltisi, yaklaşık 20 | il ile ss. Tuzlu ve diseksiyon için saatçi forseps iki çift hazırlayın.
  4. 1-2 mm kalınlığında dilimler halinde ~ arasında frontal düzlem boyunca bir jiletle böbrekler kesin. Bir stereomikroskop altında dilim birini yerleştirin. Dokuların izolasyonu buz gibi soğuk tuzlu su içinde yapılmalıdır.
  5. Yuvarlak şekilli boşlukların (Şekil 2A) gibi bir stereomikroskop altında kist bulun; duvarları genellikle çoğaldı kan damarlarının belirgin ağını içerir. Kullanımı ince uçlu forseps bir tek tabakalı alanı elde etmek mümkün olduğunca ince bir kist iç epitel tabakası teşrih. Poli-L-lisin ile kaplanmış cam bir çip için takın. Sabit Poli-L-Lizin yüzey araştırmacısı sıkıca camına iç kist tabakası konumlandırmak sağlar. Pipetler (Şekil 2B) için erişim sağlamak için apikal yüzü yukarı bakacak şekilde kist Açığa.
  6. PCK veya SD sıçan çocuk kullanınolmayan dilate CNT / CCDsegments 18-21 izolasyonu için papilla içeren ney merkez dilim.
    Not: Papiller dokular korteks az ve forseps ile papiller boru şekilli bantlar tutarak ve dilim ince sektörlere bölünebilen ekseni radyal boyunca yırtılarak daha dayanıklıdırlar. Bireysel tübüller görünür ve kapak cam yongaları yerleştirilmek üzere dışarı çekilebilir.
  7. , Bifurkasyonlarında tarafından proksimal tübüllerin ve büyük belirgin görünür hücreler (Şekil 2C) daha yüksek şeffaflık CNT / CCD kesimleri belirleyin. Mikropipetler sürüş için uygun mikromanipülatörler ile donatılmış bir mikroskop altında ekli tübüllere ile cam kapak çipi yerleştirin. Cama onların kenarları keskin Mikropipetler bölünmüş açık tübüllerine kullanma ve takın (Şekil 2B) apikal yüzey erişilebilir hale getirmek için.

2. Tek Kanallı Patch-kelepçe Elektrofizyoloji

  1. Banyo solüsyonu ile yama-kelepçe odasına doldurun ve kapak cam çip transferiodasına izole edilmiş dokular ile. Patch-kelepçe mikropipetler güvenilir on-hücre (hücre-bağlı) ölçümler için 7-10 M? Direncini sahip olduğundan emin olun.
  2. Hücre bağlı ölçümler için, 20x'e amplifikatör kazanç oranını ayarlamak ve sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir. ENaC kanallarının izlenmesi için, mM banyo çözeltisi, kullanın: 150 NaCI, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4); Pipet: 140 LiCİ, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4).
  3. Bir hücre bağlı modda 10 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Epitel Tek tabakalı bir hücre seçin ve apikal membran pipet yaklaşım. Hafif bir emme uygulayarak bir pipet ve hücre zarı arasında sıkı bir dirençli sızdırmazlık elemanı oluşturmaktadır. Yüksek dirençli gigaohm kapatmanın meydana getirildiği zaman, bir tutma potansiyelinde bir boşluk içermeyen bir protokol ilgi kanalının izlenmesi aktivitesi için başlanmalıdır.
  4. Giga gelen mağaza boşluk içermeyen tek kanallı güncel verilerSonraki analiz için Ohm mühürler. Genellikle yama-kelepçe kurulumları 18 ile sağlanan bir yazılım paketi kullanarak kanal olayları analiz. Kanalların ortalama açık olasılık N yama ve P o aktif kanal sayısına atıfta nerede NPO olarak kanal aktivitesini hesaplamak olduğunu.
    NOT: en fazla 30 dakika süreyle patch-clamp deneyleri izole kist veya tübüller kullanın.

Epitel hücrelerinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 3. oranlı metrik Epifloresans Ölçümleri

  1. DMSO içinde çözülmüş 5 mM, Fura-2AM kullanın. Bireysel 500 ul konik tüpler içine kısım stok çözeltisi (yaklaşık 10 ul). Altı aya kadar -20 ° C'de derin dondurucuda ışık ve mağaza koruyun.
  2. PSS 30-40 dakika süreyle izole kistleri ve split-açık tübüller inkübe (mM: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 ve pH 7.35 10 HEPES) 5 uM Fura-2:00 boya ve 0.0 içeren% 5 pluronik asit asetoksimeti esterleri dağıtmak yardımcı olur. Bunun için, yükleme kokteyli ihtiva eden 3.5 cm tabak içinde yer dokular, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında yavaş bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin.
  3. Inkübasyondan sonra PSS temiz ve daha Epifloresans görüntüleme gerçekleştirmek için bir mikroskop altında dokuyu yerleştirmek için medyayı içeren Fura-2 AM değiştirin.
  4. CCD kamera ve filtre tekerleği ile donatılmış istikrarlı bir ışık kaynağı (monokromatör sistemi) açın (her filtre pozisyon filtresi olarak adlandırılan her zaman seçili kendi zayıflama düzeyi ile ilişkili olabilir).
  5. Parlak saha, dokuyu bulun. Floresans sinyalinin tespiti için geçiş ve sinyal doymasını önlemek için nötral yoğunluk filtreleri ve lamba gücüyle ışık kaynağının yoğunluğunu ayarlamak.
  6. 0.125 Hz veya daha yüksek frekansı ile 340/380 nm'de rasyometrik uyarma ile doku numunesinde Fura-2:00 floresan izleyin. Doğru çözünürlülüğü için 40 × / NA 1.3 veya benzeri objektif lens kullanmation görüntüsü.
  7. Görüntü işleme ve hesaplamalar için görüntü dizisi ithal. Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun. Birkaç ilgi alanları (tek kist hücreleri veya kistik doku seçilen alanlar) seçin ve tercih edilen veri analiz yazılımı içine her bir kanal (340 ve 380 nm) için yoğunluk değerlerini hesaplamak; her bir veri noktasından çıkarma arka yoğunluk değerleri.
  8. Her zaman noktası için Fura-02:00 340 380 kanalların yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her bölge için Ca 2+ geçici hat noktası-time değişiklikleri ve hesaplamak ortalama / SE değerleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cystogenesis potansiyel ENaC tutulumu ORPBH murin modelleri ve doku kültürleri 26-28 PKD ilerlemesi 22-25 ve anormal sodyum reabzorpsiyonunda sinyal kesintiye epidermal büyüme faktörü (EGF) gözlemlenen çeşitli çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. Örneğin, Veizis ve ark., Amiloride duyarlı Na + absorpsiyon ORPBH 29 olmayan ortolog BPK fare modelinde CD hücrelerinde azalmış olduğunu göstermiştir. Biz son zamanlarda kistleri bozulmuş sodyum ve su reabsorbsiyonu cystogenesis 10 ağırlaştırıcı önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Özellikle, elektrofizyolojik ve immünohistokimyasal analiz istihdam ve kistler küntleşmiş sodyum geri emilimini sarf bulundu. Bir farmakolojik yaklaşım seçici ENaC abluka belirgin kist ilerlemesini 10 şiddetlendirir olduğunu göstermiştir.

Biz daha o benzamil bir ENaC bloker, yönetiminin etkisini göstermiştirkist duvarındaki kanalların n faaliyeti. 4 haftalık sıçanlar PCK taşıyıcı veya benzamil (15 mg / ml) ihtiva eden su ad libitum içme ile birlikte verilir. 12 hafta tedaviden sonra hayvanlar, yukarıda tarif edilen protokol uyarınca işlenmiştir. Patch-kelepçe araçtan izole kistik mono tabakaları ve tedavi edilen gruplarda benzamil gerçekleştirildi. 3 apikal membran kaydedilen ENaC aktivitesinin temsili akım izlerini göstermektedir. Özet grafik benzamil yönetim 0.32 ± 0.05 kanalın azalmış aktivite ise ortalama ENaC aktivitesi (NP o), kontrol grubunda kistlerde 0.91 ± 0.15 10 olduğunu göstermektedir. Biz ORPBH idrar akışı 30 ile böbrek kistleri ulaşır içme suyu verilen benzamil (sayısız iğ şeklinde böbrek kistleri 30 oluşturmak için CD'lerin vecd distansiyona ile karakterize) sonucuna varıldı. Bu etki benzamil kist sıvısı, contr sodyum geri alımını azaltmak için izin verir 10 cystogenesis için ibuting.

EGF yolu ek olarak, adenozin trifosfat (ATP) ve diğer pürin da uygun olmayan PKD modelleri ve bu hastalığı olan hastalarda modüle edilir kritik parakrin sinyal bileşeni olarak tanımlanmıştır. Bu purinerjik sinyal polikistik böbrek hastalarında ve polikistik böbrek hastalığı 31,32 boyunca da cystogenesis önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir. PCK sıçanların kist hücreleri daha önce düşük bazal sergiledikleri gösterilmiştir [Ca 2 +] i ve kaybı akım aracılı [Ca2 +] i SD sıçanların 13 sağlıklı olmayan dilate toplama kanallarına kıyasla sinyalizasyon. P2 reseptörü agonistleri CPK / CPK fare 33 türetilmiş kist oluşumunun, bir in vitro modelde renal kistlerin gelişimi modüle eder. Yüksek ATP konsantrasyonu polikistik böbrek hastalarının 34 ve CPK / CPK farelerin 35 kültüre kistik böbrek epitel tarafından şartlandırılmış ortamda kistik sıvı bulundu.

_content "> Bu ekzojen ATP verilmesine tepki olarak, kalsiyum akısını test edilmiştir. Şekil 4 'de gösterilen 10 uM ATP varlığında gerçekleştirildi. Veriler uygulanmasından sonra 10 uM ATP etkisini ortaya önce SD sıçanlardan PCK kistler ve normal kortikal kanallar kalsiyum ölçümleri için izole edilmiştir PCK sıçanların kistik tübüllerde iki farklı yaklaşımlar ele: Şekil 4A, bir monokromatör ile teçhiz edilmiş bir epifluorışıma kurulumunda 340 ve 380 nM'de Fura-02:00 floresans yoğunluğunu ölçümlerini göstermektedir, ve Şekil 4B, konfokal ile Fluo-8 boya boyama kayıt temsil eder mikroskopi. Her iki teknik, kistik epitel 10 ATP uygulama kalsiyum geçici yanıt benzer kinetik göstermektedir.

Figür 1
Şekil 1:. Deneysel protokol şematik sonraHayvan düzgün anestezi ve ameliyat için hazır olduğunu, böbrekler kanı kaldırmak için PBS ile temizlendi. Ardından, böbrekler, kesilmiş decapsulated ve kistik tek tabakalar ya da olmayan dilate tübüller bir stereomikroskop altında forseps ile manuel olarak izole edilmektedir vardır. Sigara genişlemiş tübüller bölünmüş açık olan kistler iç yüzeyi apikal tarafında erişimi açık olurdu kistik epitelin ise mikromanipülatörler tarafından tahrik mikropipetler ile.

Şekil 2,
Şekil 2: İzolasyon ve kistik ve toplama kanalı mono tabakaları hazırlanması (A) 16 haftalık PCK sıçan bir temsilci böbrek dilim.. (B) yama-kelepçe analizi veya kalsiyum görüntüleme (60X) için mikroskop transfer kapak cam çip üzerinde bir kistik tek tabakalı. SD sıçandan izole bifürkasyon ile (C) CNT / CCD segmenti. (

Şekil 3,
Şekil 3: kistik epitel ENaC aktivitesi üzerine benzamil tedavisinin etkisi. (A) taze 16 haftalık PCK sıçan izole kistlerin hücre ekli yamalar ölçülen ENaC faaliyeti için temsili akım izleri içme suyu benzamil 12 hafta uygulanan. Bu yamalar V h = -V p = -40 mV bir test potansiyeline gerçekleştirilmiştir. Dahilde Li + akımları aşağı bulunmaktadır. Kesik çizgiler, bir "c" ve "o n" kapalı ve açık durumları gösteren ile ilgili mevcut durumunu gösterir. (Kısmen izni ile 10 çoğaltılamaz) gözlenen ENaC aktivitesi (NP o) (B) Özet grafiği. * P <0.05RSU'lar aracı.

Şekil 4,
Şekil 4: PCK sıçanların kistik hücreleri içinde kalsiyum influksu üzerinde ATP etkileri önce ve 10 uM ATP uygulamasından sonra Fura-2 AM ile yüklendi, kistik tek tabaka (A), Örnek ve görüntüler.. PCK sıçan hücre mono tabakasında kalsiyum seviyeleri üzerinde ATP etkisi özetleyen Grafik ve SD toplama kanalları (N = 38 hücre). (B) önce ve Fluo-8 boyası yüklendi kistik tek tabakalı 10 uM ATP ve özet grafik uygulanmasından sonra hücre içi kalsiyum yanıtı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz ORPBH bir murin genetik modelinde elde edilen kistik epitel mono tabakaları için geleneksel kumanda klemp tekniği ve epifloresans kalsiyum görüntüleme uygulamaları tarif. Protokol en dikkat kistleri (protokoller bölümünün adım 1.5) izolasyonuna ve elektrofizyolojik çalışmalar ödenmesi gereken üç adımda, oluşur. Bu anahtar prosedürler kapsamlı eğitim ve sabır gerektiren ve okuyucu seferde hüsrana olmamalıdır.

Her şeyden önce, en dikkat kist tek tabakalı izolasyon sürecine dikkat edilmelidir. Hazırlık bu bölümü hücrelerinin görünürlüğü için kritik bir cam çip numune ve hatta eki kalınlığı önemli ölçüde el becerilerini ve etkileri daha fazla iş gerektirir. İzole kist duvarlarının kalınlığı numunenin farklı yerlerinde değişir ve işleri için uygun büyük tek tabakalı alanları ile büyük kistler odaklanmak tavsiye edilirk. Numune temizlemeye yardımcı ve tek tabaka erişmek için, çevre dokular bir stereomikroskop altında forseps ile soyulmuş olmalıdır. Bu tekniğin önemli bir alan derinliği ve diseksiyonu sırasında nesnelerin değişen boyutları karşılamak için geniş bir yelpazede büyütmesini değiştirmek için bir yeteneği ile karakterize bir yüksek kaliteli stereo kullanımını ima vurgulanmalıdır. Yöntemin diğer bir sınırlama yama-kelepçe ve kalsiyum görüntüleme gibi gelişmiş teknikler bu yöntemler aşina personele ihtiyaç olmasıdır. Biz onların kistler benzer epitel tek tabaka oluşturacak şekilde ilk deneyim gibi kortikal M1 ve medüller IMCD hücreleri piyasada mevcut olarak kanal hücre kültürleri toplanması elde edilebileceğini göstermektedir.

Yaklaşımımız iyon kanalları aktivitesi ve taze izole edilmiş dokuların doğal ortamında [Ca2 +] i seviyelerinin ölçülmesine imkan verir. Bu prosedürün ana avantajı singl için örneklerin bu hazırlıkE-kanallı analizi veya enzimatik tedavi gerektiren mekanik prosedürleri veya diğer potansiyel zararlı adımları zarar vermez yükleme boya. Bu tuzlu suda forseps ile elle yapılmış ve büyük hasarsız örnekleri sunmaktadır. Bu tür örnekler tarif edilen teknikler için de kullanılabilir. Aslında, izole edilmiş kistik epitel saf tübül hücrelerinin ince film temsil eden ve fizyolojik olarak ilgili gözlemler üretir gerçek zamanlı deneyler için değerli bir sağlam bir nesne yapan doğal olarak tek katlı bir özelliklerini korur. Kistlerin izolasyonu (kanal tubulese kortikal burada 38 açıklandığı gibi, dispase ve kollajenaz ile, örneğin) sabit araştırmacı ya da kistik doku büyük miktarda bir prosedür, aynı anda enzimatik tedavi gerekli görünüyorsa kullanılabilir izolasyon sürecini kolaylaştırmak için. Enzimler, özellikle proteazlar olarak, bu tedavi yaparken Ancak, araştırmacı anlamlı iyon channe etkileyebilir, çok dikkatli olmalıls 'etkinliği veya membran reseptörleri zarar verebilir. Bu durum, bu zar proteinleri, oldukça hızlı bir şekilde de enzimatik işlem 39,40 altında indirgeme bilindiği gibi, mesela, purinerjik sinyal çalışmaları için çok önemlidir.

Buna ek olarak, kistik epitel benzeri boyalarla sabit bir tek tabaka immünohistokimya ve boyama gibi amaçlar (örneğin, rodamin falloidin) veya NO tespiti için böyle DAF-FM gibi hücre içi madde belirteçleri, taze doku yükleme ya da çeşitli boyalar için kullanılabilir reaktif oksijen türlerinin üretimini izlemek. Bu batı lekeleme toplam böbrek lizatlarında mevcut non-spesifik faktörlerin etkisini ortadan kaldırmak için izole kistik epitel saf kısmını kullanılması tavsiye edilir. Ayrıca, kistik epitel Benzer da ADPKD fare ya da sadece ORPBH çeşitli modelleri çalışmalar için uygun olan diğer türlerden izole edilen, ancak düşündürmektedir. Taze izole kist örnekleri yadsınamaz varonlar daha iyi bir organ içindeki kistik doku özelliklerini sürdürmek ve kuşkusuz in vivo hastalık süreçleri ile ilgili daha haklı verileri sağlamak gibi moleküler biyoloji için avantajlar, kültürlü kistik hücrelere kıyasla yaklaşımlar.

Bu tekniğin önemli avantajlarından biri kontrol dokularında olduğu gibi normal olmayan dilate aynı böbrekler, veya SD sıçanlar tübüllerinden kanalları toplama (PCK sıçanlarda bu sıçanlar paylaşan genetik geçmişini) kullanmak için bir olasılık. Nefron segmentlerinden benzer yama-kelepçe ve kalsiyum ölçümleri yaygın olarak birçok laboratuvarlarda 41-43 non-kistik böbrekler üzerinde kullanılmaktadır. Bağlı olarak iyon kanalları tip patch-clamp yöntemin farklı modifikasyonları (bütün hücre içi dışına, outside-out) kullanılabilir; Örneğin, ENaC ve ROMK (renal dış medüller potasyum kanalı) aktivitesi tüm hücre konfigürasyonu 44,45 ile değerlendirilebilir. Monoc ile geniş alan Epifloresans önerilen Fura-2:00 kalsiyum görüntülemehromator ayrıca diğer kalsiyum boyalarla konfokal ya da iki-fotonlu mikroskobu ile analiz olarak kalsiyum görüntüleme herhangi bir diğer benzer modifikasyon ile gerçekleştirilebilir. Bu mikroskop sistemleri daha az uygun fiyatlı ama daha kaliteli görüntüleme sağlamak ve geniş alan mikroskobu daha hassastırlar. Benzer yaklaşım, aynı zamanda taze izole glomerül 17,46,47 arasında Podositler içinde trpC kanalları aktivitesi ve kalsiyum sinyal çalışma uygulanmıştır. Ilatovskaya ve ark., 46 Teknik olarak tarif edildiği gibi Şekil 4B ya da Fluo4 / FuraRed floresan boyalar ile rasyometrik konfokal ölçümü ile kanıtlandığı gibi uygulanabilen diğer kalsiyum görüntüleme Flu-8 uygulanması bulunmaktadır, bu yama kelepçe ve kalsiyum görüntüleme hem gerçekleştirmek mümkündür aynı anda aynı hücrede mikroskop hem kurulumları ile donatılmış olup olmadığını. Böylece, tarif edilen teknik, esnek inci göre modifiye edilebilir PKD alanında yüksek kaliteli gözlemler için uygun bir yaklaşım, birözel araştırma ve ekipman kullanılabilirliği e ihtiyacı var. Bundan başka, kalsiyum görüntüleme çeşitli modifikasyonları Şekil 4B'de gösterilen şekilde veya Flu-8 (Ilatovskaya ve ark., 46 de tarif edildiği gibi) Fluo4 / FuraRed floresan boyalar ile rasyometrik konfokal ölçümleri dahil burada kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma (AS) R01 HL108880 (OPO kadar) R01 DK095029 ve (TSP) K99 HL116603 (TSP) Ulusal Böbrek Vakfı IG1724, (OPO kadar) Amerikan Kalp Derneği 13GRNT16220002 ve hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Fluo-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369, (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101, (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21, (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19, (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28, (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812, (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272, (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260, (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55, (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77, (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290, (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4, (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24, (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296, (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49, (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21, (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21, (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812, (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19, (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275, (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47, (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20, (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14, (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350, (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10, (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178, (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322, (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10, (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282, (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21, (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283, (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308, (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26, (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37, (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103, (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27, (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125, (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86, (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, (10), C1050-C1059 (2013).
Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).More

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter