Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Реализация Patch зажим и жить флуоресцентной микроскопии для мониторинга функциональных свойств Свежевыделенные ДОК эпителия

Published: September 1, 2015 doi: 10.3791/53035
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Ионные каналы, выраженные в почечных канальцев эпителия играют важную роль в патологии поликистоза почек. Здесь мы опишем экспериментальные протоколы, используемые для выполнения анализа и внутриклеточный уровень кальция измерения патч-зажим в эпителии кистозной свежевыделенными от грызунов почек.

Abstract

Киста инициирование и расширение во поликистоза почек представляет собой сложный процесс характеризуется нарушениями пролиферации клеток, трубчатой ​​просвета накопление жидкости и формирования внеклеточного матрикса. Активность ионных каналов и внутриклеточной сигнализации кальция являются ключевыми физиологические параметры, которые определяют функции эпителия канальцев. Мы разработали метод, подходящий для реального времени наблюдения деятельности ионных каналов с техникой патч-зажим и регистрации внутриклеточного Са 2+ уровня в эпителиальных монослоев свежевыделенных от кист почек. PCK крысы, генетическая модель аутосомно-рецессивный поликистоз почек (ARPKD), были использованы для экс здесь естественных анализа ионных каналов и потока кальция. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедуры предназначены для изоляции кистозные монослоев и нерасширенном канальцев из PCK или нормальных Спрэг Dawley (SD) крыс, и контролировать деятельность одного канала и внутриклеточные Са 2+ динамику.Этот метод не требует ферментативной обработки и позволяет анализировать в родном установки свежевыделенными эпителия монослоя. Кроме того, этот метод является очень чувствительным к изменениям внутриклеточных кальциевых и генерирует изображений с высоким разрешением для точных измерений. Наконец, изолированный кистозной эпителий может быть дополнительно использован для окрашивания с антителами или красители, подготовка первичных культурах и очистки для различных биохимических анализов.

Introduction

Ионные каналы играют важную роль во многих физиологических функций, в том числе рост и дифференцировку клеток. Аутосомно доминантные и рецессивные поликистоз заболевания почек (ADPKD и АРПКБП, соответственно) генетические нарушения, характеризующиеся развитием почечной заполненных жидкостью кисты трубчатого эпителиальных клеток происхождения. ADPKD вызвано мутациями PKD1 или PKD2 генов, кодирующих polycystins 1 и 2, мембранные белки, участвующие в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. PKD2 сам по себе или в виде комплекса с PKD1 также функционировать в качестве Ca 2+ -permeable катионов канала 1. Мутации гена, кодирующего PKHD1 fibrocystin (рецептор, как белка ресничек ассоциированных участие в тубулогенеза и / или поддержания полярности эпителия) являются генетическая стимулом ARPKD 2. Рост кисты является сложным явлением, сопровождается распространением нарушенной 3,4, ангиогенез 5 дедифференцировки и потери полярныхность трубчатых клеток 6-8.

Неисправный реабсорбции и секреции в дополненной кистозной эпителия способствуют накоплению жидкости в просвет кисты и расширения 9,10. Нарушение потока зависит [Са 2+] сигнализации я был также связан с cystogenesis во ДОК 11-15.

Здесь мы опишем метод, подходящий для измерения патч-зажим одной активности канала и внутриклеточных Са 2+ уровня в кистозных эпителиальных монослоев, выделенных из PCK крыс. Этот метод был успешно применен нами для характеристики деятельности эпителиальных Na + канала (ENaC) 10 и [Са 2+] я -зависимые процессов, вызванных Ca 2+ -permeable TRPV4 и пуринергической сигнального каскада 13.

В этих исследованиях мы использовали ФКК крыс, модель ARPKD вызванной спонтанной мутации в гене PKHD1. Штамм был ФКК originallу получены из Sprague-Dawley (SD) крыс SD 16, таким образом, крыс, используемых в качестве соответствующего контроля для сравнения со штаммом ФКК. В результате, оба SD крыс сегменты нефрон и нерасширенном сбора каналы, выделенные из тех же крыс ФКК может служить двум разным группам сравнения для экспериментов по кистозного эпителия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Экспериментальные методики, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в Медицинском колледже штата Висконсин и Техасского университета Научного центра здоровья в Хьюстоне и были в соответствии с Национальными Институтами руководстве здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных. На рисунке 1 показано основные этапы выделения ткани и процедуры обработки. Вкратце, почки от PCK или SD крыс используются для ручной изоляции эпителиальных монослоев собирательных трубочках либо из здоровых не набрал канальцев или кисты. Здесь мы изучали почки от 4-16 недель старые PCK крыс 10,13.

1. Выделение кист почек и подключение Трубочки (УНТ) / собирательных трубочек (CD) Сегменты

  1. Обезболить экспериментального животного с изофлуран (5% индукции, от 1,5 до 2,5%) технического обслуживания / медицинского назначения O 2 или другого утвержденного метода. Животные должны быть под постоянным контролем, чтобы обеспечить адекватную леНовичок анестезии. Стабильный дыхания скорость реакции и ног щепотку используются для подтверждения надлежащего анестезии.
  2. Выполнение лапаротомии и промыть почки фосфатным буферным раствором (PBS) через брюшную аорту 17.
    1. Подготовка катетера полиэтиленовых труб (PE50) и подключить его к шприцевой насос, заполненный PBS. Разрежьте кожу и брюшной стенки вдоль белой линии, а затем сделать поперечный разрез брюшной через живот из стороны в сторону и переложить органы брюшной полости с ватными тампонами, чтобы получить доступ к нисходящей аорты с разветвлением брыжейки и целиакией артерии. Смочите внутренние органы теплой физиологического раствора в ходе дальнейших процедур, чтобы предотвратить их сухость.
    2. Положите одну лигатуру (# 1) вокруг брыжейки и целиакией артерии и другой лигатуры (# 2) вокруг аорты под диафрагмой (не связать). Аккуратно отделить. abdominalis затуплением рассечения соединительных тканей вокруг него с тонкими щипцами и разместить два лигатуры ~ 3мм ниже левой почечной артерии (# 3) и над бифуркацией подвздошных артерий (# 4).
    3. Tie лигатуры # 4 и прикрепить зажим сосуда вокруг аорты между левой почечной артерии и лигатуры # 3. Сделайте надрез между зажимом и лигатуры # 4 катетеризировать аорты, использовать лигатуры # 3 твердо зафиксировать катетер.
    4. Отпустите зажим и убедитесь, что импульс крови видна в катетер, чтобы обеспечить правильную установку. Начните перфузии в размере 6 мл / мин, галстук лигатуры # 1 и # 2, и сократить левой почечной вены. Продолжайте промывать в течение 1-2 мин, пока органы не полностью побледнел.
    5. Вырезать почечных кровеносных сосудов, мочеиспускательного канала и окружающей соединительной и жировой тканей с ножницами, чтобы собрать почки. Затем сделать короткий разрыв в капсуле почек и очистить почки decapsulate их. Поместите почки в ледяную PBS. Эвтаназия подтверждается торакотомии.
  3. Подготовьте 5 х 5 мм покрытие стеклянных осколков, покрытые поли-L-лизин. Вырезать крышку GLAсс с алмазным карандашом и место примерно в 20 мкл 0,01% стерильного отфильтрованного поли-L-лизина раствора на каждой стеклянной чипа. Подготовьте физиологический раствор и две пары часовщика щипцов для вскрытия.
  4. Разрежьте почки с бритвой вдоль фронтальной плоскости ломтиками толщиной ~ 1-2 мм. Разместите один из срезов под стереомикроскопа. Выделение тканей должно быть сделано в ледяной физиологический раствор.
  5. Найдите кисты под стереомикроскопом как круглые формы полостей (2А); их стенки часто содержат важную сеть распространились кровеносных сосудов. Использование тонкой наконечником щипцы рассекать внутреннюю эпителиального слоя кисты как можно тоньше, чтобы получить однослойную область. Приложить ее к микросхеме стекло, покрытое поли-L-лизин. Важная поверхность поли-L-лизин позволяет исследователю твердо позиционировать внутренний слой кисты на стекле. Expose кисты с апикальной стороной вверх, чтобы обеспечить доступ для пипеток (рис 2b).
  6. Используйте PCK или SD-крыс ребенкаНей центральные ломтики, содержащие сосочек для изоляции без расширенных УНТ / CCDsegments 18-21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Папиллярные ткани более долговечны, чем коры и, удерживая папиллярных трубчатые полосы с пинцетом и примчался радиальной оси срез могут быть расщеплены на тонкие секторов. Отдельные трубочки видны и могут быть вытащил быть размещены на крышку стеклянных осколков.
  7. Определить сегменты УНТ / CCD бифуркации, более высокую прозрачность, чем проксимальных канальцах и больших заметно видимых ячеек (рис 2С). Поместите крышку стекла чип с прикрепленными канальцев под микроскоп оснащен микроманипуляторами, пригодных для вождения микропипетки. Использование острых Микропипетки сплит-открытые канальцы и приложите их края к стеклу, чтобы сделать апикальной поверхности доступны (рис 2D).

2. одноканальный патч-зажим электрофизиологии

  1. Заполните патч-зажим камеру с раствором ванной и передать стеклянную крышку чипс изолированными тканей к камере. Убедитесь, что патч-зажим микропипетки есть сопротивление 7-10 МОм для надежных на ячейке измерений (клеток-прилагается).
  2. Для измерений клеточных прилагается, установить коэффициент усиления усилителя в 20 раз и нижних частот токов при 300 Гц с фильтром восемь-полюсный Бесселя. Для мониторинга ENaC каналы, использовать раствор ванна, мм: 150 NaCl, CaCl 2 1, 2 MgCl 2, 10 HEPES (рН 7,4); Пипетка: 140 LiCl, 2 MgCl 2 и 10 HEPES (рН 7,4).
  3. Провести эксперимент обычный патч-зажим в режиме клеточной прилагается 10. Выберите ячейку в эпителиальных монослоя и подойти к пипетки на апикальной мембране. Сформируйте высокого сопротивления, уплотнение между пипеткой и клеточной мембраны, применяя нежное всасывание. После того, как высокая устойчивость gigaOhm печать формируется протокол GAP-бесплатная холдинговой потенциала следует начинать мониторинга активности канала интересов.
  4. Магазин разрыв свободные одноканальные текущие данные из гигаОм уплотнения для последующего анализа. Проанализируйте события канала, используя пакет программного обеспечения, как правило, поставляемый с патч-зажим установок 18. Рассчитать активность канала, как НПО, где N обозначает количество активных каналов в пластыре и Р о средний открыт вероятность каналов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте отдельные кисты или канальцы в патч-зажим экспериментов не более чем на 30 мин.

3. Логометрический эпифлуоресцентной Измерения внутриклеточной концентрации кальция в клетках эпителия

  1. Использование 5 мМ Fura-2АМ растворяли в ДМСО. Алиготе раствор в отдельных 500 мкл конических труб (примерно 10 мкл). Защищать от света и хранить в морозильной камере при температуре -20 ° С на срок до шести месяцев.
  2. Выдержите изолированные кисты и сплит-открытая канальцы на 30-40 мин в PSS (в мм: 145 NaCl, 4,5 KCl, MgCl 2 2, 2 CaCl 2 и 10 HEPES при рН 7,35), содержащие 5 мкм Фура-2 AM красителя и 0,05% Pluronic кислоты, чтобы помочь рассеять ацетоксиметиловые эфиры. Для этого, место ткани в 3,5 см блюдо, содержащее загрузки коктейль, защищенном от света и инкубировать на медленном шейкере при комнатной температуре.
  3. Изменить Фура-2 AM, содержащий носитель для очистки PSS после инкубации и поместите ткань под микроскопом, чтобы дополнительно выполнять визуализацию эпифлуоресцентной.
  4. Включите ПЗС-камеры и стабильной источника света (система монохроматор), снабженный фильтром колеса (каждая позиция фильтр может быть связан со своим собственным уровнем затухания, выбранной каждый раз, когда фильтр называется).
  5. Найти ткани в светлом поле. Переключитесь на обнаружение сигнала флуоресценции и регулировать интенсивность источника света с использованием фильтры нейтральной плотности и мощности лампы, чтобы избежать насыщения сигнала.
  6. Монитор Фура-2 AM флуоресценции в образце ткани с логометрической возбуждения в 340/380 нм с частотой 0,125 Гц или выше. Используйте 40 × / NA 1.3 или аналогичный объектив для правильного resoluния изображения.
  7. Для обработки изображений и расчетов импортировать последовательность изображений. Убедитесь, чтобы разделить каналы и использовать режим HyperStack в оттенках серого. Выберите несколько регионов, представляющих интерес (один кисты клетки или выбранные области кистозной ткани) и вычислить значения интенсивности для каждого канала (340 и 380 нм) в предпочтительном программного обеспечения для анализа данных; вычитать значения интенсивности фона от каждой точки данных.
  8. Для каждого момента времени рассчитать отношение интенсивностей Фура-2 AM 340 до 380 каналов. Участок разброс / линии точка времени изменения Са 2+ переходного для каждого региона и расчета средние значения / SE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Потенциал участия ENaC в cystogenesis была продемонстрирована в нескольких исследованиях, что наблюдаемые нарушен эпидермальный фактор роста (EGF) сигнализации в ДОК прогрессии 22-25 и аномальной реабсорбции натрия в АРПКБП мышиные модели и тканевых культур 26-28. Например, Veizis др. Показали, что амилорид-чувствительных Na +, поглощение уменьшается в CD клеток из не-ортологичных БПК мышиной модели ARPKD 29. Мы недавно показали, что нарушение натрия и воды реабсорбции в кисты является важным фактором в обострении cystogenesis 10. В частности, мы использовали электрофизиологические и иммуногистохимического анализа и обнаружили, что кисты оказывают притупляются реабсорбцию натрия. Фармакологические подход показал, что селективный ENaC блокада заметно усугубляет прогрессирование киста 10.

Кроме того, мы продемонстрировали эффект введения benzamil, в ENaC блокатор, оп активность каналов в стенке кисты. 4-недельных крыс PCK были снабжены транспортного средства или питьевую воду, содержащую benzamil (15 мг / мл) вволю. После 12 недель лечения у животных были обработаны в соответствии с протоколом, описанным выше. Патч-зажим проводили на кистозных монослоев, выделенных из транспортного средства и benzamil обработанных групп. Рисунок 3 показывает репрезентативные текущие следы ENaC активности, записанного с апикальной мембран. Краткий график показывает, что в среднем ENaC активность (НП O) был 0,91 ± 0,15 10 в кистах контрольной группе, в то время как введение benzamil снижало активность канала до 0,32 ± 0,05. Мы пришли к выводу, что в ARPKD (характеризуется экстатической живота компакт-дисков, чтобы сформировать многочисленные веретенообразные кисты почек 30) benzamil приведены в питьевой воде достигает кисты почек с мочой потока 30. Этот эффект позволяет benzamil уменьшить обратного захвата натрия из кисты жидкость, Contr ibuting в cystogenesis 10.

В дополнение к EGF пути, аденозинтрифосфат (АТФ) и другие пурины, также были определены в качестве важного компонента паракринному сигнализации, который неадекватно модулированного в моделях ПКД и у пациентов с этим заболеванием. Было сообщено, что пуринергической сигнализации играет важную роль в cystogenesis как во время ADPKD и ARPKD 31,32. Галловые клетки PCK крысах было показано ранее, обладают низкой базальной [Ca 2+] и потери потока опосредованного [Са 2+] сигнализации по сравнению со здоровыми без расширенных канальцев у крыс SD 13. Агонисты рецепторов P2 модулировать развитие кист почек в модели в пробирке образования кисты, полученной из КПК / КПК мыши 33. Высокая концентрация АТФ был найден в кистозной жидкости из ADPKD пациентов 34 и в средствах массовой информации, обусловленной кистозным эпителия почечных культивируемых от КФК / ВПП мышей 35.

_content "> Мы протестировали поток кальция в ответ на экзогенный АТФ управления. PCK кисты и нормальные корковые каналы из SD крыс были выделены для измерения кальция до и после нанесения 10 мкМ АТФ. Данные, показанные на фиг.4, показывают эффект 10 мкМ АТФ в кистозных канальцах ФКК крыс изучали с двух различных подходов: 4А показывает измерения интенсивности флуоресценции Фура-2AM на 340 и 380 нМ в установке эпифлуоресцентной оснащенного монохроматора и 4В представляет регистрацию окрашивания красителя Fluo-8 с конфокальной микроскопия. Оба метода демонстрируют схожие кинетики кальция переходного ответ на применение АТФ в кистозный эпителия 10.

Фигура 1
Рисунок 1:. Схематическое представление экспериментального протокола Послеживотное правильно анестезии и готов к операции, почки промыть PBS, чтобы удалить кровь. Затем почки вырезали, decapsulated и кистозные монослоев или нерасширенном канальцы выделяют вручную пинцетом под стереомикроскопа. Нерасширенном трубочки разделены открыть с микропипеток управляемых микроманипуляторами в то время как кистозный эпителия, как внутренняя поверхность кисты будет открыта, чтобы иметь доступ к апикальной стороне.

Рисунок 2
Рисунок 2: Выделение и подготовка кистозным и сбора монослоев воздуховодов (А) представитель ломтик почек от 16 недели старой ФКК крысы.. (B) кистозной монослой на чипе покровного стекла переносили в микроскоп для анализа патч-зажим или визуализации кальция (60X). (C) УНТ / ПЗС сегмент с бифуркации изолированы от SD крыс. (

Рисунок 3
Рисунок 3: Влияние benzamil лечения на ENaC деятельности в кистозный эпителия. (А) Характерные текущие следов для ENaC активности, измеренной в клеточных присоединены участки кист свежеизолированных от 16-недельных крыс вводили PCK 12 недель benzamil в питьевой воде. Эти патчи были проведены на испытательном потенциала V = -V ч р = -40 мВ. Внутрь Li + токи вниз. Пунктирные линии показывают соответствующее текущее состояние с "C" и "N" Ø, обозначающего замкнутые и открытые государства. (Б) Основная график наблюдаемого ENaC деятельности (НП O) (частично воспроизведен от 10 с разрешения). * Р <0,05 веrsus автомобиль.

Рисунок 4
Рисунок 4: Влияние АТФ на приток кальция в клетках кистозных крыс PCK (A) Типичные изображения кистозный монослоя нагружали фура-2 AM до и после применения 10 мкМ АТФ.. График подведения эффект АТФ на уровне кальция в клетки монослоя ФКК крыс и SD сбора протоки (N = 38 клеток). (B) Кистозный монослоя загружается с Fluo-8 красителя до и после применения 10 мкМ АТФ и суммарного графика внутриклеточный ответ кальция.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описали здесь приложения обычным способом патч-зажим и изображений эпифлуоресцентной кальция кистозным эпителиальных монослоев, полученных из мышиного генетической модели АРПКБП. Протокол состоит из трех этапов, из которых наибольшее внимание должно быть уделено изоляции кист (шаг 1.5 раздела протоколы) и электрофизиологических исследований. Эти ключевые процедуры требуют интенсивную подготовку и терпения, и читатель не должен быть разочарован одновременно.

Прежде всего, наибольшее внимание должно быть уделено процессу выделения цист монослоя. Эта часть подготовки требует ручной труд и существенно влияет дальнейшую работу, а толщина образца и его даже привязанность к стеклянной чип имеет решающее значение для видимости клеток. Толщина изолированных стен кисты варьируется в разных частях образца, и рекомендуется, чтобы сосредоточиться на более крупных кист с большими монослойных районах, удобных для врк. Чтобы помочь очистить образец и получить доступ к монослой, окружающие ткани должны быть очищены с пинцетом под стереомикроскопа. Следует подчеркнуть, что метод подразумевает использование высококачественного стереомикроскопа характеризуется значительной глубине поля и возможность изменять масштаб в широком диапазоне, чтобы приспособить различные размеры объектов во время вскрытия. Еще одно ограничение метода в том, что такие сложные методы, как патч-зажим и визуализации кальция требует кадров, знакомых с этими методами. Мы полагаем, что начальный опыт может быть получен по сбору канал клеточных культур, таких как коммерчески доступный корковых М1 и мозговой IMCD клетки, они образуют монослой эпителиальных аналогичную кист.

Наш подход позволяет измерять активность ионных каналов и [Ca 2+] я уровней в родной среды свежевыделенных тканей. Основное преимущество этой процедуры является то, что подготовка образцов для SinglАнализ электронной канала или красить нагрузку не требует ферментативную обработку, повреждая механические процедуры или другие потенциально вредные действия. Это выполняется вручную с пинцетом в солевом растворе и обеспечивает большие неповрежденные образцы. Такие образцы можно использовать не только для описанных методов. В самом деле, изолированный кистозной эпителий представляет тонкую пленку чистого трубчатых клеток и поддерживает нативные свойства монослойных, что делает его ценным нетронутыми объектом для экспериментов в режиме реального времени, который производит физиологически соответствующие замечания. Если выделение цист кажется трудно процедура для исследователя или большим количеством кистозной ткани требуется сразу, ферментативную обработку (например, с диспаза и коллагеназы, как описано здесь, 38 для корковых собирающего протока канальцы) может быть использован чтобы упростить процесс изоляции. Тем не менее, исследователь должен быть очень осторожным при выполнении этого лечения, как ферменты, особенно протеазы, может существенно повлиять на ионный CHANNEдеятельность LS 'или повредить мембранные рецепторы. Это, например, очень важно для изучения пуринергической сигнализации, так как эти мембранные белки хорошо известны быстро деградируют под ферментативной обработки 39,40.

Кроме того, кистозный эпителий может быть использована для других целей, таких как иммуногистохимии или окрашивания фиксированной монослоя с красителями (например, родамин-фаллоидином) или загрузки свежей ткани с внутриклеточными маркеров вещество, такое как DAF-FM для обнаружения отсутствия или различных красителей в контролировать производство активных форм кислорода. Он предложил использовать чистую фракцию изолированной кистозной эпителия для вестерн-блоттинга, чтобы устранить влияние неспецифических факторов, присутствующих в лизате в почках. Мы также предлагаем, что кистозная эпителий может быть так же изолированы от мышей или других видов, которые доступны для изучения различных моделей не только АРПКБП, но также ADPKD. Свежевыделенные киста образцы имеют неоспоримыйПреимущества для молекулярной биологии подходы по сравнению с культивируемых клеток кистозных, как они лучше поддерживать свойства кистозных ткани внутри органа, и, несомненно, обеспечивают более обоснованные данные о процессах заболеваний в естественных условиях.

Одним из существенных преимуществ этого метода является возможность использовать обычный нерасширенном собирательных трубочках из тех же почек, или SD крыс канальцев (эти крысы поделиться генетический фон с PCK крыс), в качестве контрольных тканей. Похожие патч-зажим и кальция измерения в сегментах нефрона широко используется на некистозных почек во многих лабораториях 41-43. В зависимости ионных каналов типа, различные модификации метода патч-зажим может быть использован (вся клеток, наизнанку, снаружи из); например, ENaC и ROMK (почечная внешний медуллярный канал калия) деятельность может быть оценена с помощью конфигурации цельноклеточная 44,45. Предлагаемый Фура-2 утра изображений кальция в широкий поля эпифлуоресцентной с monochromator может быть также выполнена с любой другой аналогичной модификации изображений кальция, такие как анализ с конфокальной или двухфотонного микроскопии с другими красителями кальция. Эти микроскопические системы являются менее доступным, но обеспечивают более высокую визуализации качества и более чувствительны, чем широкого поля микроскопии. Аналогичный подход был применен и для изучения деятельности TRPC каналов и сигналов кальция в подоцитов свежевыделенных клубочков 17,46,47. Другое визуализации кальция, которые могут быть применены, включают использование Fluo-8, как показано на фиг.4В или логометрической измерения конфокальной с Fluo4 / FuraRed флуоресцентных красителей, как описано в Ilatovskaya и др. 46 технически это возможно выполнить как патч-зажим и визуализации кальция одновременно на той же клетке, если микроскоп оснащен обеих установок. Таким образом, описанные методика является возможным подходом для высококачественных наблюдений в области ПКД, которые могут быть гибко изменена в соответствии с гое потребности конкретной исследований и наличия оборудования. Кроме того, различные модификации визуализации кальция могут быть использованы здесь, в том числе логометрических измерений конфокальных с Fluo4 / FuraRed флуоресцентных красителей (как описано в Ilatovskaya др. 46) или Fluo-8, как показано на фиг.4В.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Глена Slocum (Медицинский колледж штата Висконсин) и Колин А. Lavin (Nikon Instruments Inc) за отличную техническую помощь с микроскопии экспериментов. Это исследование было поддержано Национальными Институтами Здоровья предоставляет R01 HL108880 (как), R01 DK095029 (в ОПГ) и К99 HL116603 (для ТСП), Национальный фонд почек IG1724 (для ТСП), Американской кардиологической ассоциации 13GRNT16220002 (в ОПГ) и Бен Дж Липпс исследовательский грант от американского общества нефрологии (к DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Fluo-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Tags

Медицина выпуск 103 патч-зажим поликистоз почек АРПКБП ADPKD почки внутриклеточный кальций Фура-2 утра нефрон развитие кисты Polycystin
Реализация Patch зажим и жить флуоресцентной микроскопии для мониторинга функциональных свойств Свежевыделенные ДОК эпителия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V.,… More

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter