Introduction
Em Terapia Fotodinâmica (PDT) fotossensibilizantes são administrados para atingir o tecido, e após a exposição à luz do fotossensibilizador gera espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS espécies, tais como oxigénio atómico e superóxido pode induzir estresse oxidativo e danos estruturais após a células e tecidos 1-4. Devido à sua facilidade de aplicação desse método tem sido activamente investigados e ensaios clínicos foram realizados 5,6. No entanto, os problemas significativos tais como toxicidade no escuro dos sensibilizadores, a sensibilidade do doente a luz (devido a uma distribuição não selectiva do sensibilizador), e hidrofobicidade dos sensibilizadores (o que leva à redução da biodisponibilidade e potencial toxicidade aguda) permanecem.
Relatamos aqui um método para a fabricação e in vitro de avaliação da realização de nanopartículas de polímero misturado com fulereno como os fotossensibilizadores próxima geração para PDT. As nanopartículas são formadas por auto-agregação deo polímero semicondutor MEH-PPV (poli [2-metoxi-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenilenovinileno]) com o PCBM fulereno (fenil-C 61 éster metílico do ácido butírico), quando estes materiais dissolvidos numa compatível solvente são rapidamente injectadas num solvente não-compatível (Figura 1A). A escolha de MEH-PPV como o polímero hospedeiro é motivada pelo seu elevado coeficiente de extinção que leva a altas taxas de formação de tripleto, e ao mesmo tempo eficiente e ultra-rápida de carga e energia transferência para o PCBM fulereno 7. Estas propriedades são ideais para a sensibilização de oxigénio atómico e formação de superóxido no PDT.
Fulereno tem de facto sido aplicado no PDT, tanto na forma molecular e nanopartículas de 8-13. No entanto, a citotoxicidade grave tem dificultado o desenvolvimento adicional 12. Aqui nós mostramos que encapsular o fulereno em uma matriz hospedeira de MEH-PPV para produzir nanopartículas compostas MEH-PPV / PCBM resultados em um material de sensibilização PDT que inão é citotóxico intrinsecamente, mostra especificidade para células cancerosas devido ao tamanho das nanopartículas e carga superficial, e os rendimentos de tratamento altamente eficaz na TFD doses baixas de luz devido às propriedades fotofísicas acima mencionados.
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Protocol
1. Cultivar Linhas Celulares
- Thaw TE 71 (células epiteliais do timo mouse), MDA-MB-231 (células de câncer de mama humano), A549 (células de câncer de pulmão humano) e OVCAR3 (células de tumor do ovário humano) segurando os frascos criogênica em água morna por menos de 2 min . Adicionar 10 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para cada linha celular e centrifuga-se durante 6 min a 106 x g.
- Aspirar a suspensão de 3 ml e adicionar meios para o sedimento. Misturar as células por pipetagem adequadamente várias vezes. Adicionar esta solução de células de pré-aquecida até 7 ml de meio DMEM suplementado com 10% de FBS em frascos T75 e manter os frascos em atmosfera humidificada de 95% ar / 5% de CO2 a 37 ° C. Marque esse balão como Passage 0.
- Quando a confluência das células atinge 80%, a colheita das células, incubando-as com tripsina a 0,05% durante 10 min. Neutralizar a tripsina por adição de igual quantidade de mídia. Centrifugar esta solução durante 6 min a 106 x g. Retirar a suspensão e adicionar 3 ml de meio fresco a ele. Misture bem assimL e transferir pequena quantidade (100 ul) para um frasco de cultura contendo 7 ml de meio. Incubar o balão de cultura na incubadora. Rotular o frasco como uma passagem.
- Cultura das linhas celulares até passagem 11 ou 12.
2. Fabrico de nanopartículas
- Preparação de ~ não diluído solução estoque 10 -6 M (ajustada) MEH-PPV
- Num frasco de 1 mg adicionar poli [2-metoxi-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenilenovinileno] (MEH-PPV) com um peso molecular (médio Mn) 150,000-250,000 g / mol e 3 ml de tetra-hidrofurano (THF) . Agita-se a mistura durante 2 h enquanto se aquecia a 80 ° C sobre uma placa quente.
- Filtra-se a solução acima em um novo frasco utilizando um filtro de seringa de 0,2 um. Rotular esta solução como "solução não diluída estoque MEH-PPV '. Esta solução estará envolvido na preparação de nanopartículas depois de sintonia fina da concentração, tal como descrito nos passos 2.1.3 e 2.1.4.
- Adicionar 50 ul de solução de reserva não diluída do MEH-PPV em 3 ml de THF. Rotular esta solução como "solução diluída estoque MEH-PPV '. Transferir para uma cuvete de quartzo de 1 cm e medir a absorvância a 495 nm por espectroscopia de UV-vis.
- Se a absorvância da solução diluída MEH-PPV é maior do que 0,17, diluir a solução de reserva não diluída MEH-PPV pela adição de mais 1 ml de THF de cada vez, e repetir a etapa 2.1.3, até a absorvância medida a 495 nm ser no variam 0,13-0,17.
- Calcula-se a molaridade da solução de estoque diluída MEH-PPV usando a Lei de Lambert-Beer, como mostrado abaixo. Aqui 0,15 absorvância é utilizado como um exemplo para o resto do protocolo (isto é., Ajustar todos os seguintes cálculos com base na absorvância observada), o coeficiente de extinção MEH-PPV utilizada é de 10 7 M -1 cm -1 e o comprimento do percurso é utilizada 1 cm.
A = ε xbxc (Eq 1)
(ε - o coeficiente de extinção molar, A - absorvância, b - comprimento do percurso, C - concentração da solução)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm XC (Eq 2)
C = 1,5 x 10 @ 8 M (Eq 3)
Utilizar esta concentração para encontrar a concentração da solução de reserva não diluída MEH-PPV como se segue:
H 1 V 1 2 V = H 2 (Eq 4)
0,15 x 10 -7 M x 3050 ul = H 2 x 50 uL (Eq 5)
2 H = 9,15 x 10 -7 M (Eq 6)
Esta é a concentração da "solução de reserva não diluída, ajustada MEH-PPV '.
- Cálculo de massa de MEH-PPV na solução não diluída ajustada estoque MEH-PPV
- Calcula-se a massa de MEH-PPV em 1 ml da solução não diluída estoque adaptados tal como indicado abaixo utilizando a molaridade obtido na secção 2.1.4 e o peso molecular (M w) de MEH-PPV, que é de 10 6 g / mol.
M = n / V (n -. Não de moles, V - volume, em L) (Eqn 7)
Assim, a massa de MEH-PPV em 1 ml de ajustado undsolução estoque iluted é 9,15 x 10 -4 g.
- Calcula-se a massa de MEH-PPV em 1 ml da solução não diluída estoque adaptados tal como indicado abaixo utilizando a molaridade obtido na secção 2.1.4 e o peso molecular (M w) de MEH-PPV, que é de 10 6 g / mol.
- Misturando PCBM em MEH-PPV
- Calcula-se a massa de C-Fenil 61 -butírico éster metílico do ácido (PCBM) para ser adicionado à solução de estoque MEH-PPV para fazer dopado solução MEH-PPV 50% em peso PCBM, em que 50% em peso PCBM é definido com respeito à massa de MEH-PPV (ou seja, metade da massa de MEH-PPV). Ao usar o peso de MEH-PPV obtidos na seção 2.2.
Massa de PCBM / 9,15 x 10 -4 g de MEH-PPV x 100% = 50% em peso PCBM (Eq 8)
Massa de PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) - Pesar 1 mg PCBM num frasco e adicionar 500 mL de THF. Calcular a concentração de PCBM nesta solução com o peso molecular de 910,88 PCBM como g / mol
A molaridade da solução PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 ul) (Equação 10)
A molaridade da solução PCBM = 2,19 x 10 -9 mol / l (11 Eq) - Calcular o volume de solução necessário para PCBM adicionar ao não-diluido ajustado MESolução da H-PPV obter o PCBM dopado solução MEH-PPV 50% em peso em THF, utilizando a molaridade calculado no passo 2.3.2
4,57 x 10 -4 g de PCBM x 1 mol / 910,88 GX 1 ul / 2,19 x 10 -9 mol = 229 ul (Equação 12)
Adicionar 229 ul da solução PCBM em 1 ml de solução de estoque MEH-PPV não diluído ajustado e misturar bem.
- Calcula-se a massa de C-Fenil 61 -butírico éster metílico do ácido (PCBM) para ser adicionado à solução de estoque MEH-PPV para fazer dopado solução MEH-PPV 50% em peso PCBM, em que 50% em peso PCBM é definido com respeito à massa de MEH-PPV (ou seja, metade da massa de MEH-PPV). Ao usar o peso de MEH-PPV obtidos na seção 2.2.
- Preparação de nanopartículas pelo método reprecipitação
- Transferir 1 ml da solução de MEH-PPV / PCBM misturados na seringa de 1 ml com a agulha ligada a ela.
- Rapidamente injectar 1 ml da solução de MEH-PPV / PCBM misturado em 4 ml de água Dl agitação a 1200 rpm. Pare agitação imediatamente após a injecção. Use essas nanopartículas sem transformação.
3. Incubação de linhas celulares com nanopartículas for Imaging
Nota: Todos os experimentos com imagens foram concluídas em placas de Petri de 35 mm
- A absorção de nanopartiCiclos em linhas celulares
- Linhas celulares de cultura até a 12ª passagem. Nos 12 células de cultura de passagem th em 35 mm placas de Petri. Ajustar a concentração de células adicionadas às placas de Petri de 35 mm de tal forma que após 24 horas as células estão 40% confluentes.
- Nesta fase, os meios de comunicação remover DMEM suplementado com FBS a 10% a partir das placas de Petri, lavar as células duas vezes com 1x de DPBS, e adicionar 100 uL da suspensão de nanopartículas em 2 ml de DMEM para as placas de Petri.
- Após 24 horas remover o DMEM / suspensão de nanopartículas as placas de Petri e lavar as células com DPBS 1x 3 vezes. Em seguida, fixar as células por incubação com 4% de paraformaldeído durante 10 min. Lavar duas vezes com DPBS. Corar as células com 300 nM de DAPI por incubação com o corante durante 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente.
- Detecção de ROS
- A549 Cultura e linhas celulares OVCAR3 em placas de Petri, 6 por linha de células, como explicado no ponto 3.1.1. Rotular oAs placas de Petri, como mostrado na Tabela 1.
- Adicionar 100 ul da suspensão de nanopartículas em 2 ml de DMEM para três das placas de Petri, como mostrado na Tabela 1 e incuba-se durante 24 h. Para as placas de Petri que receberão doses de luz, lavar as células após 24 h e suspender as células em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) Dye meios livres.
- Aqueça-se a lâmpada do simulador solar para 15 min. Coloque filtro UV em frente da lâmpada para filtrar a luz ultravioleta. Calibrar a lâmpada com uma célula solar de referência através do ajuste da potência da lâmpada para se obter 0,5 sol (50 mW / cm 2) intensidade na superfície da placa de Petri. Nesta configuração particular que a condição foi alcançada com 218 W de potência fornecida à lâmpada.
- Colocar as placas de petri sob a lâmpada (tampa aberta) durante 60 min, o que resulta em uma dose de luz de 180 J / cm 2, tal como mostrado nos cálculos abaixo:
50 mW / cm 2 seg x 3.600 / 1.000 = 180 J / cm 2 - Remover HBSS sem lavagem e adicionar mais 2 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para as placas de Petri. Incubam-se as células durante mais 2 h.
- Para o controlo positivo incubar as células com 100 | iM de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) durante 30 min.
- Corar as células em todas as placas de petri com uma concentração final de 5 uM de o reagente de detecção de ROS por incubação das células com o corante durante 30 min a 37 ° C.
- Fixar as células por incubação com 4% de paraformaldeído durante 10 min. Lavar duas vezes com DPBS. Corar as células com 300 nM de DAPI por incubação com o corante durante 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente.
- Apoptose e necrose por PI e anexina V FITC
- Cultura em cada linha de células 5 placas de Petri. Três destes pratos de Petri será para a experiência, enquanto os restantes 2 placas de petri será amostras de controlo. Incubar as 3 placas de Petri para experimento com nanopartículas como explained no ponto 3.1.2. As amostras de controlo não são incubadas com nanopartículas.
- Após 24 horas de incubação seguir o passo 3.2.3.
- Colocar as placas de petri de 3 experimentais sob a lâmpada (tampa aberta) e remover um em 20 minutos, uma de 40 min e um aos 60 min. Obteve-se três amostras que foram expostas a doses de luz de 60, 120 e 180 J / cm2, respectivamente (de cálculo na secção 3.2.4). Em seguida, administrar uma de 180 J / cm 2 de dosagem de luz a um dos pratos de Petri de controlo. Este é o controlo com dose de luz aplicada na ausência de nanopartículas. Não aplicar dose de luz para a amostra de controlo restantes (sem nanopartículas e nenhuma dose de luz aplicada).
- Substituir o HBSS com meio DMEM suplementado com 10% de FBS e manter as placas de Petri em incubação durante 4 horas.
- Corar as células do experimental e as placas de Petri de controlo com 20 uL de FITC anexina V por incubação das células com o corante durante 15 min. Lavar duas vezes com DPBS. Manchar o cells com 300 nM de DAPI, bem como 300 nM de PI (iodeto de propidio), por incubação com os corantes por 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente.
4. Nanopartículas de citotoxicidade intrínseca
- Contar as células e cultura em placas de 96 poços
- Colheita das células a partir de balões de cultura, removendo meios e lavagem das células duas vezes com DPBS, seguido de incubação das células com tripsina a 0,05% durante 10 min. Adicionar 2 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para a solução de células resultante. Misture a solução correctamente para separar agregados de células em singuletos.
- Tome 100 ul da suspensão de células e 900 ul adicionar ao meio DMEM suplementado com FBS a 10%. Misture bem. Colocam-se 10 uL desta suspensão para um hemocitómetro. Contar as células utilizando um hemocitómetro e a ajustar a concentração da suspensão de células em 4.1.1 a 5 x 10 4 células / ml.
- Take 5 placas de 96 poços rotulado como 0 h, 24 hr, 48 h, 72 he 96 h. Adicionar 50 ul de 5 x 10 4 culas / ml (soluções de células TE 71 e A549) nas cavidades, como se mostra na Tabela 2, a sementeira, assim, 2.500 células / poço. Fazer o mesmo procedimento para OVCAR3 e MDA-MB-231 linhas celulares.
- Após 24 horas lavar os poços com 1 x DPBS e adicionar 50 ul de concentrações crescentes de nanopartículas nas cavidades como se mostra na Tabela 2. Prepare-se diferentes concentrações de nanopartículas pela adição de 20, 100, e 180 ul de suspensão de nanopartículas de 2.4.2 para a DMEM obter um volume final de 2 ml, que origina concentrações de nanopartículas de 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / mL, e 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectivamente. Cada linha celular tem triplicado para cada concentração de nanopartículas.
- Medir a viabilidade celular no escuro
- Adicionar 10 ul de MTT a 0 hr a placa imediatamente após a adição de nanopartículas. Incubar a placa durante 4 horas para cryst formazanpara formar als. Adicionar solução de solubilização 50 ul nos poços. Incubar a placa durante 6 horas para dissolver os cristais de formazano.
- Medir a viabilidade das células da placa de 0 h, gravando a absorvância a 570 nm com um leitor de microplacas.
- Por placa de 24 h, lavar as células com DPBS e 1x adicionar 50 ul meios em cada poço de incubação depois de 24 horas com nanopartículas. Adicionar MTT e ler a placa conforme explicado em 4.2.1 e 4.2.2.
- Por 48 horas, 72 horas, e 96 placas de RH, lavar as células com 1x DPBS e adicionar 50 ul mídia nas cavidades após 24 hr de incubação com nanopartículas. Incubar as células para os períodos restantes.
- 4.2.5) medir a viabilidade celular nos pontos de tempo particulares, tal como explicado nos pontos 4.2.1 e 4.2.2.
- Repita a experiência completa para 3 vezes (n = 3)
5. medir a viabilidade celular após a TFD
- Contar as células e cultura em placas de 96 poços.
- Rotular um conjunto de 9Placas de 6 poços, como mostrado na Tabela 3, tanto para as placas 71 de TE e A549 + + OVCAR3 MDA-MB-231 placas. A disposição das placas vai ser o mesmo que o indicado em 4.1.3.
- Semear as placas de 96 poços como explicado no ponto 4.1 com o mesmo layout como mostra a Tabela 2 na seção 4.1.2.
- Após 24 horas, adicionar nanopartículas para as placas como explicado no ponto 4.1.4.
- 24 h após a adição de nanopartículas de lavar as células com DPBS e 1x adicionar 50 ul de HBSS a cada poço.
- Irradiam-se as placas com as respectivas doses de luz, como explicado em 3.2.3.
- Substituir o HBSS com 50 ul de meio DMEM suplementado com FBS a 10% e incuba-se as placas para os respectivos períodos de tempo após a TFD.
- Após cada período de tempo medir a viabilidade celular, como explicado em 4.2.1 e 4.2.2.
6. Microscopia de Fluorescência
- A absorção de nanopartículas
- Acender as lâmpadas do microscópio umaND o laser 30 min antes de imagem. Colocar a placa de petri contendo as células fixadas (como explicado na secção 3.1) na fase do microscópio.
- Recolha a fluorescência a partir de nanopartículas de DAPI e por utilização de filtros, como mostrado na Tabela 4. Sobrepor a fase contraste, nanopartículas e DAPI imagens no software ImageJ.
- Detecção de ROS
- Acender as lâmpadas do microscópio 30 min antes de imagem. Colocar a placa de petri contendo as células (tal como explicado na secção 3.2) na fase do microscópio.
- Recolhe-se o de fluorescência a partir das nanopartículas, DAPI, e o reagente de detecção ROS usando filtros, como mostrado na Tabela 4. Overlay o contraste de fase, de nanopartículas, de DAPI e ROS detectar imagens de reagentes em software ImageJ.
- Apoptose e necrose por PI e anexina V FITC
- Acender as lâmpadas do microscópio 30 min antes de imagem. Colocar a placa de Petri contendo as células (tal como explicado nosecção 3.3) na fase do microscópio.
- Recolhe-se o de fluorescência a partir das nanopartículas, DAPI, PI e Anexina V FITC usando filtros, como mostrado na Tabela 4. Overlay o contraste de fase, de nanopartículas, DAPI, PI e Anexina V-FITC imagens no software ImageJ.
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Representative Results
Absorção e citotoxicidade intrínseca de nanopartículas
Os 50% em peso de nanopartículas misturados MEH-PPV / PCBM foram incubadas com TE 71, MDA-MB-231, A549 e linhas de células OVCAR3. O nível PCBM mistura foi escolhido como 50% em peso PCBM, o que foi mostrado para fornecer propriedades de carga e de transferência de energia ideal entre polímeros e conjugados fulerenos 14. As imagens de fluorescência de absorção de nanopartículas estão apresentados na Figura 1B. As células foram incubadas durante 24 h com nanopartículas para assegurar a absorção de nanopartículas. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4%, antes de imagem, e coradas com DAPI para detectar células e a localização do núcleo. A fim de imagem células suficientemente separados 40% de confluência foi mantida. As imagens de fluorescência com imagens de contraste de fase correspondente mostram que há absorção preferencial das nanopartículas por A549 e OVCAR3 linhas celulares de cancro. Nenhuma fluorescência detectável pode ser visto em TE 71 controlee MDA-MB-231 linhas celulares de cancro, indicando absorção limitada. Por outro lado, A549 e OVCAR3 linhas celulares de cancro apresentam absorção significativa de nanopartículas. Citotoxicidade intrínseca (toxicidade no escuro) foi avaliada por incubação dos 50% em peso de nanopartículas misturados MEH-PPV / PCBM com TE 71, MDA-MB-231, A549 e linhas de células OVCAR3 e quantificar a viabilidade celular pelo ensaio de MTT. Dados de MTT na Figura 1C mostram a proliferação normal das linhas celulares.
Nanopartículas como a fonte de ROS
Para assegurar que as nanopartículas são a fonte de ROS, e apenas após a exposição à luz, a formação de ROS foi avaliada com um kit de reagente de detecção de ROS. Dados para OVCAR3 são mostrados na Figura 2 Ausência de emissão verde na Figura 2A -. C indica ROS não são formadas para as amostras de controlo. Emissão verde brilhante do reagente detectar ROS é observado nas amostras tratadas com nanopartículas e expostosa luz, como mostrado nas Figuras 2D e E (imediatamente após a PDT e 2 hr após a TFD), confirmando que as ROS são gerados durante a PDT.
PDT
O desempenho de MEH-PPV / nanopartículas PCBM em PDT foi quantificada por ensaio MTT imediatamente após PDT, e após 4 e 12 horas períodos pós-incubação. Os dados são mostrados na Figura 3 para o período de pós-incubação de 4 h. As linhas de células de cancro A549 e OVCAR3 exibem morte celular significativa após tratamento PDT: até 60% para 100% e A549 para OVCAR-3. O controlo TE 71 e MDA-MB-231 linhas celulares de cancro apresentam efeitos limitados. TE71 é uma linha celular de controlo normal e não se espera que internalizam nanopartículas. Apenas baixa captação não específica de nanopartículas por TE-71 é observado experimentalmente. Baixa absorção de nanopartículas é também observada para MDA-MB-231, que é, neste caso, devido à baixa taxa metabólica em comparação com as outras linhas celulares de cancro. Os dados mostram PDTque as nanopartículas MEH-PPV / PCBM são altamente eficazes sensibilizadores PDT, e que a eficácia de PDT com escalas de absorção de nanopartículas. As diferenças nos resultados entre os PDT linhas celulares de cancro aqui considerados são, devido à diferença de agressividade (taxa de metabolismo e de endocitose) entre estas linhas celulares.
A progressão da morte celular induzida por PDT
Coloração dupla Live / PI e morto com anexina V FITC fornece informações sobre os mecanismos apoptóticos e necróticos de morte celular. Este esquema de coloração foi aplicado à célula linhas estudadas aqui depois de PDT para aprender mais sobre vias de morte celular induzida por PDT. A Figura 4 mostra imagens de TE epiluminescence 71and OVCAR3 linhas celulares coradas com Anexina V FITC, PI e DAPI. Os dados mostram que não há nenhum efeito de PDT sobre a linha celular de controlo TE 71, consistente com a absorção insignificante de nanopartículas. O mesma observação foi efectuada para MDA-MB-231 (dados não apresentados). Quando OVCar3 sofreu PDT a 60 e foi observado 120 J / cm 2 dual coloração de PI (roxo) e anexina V FITC (verde). A 180 J / cm 2, apenas a mancha PI foi observada, sugerindo a morte celular por necrose aguda sob essa condição.
Figura 1. (A) O fabrico de nanopartículas pelo método reprecipitação, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 e células OVCAR3 linhas incubadas com nanopartículas. As nanopartículas são apresentados na cor verde, o núcleo é mostrado na cor azul. As imagens de fluorescência são sobrepostos com as imagens de contraste de fase, barra de escala = 20 uM, (C) a citotoxicidade intrínseca de nanopartículas avaliadas medindo a viabilidade das células para cada linha de células até 96 horas. As viabilidades celulares são comparados com a dose de controlo de nanopartículas (0 mg / ml), definindo a viabilidade de contrAs amostras de ol em 100% (não mostrado). As barras de erro são os desvios-padrão para resultados a partir de 3 experiências separadas (n = 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Detecção de ROS na linha celular OVCAR3 com ROS detecção reagente. (A) não há nanopartículas, sem exposição à luz, (B) não há nanopartículas, expostos a 180 J / cm 2 luz, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanopartículas, sem exposição à luz, (D) com nanopartículas e exposição a 180 J / cm2 de luz, tomado imediatamente após o tratamento, (E) 2 h de pós-TFD, (F) com 100 ul de H 2 O 2 como controlo positivo. A emissão verde brilhante no DF i s a partir do reagente de detecção ROS confirmando a formação de ROS. Barra de escala = 30 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. As viabilidades celulares de TE 71, MDA-MB-231, linhas de células A549, e OVCAR3 administrados com doses de nanopartículas crescente e irradiados com 120 J / cm 2 dose de luz. O tempo de incubação pós-PDT é de 4 horas. As doses de nanopartículas na legenda estão em 10 -4 mg / ml. As barras de erro são os desvios-padrão para resultados a partir de 3 experiências separadas (n = 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. / coloração morto vivo de TE 71 e OVCAR3 linhas celulares com FITC de anexina V e PI. Emissão verde corresponde a anexina V FITC, emissão roxo corresponde a PI (vermelho, misturado com emissão DAPI azul), e emissão azul corresponde a DAPI mancha nuclear. As imagens são a sobreposição de contraste de fase e imagens epiluminescence. Barra de escala = 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. configuração simulador solar por exposição das células a luz com calibrado. Uma célula solar de referência foi utilizado para calibração, representada na inserção registrar 0,5 sol de intensidade de luz (50 mW / cm 2)."Target =" _ blank /53038/53038fig5large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Controles Negativos | Não PN, sem luz | Não PN, com luz | Sem luz, com NPs |
| Controle positivo | 100 mL H 2 O 2 (Sem PN, sem luz) | --- | --- |
| Experimental | 0 hr pós PDT (PN e luz) | 2 horas pós PDT (PN e luz) | --- |
Tabela 1: Projeto Experimental para a detecção de ROS.
| Placa 0 hr | Mídia | TE 71 | A549 | Mídia | ||||||||
| Nenhum tratamento | ||||||||||||
| 0 mg / mL | ||||||||||||
| 0,4 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 2,0 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 3,6 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
Tabela 2: Esquema da placa de 96 poços por incubação de nanopartículas para avaliar a citotoxicidade intrínseca de nanopartículas / efeito PDT
| Placa não. | Dose de luz (J / cm 2) | Publicar tempo PDT (hr) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Tabela 3: Rotular as placas de 96 poços de avaliação PDT.
| Fluoróforo | Filtro de excitação | Espelho dicróico | Filtro de emissão | Microscopia | Fonte de excitação |
| Nanoparticle | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Confocal | Laser de iões de Ar-Cr |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epiluminescence | Lâmpada de mercúrio |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminescence | Lâmpada de mercúrio |
| Anexina V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epiluminescence | Lâmpada de mercúrio |
| ROS reagente detectar | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminescence | Lâmpada de mercúrio |
Tabela 4. configuração Microscopia para experiências de imagiologia.
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Discussion
Para conseguir a absorção de nanopartículas, foi necessário manter algumas medidas críticas enquanto a fabricação das nanopartículas. Uma solução de M MEH-PPV 10 -6 (misturado com 50% em peso PCBM) em THF foi preparada para injectar água Dl, uma vez que foi observado que a concentração desta solução desempenha um papel importante na determinação do tamanho das nanopartículas sendo formada. A concentração foi verificada por espectroscopia de Uv-vis. Note-se que no passo 2.1.3 protocolo foi necessário diluir a solução MEH-PPV inicialmente preparadas (solução de reserva não diluída MEH-PPV) antes de tomar os espectros de UV-vis uma vez que esta solução tem uma absorvência muito maior do que 1. A velocidade de injecção Também desempenha um papel crítico na decisão sobre o tamanho das nanopartículas, e tem que ser tão rápida quanto possível, enquanto se agitava vigorosamente a água Dl. Injecção lenta irá resultar em nanopartículas maiores. Além disso, a agitação deve ser interrompido imediatamente após a injeção de evitar uma maior agregação. Enquanto injetandoa solução em água que é necessário para manter a agulha perto da superfície interior do frasco durante a inserção da agulha completamente para dentro da solução para evitar a formação de bolhas, o que vai afectar o tamanho das nanopartículas. Em nossos experimentos tamanhos de nanopartículas obtidas foram 61,5 ± 23,3 nm como medido por DLS. DLS foi escolhido em vez de TEM, pois é rápido, barato e confiável para este tamanho e facilmente disponível. O potencial zeta sobre estas nanopartículas foi encontrado para ser -9,66 ± 8,12 mV, ou seja, ligeiramente negativa a carga de superfície neutra.
Foi essencial para contar as células enquanto a citotoxicidade intrínseca avaliação de nanopartículas e quantificar os resultados de PDT, como estas técnicas baseiam-se no ensaio de MTT, que proporciona uma medição quantitativa da viabilidade celular. É essencial para iniciar a experiência com o mesmo número de células em cada poço da placa de 96 poços, o que permite a comparação da viabilidade das células no que diz respeito à dose de NaNoparticles e leve, bem como as experiências de controlo.
Um simulador solar foi utilizada para irradiar as amostras. A configuração é mostrado na Figura 5, e é constituída por a fonte de luz, de um filtro de UV, e de uma célula solar de referência. Com este regime de iluminação de um elevado grau de controlo das propriedades espectrais e intensidade da fonte de luz poderia ser conseguido, o que resultou em resultados altamente reprodutíveis. É muito importante compreender que a maioria das fontes de luz não fornecem um perfil de intensidade uniforme. O simulador solar, no entanto, pode ser alinhado para realizar intensidade uniforme perto da área de iluminação. Este foi verificada por meio de uma célula solar de referência em diferentes regiões da área iluminada. Nós também teve o cuidado de colocar sempre pratos na mesma região do ponto de luz e na mesma orientação para minimizar ainda mais efeitos da variação na intensidade. A fonte de luz para provar distância indicada na figura 5 nos forneceu 50mW / cm 2 (0,5 sol) de intensidade sob uma lâmpada elétrica de energia de 218 W. Para estas experiências HBSS corante de mídia livre foi utilizado como para evitar a absorção de luz por corantes indicadores. Depois de PDT, as culas foram novamente incubadas durante certos períodos de tempo a 37 ° C (pós-incubação PDT) para observar o progresso da PDT.
Coloração de células necessária alguma tentativa e erro para obter a concentração correcta do respectivo corante. Isto é conseguido através da repetição da experiência, enquanto aumenta a concentração de corante continuamente até que foram atingidos os resultados apropriados.
O método também tem um par de limitações, especificamente em relação ao sistema de nanopartículas e tratamento PDT. Uma vez que as nanopartículas são preparadas pelo método reprecipitação existe alguma variabilidade no tamanho das nanopartículas obtidas a partir de um lote para outro, e alguns polidispersão em tamanho de nanopartículas existente que não pode ser controlada. Também não foi possível fazer nanopartIcles menos de 20 nm de tamanho. Estas limitações podem ser desafios no desenvolvimento de pequenos nanopartículas monodispersas de tamanho que podem ser aplicados in vivo. Além disso, o PDT experiência in vitro requer que as células sejam fora da incubadora durante um longo período de tempo, o qual pode impor algum stress nas células.
O método aqui descrito para a TFD é significativo relativamente aos actuais abordagens. TFD utilizando pequenas sensibilizadores da molécula e sensibilizadores dopado nanopartículas tem visto aplicação clínica limitada devido a problemas significativos com a toxicidade no escuro dos sensibilizadores, a sensibilidade do doente a luz (devido a uma distribuição não selectiva do sensibilizador), e hidrofobicidade dos sensibilizadores (o que leva a e reduzida biodisponibilidade potencial de toxicidade aguda). Na cirurgia, mesmo se o tumor é removido do corpo, algumas células de cancro permanecem e pode resultar em remissão. Na radioterapia e quimioterapia tecido normal é afetada também.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
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