Abstract
La matrice extracellulaire (MEC) est un maillage complexe de protéines réticulées qui fournit des indices biophysiques et biochimiques qui sont d'importants régulateurs de la prolifération cellulaire, la survie, la migration, etc. L'ECM joue un rôle important dans le développement et dans diverses pathologies, notamment cardio-vasculaires et des maladies musculo-squelettiques, de la fibrose, et le cancer. Ainsi, la caractérisation de la composition des ECM de tissus normaux et malades pourrait conduire à l'identification de nouveaux biomarqueurs pronostiques et diagnostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Cependant, la nature même de protéines ECM (grandes en taille, réticulés et liés de manière covalente, fortement glycosylée) a rendu des analyses biochimiques de ECM difficile. Pour surmonter ce défi, nous avons développé une méthode pour enrichir ECM à partir de tissus et de tumeurs fraîches ou congelées qui tire parti de l'insolubilité des protéines de la MEC. Nous décrivons ici en détail la procédure de décellularisation qui se compose de i séquentiellencubations dans des tampons de différents pH et des concentrations de sel et de détergent et qui se traduit par une extraction de la) intracellulaire (cytoplasmique, nucléaire, membrane et du cytosquelette) les protéines et 2) l'enrichissement de protéines de la MEC. Nous décrivons ensuite comment deglycosylate et digérer préparations de protéines ECM enrichie en peptides pour l'analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) est un maillage complexe de protéines réticulés et glycosylatées qui fournit un soutien architectural et d'ancrage pour les cellules et définit, en partie, des propriétés biomécaniques de tissus 1,2. protéines ECM signalent également les cellules, soit directement à travers leurs récepteurs (par exemple, les intégrines, syndécanes, etc.) ou par une modulation du facteur de croissance de signalisation 3. L'ECM fournit ainsi des signaux biophysiques et biochimiques qui sont d'importants régulateurs de processus cellulaires tels que la prolifération, la survie, la polarisation, la différenciation, la migration, etc.
L'ECM joue un rôle clé dans la physiologie, le développement et le vieillissement 4. En outre, plusieurs pathologies, comme les maladies cardio-vasculaires, la fibrose, des maladies musculo-squelettiques, les cancers, sont causés par, ou d'entraîner la modification de l'ECM. En outre, l'ECM contribue au maintien de niches de cellules souches et identifier des molécules d'ECM principaux èmeau soutien stemness aura une application directe dans l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative 5. Cependant, malgré son importance, l'ECM est restée, jusqu'à récemment, peu exploré 6.
Analyse in silico a montré que la matrisome, définie comme l'ensemble des ECM et les protéines de l'ECM-associé, comprend les produits de plusieurs centaines de gènes à la fois dans le génome humain et de souris 1,7,8. Cependant, l'insolubilité des protéines de la MEC a entravé la caractérisation systématique de la composition de matrices extracellulaires in vivo des échantillons normaux et pathologiques. Nous avons récemment démontré que cette insolubilité pourrait être mise à profit et être utilisé pour enrichir protéines ECM 8 - 10. Nous et d'autres de plus démontré que la spectrométrie de masse est une méthode de choix pour caractériser la composition d'ECM 8-10, 13.
Nousdécrire ici une procédure de décellularisation qui se compose d'incubations séquentielles dans des tampons de pH différents et des concentrations de sel et de détergent. Ce procédé aboutit à l'extraction (ou déplétion) de protéines cytosoliques, nucléaires, la membrane et du cytosquelette et l'enrichissement de protéines de la MEC. Nous décrivons ensuite comment digérer préparations de protéines ECM enrichie en peptides pour l'analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
En utilisant les procédures détaillée et illustrée ici, nous avons réussi à enrichir et caractérisé par spectrométrie de masse des matrices extracellulaires de dix différents tissus et types de tumeurs: poumon normal murin 8, humaine et du côlon murin 8,9, foie humain 9, les tumeurs colorectales humaines et dérivés métastases hépatiques 9, xénogreffes de mélanome 8, xénogreffes tumorales mammaires 10, les îlots pancréatiques murins et murins (Naba insulinomes et al., non publié). Comparaison de l'autre matrisomes révélé signatures ECM Tissue et spécifiques de la tumeur qui pourraient encore être utilisées comme biomarqueurs de diagnostic ou de pronostic potentiels.
Nous croyons que cette procédure peut être appliquée à d'autres échantillons avec ou sans modifications relativement mineures.
Protocol
NOTE: La procédure peut être effectuée sur les tissus frais ou surgelés. Nous vous recommandons de perfuser les tissus fortement vascularisés avec PBS au moment de la dissection d'éliminer les globules rouges et les protéines plasmatiques. Nous ne recommandons pas la conduite de la procédure sur les tissus fixes que la fixation (c.-à-réticulation chimique) interfère avec décellularisation et peut également compromettre significativement l'analyse subséquente de la spectrométrie de masse. Pour l'ensemble de la procédure, nous recommandons l'utilisation de tubes à faible rétention et embouts de pipette afin de maximiser la récupération des protéines et peptides.
1. Décellularisation de tissus ou de tumeurs
NOTE: Avant de commencer, préparer les réactifs et ajouter des inhibiteurs de la protéase (fournies avec le kit d'extraction de protéines Compartiment) pour le volume souhaité de chaque tampon. Tous les tampons et les échantillons doivent être conservés dans la glace pour la durée de l'expérience à l'exception du tampon CS qui doit être conservé à température ambiante pour éviter SDS Précipitationsitation.
NOTE: Le protocole utilise une série d'incubation dans des tampons de différents pH et contenant différentes quantités de sels et des détergents pour séquentiellement protéines intracellulaires d'extraction et d'enrichir de protéines de la MEC insolubles (Figure 1, Tableau 1; voir également la discussion des alternatives à l'utilisation de la kit commercial détaillé ici). Les volumes de réactifs donnés ci-dessous sont pour 100 mg de tissus ou de tumeurs (voir le tableau 1) et doivent être ajustées de manière appropriée.
- Homogénéiser 100 mg de tissu dans 500 pi de tampon C contenant des inhibiteurs de protease en utilisant un homogénéiseur de tissu jusqu'à ce que le tissu est complètement perturbé et une suspension homogène.
NOTE: Ajouter la désoxyribonucléase I (concentration finale: 200 ug / ml, reconstitué conformément aux instructions du fabricant) et ribonucléase A (concentration finale: 20 pg / ml, reconstitué conformément aux instructions du fabricant) àBuffer N. - Extraction séquentielle de protéines solubles intracellulaires
- L'extraction des protéines cytosoliques. Incuber l'homogénat sur un rotateur de tube pendant 20 min à 4 ° C. Enregistrer une petite aliquote (10 pi à 20 pi) de l'homogénat pour l'analyse western blot ultérieure (voir la section Résultats attendus et la figure 2).
- Centrifuger l'homogénat à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant dans un tube propre, ce qui constitue la fraction cytosolique (C) de l'analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C.
- Pour laver, remettre le culot dans 400 pi de tampon W contenant des inhibiteurs de la protéase et incuber l'échantillon sur un rotateur de tubes pendant 20 min à 4 ° C. Centrifuger l'homogénat à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Pour extraire les protéines nucléaires, remettre en suspension le culot dans 150 pl de tampon de N contenant des inhibiteurs de protéase, deoxyribonucleaSE I et la ribonucléase A et incuber l'échantillon sur un rotateur de tubes pendant 30 min à 4 ° C.
- Centrifuger l'échantillon à 16 000 xg pendant 30 min à 4 ° C et recueillir le surnageant dans un tube propre. Répéter cette étape une fois: après centrifugation de l'échantillon pour la seconde fois, le surnageant ajouter au surnageant précédent: cela constituera la (N) de la fraction nucléaire analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C. Ensuite, effectuez les lavages comme pour l'étape 1.2.3.
- Pour extraire les protéines membranaires, remettre en suspension le culot dans 100 pl de tampon M contenant des inhibiteurs de protease et on incube l'échantillon sur un dispositif de rotation du tube pendant 30 min à 4 ° C. Centrifuger l'échantillon à 16 000 xg pendant 30 min à 4 ° C
- Récupérer le surnageant dans un tube propre: ceci constitue la fraction membranaire (M) de l'analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C.
- Pour extraire les protéines du cytosquelette, resuspendre le culot dans 200 ul de tampon contenant les inhibiteurs de protéase CS et mettre en incubation l'échantillon sur un dispositif de rotation du tube pendant 30 min à TA.
Notez que le culot ne sera pas dissoudre complètement. Nous vous suggérons de perturber le culot par pipetage de haut en bas jusqu'à ce que l'observation des perturbations de la pastille. - Centrifuger l'échantillon à 16 000 xg pendant 30 min à température ambiante. Recueillir le surnageant dans un tube propre. Remarque à ce point une diminution plus marquée de la taille de la pastille (voir la vidéo).
- Remettre en suspension le culot dans 150 pl contenant des inhibiteurs de la protéase du tampon C et incuber l'échantillon sur un dispositif de rotation du tube pendant 20 min à 4 ° C. Centrifuger l'échantillon à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
- Recueillir le surnageant et l'ajouter à la surnageant précédente: cela constituera la fraction du cytosquelette (CS) de l'analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C.
- Effectuer lavages supplémentaires. Remettre en suspension le culot dans 500 pl de PBS contenant des inhibiteurs de protease ae incuber l'échantillon sur un rotateur de tubes pendant 5 min à 4 ° C. Centrifuger l'échantillon à 16 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Répétez cette étape trois fois.
NOTE: Toutes les traces de détergents doivent être éliminés par des lavages poussés avant la digestion des protéines en peptides (voir section 3). À ce stade, le culot ECM enrichi peut être éclair congelées et conservées à -80 ° C. Notez que la taille de la pastille va dépendre de la quantité de protéines (ECM) insolubles dans la matière de départ et l'efficacité de la décellularisation.
2. Surveillance de la Qualité de l'Décellularisation / ECM enrichissement par SDS-PAGE et Western Blot
- Mélanger 10-20 ul aliquote de l'extrait total du tissu et des aliquots de 50 ul de fractions intermédiaires avec Laemmli tampon contenant 100 mM de DTT. Reprendre le, fraction insoluble ECM-enrichi en 3x Laemmli tampon contenant 100 mM de DTT.
Remarque: il a élevé des concentrationsde la TNT et du SDS aider à la solubilisation des protéines ECM qui sont relativement insolubles. - Séparer les protéines par SDS-PAGE et transférés sur des membranes de nitrocellulose.
- Effectuer immunitaires-taches en utilisant des anticorps pour surveiller les protéines représentant de chacun des cytosoliques, nucléaires, membrane, cytosquelette et ECM fractions (voir la section Résultats Représentant, tableau 2 et figure 2).
3. digestion des protéines à des peptides pour l'analyse de spectrométrie de masse dans la solution
NOTE: Le culot obtenu après la procédure de décellularisation et l'enlèvement de SDS est fortement enrichie en protéines de la MEC insolubles pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse de ces protéines ont besoin d'être digéré en peptides. On notera que, du fait de l'insolubilité des protéines ECM, il est impossible pour l'étape de mesurer la concentration en protéine de l'échantillon. Nous fournissons donc des volumes de réactifs à digérer l'ECM-enriCHED peptides dans des échantillons en fonction de la taille (mm) ou de poids sec de la pastille ECM enrichi (tableau 3). Les solutions de bicarbonate d'ammonium, de l'urée, de la TNT, iodoacétamide et l'acide trifluoroacétique tous doivent être fraîchement préparé.
- Remettre en suspension l'échantillon d'ECM enrichi en ajoutant le volume approprié de l'urée 8 M à la pastille d'ECM enrichi et ajouter du DTT à une concentration finale de 10 mM (voir tableau 3). Incuber avec agitation continue à 1400 tours par minute pendant 2 heures à 37 ° C.
REMARQUE: à ce stade, les protéines de la MEC ne seront pas entièrement dissous et les visiblement de grosses particules de protéines ne doivent pas être jetés par centrifugation ou filtration. La suspension sera clairement sur déglycosylation et la digestion (voir la vidéo). - Alkylation
- Préparer la solution de iodoacétamide dans l'eau de qualité HPLC. Refroidir l'échantillon à température ambiante et ajouter l'iodoacétamide à une concentration finale de 25 mM. Pour alkylation terminée, le DTT: rapport de l'iodoacétamide doit se situer entre 1: 2.5 et 1: 3.
- Incuber dans l'obscurité pendant 30 min à température ambiante.
- Déglycosylation:
Note: déglycosylation est nécessaire pour supprimer des chaînes latérales glucidiques qui interfèrent avec l'identification des peptides modifiés par glycosylation liés en N.- Diluer à 2 M d'urée avec 100 mM de bicarbonate d'ammonium pH 8,0 et ajouter la quantité appropriée de PNGaseF (voir tableau 3). Incuber avec agitation continue à 1400 tours par minute pendant 2 heures à 37 ° C.
- Digestion
- Ajouter Lys-C et incuber avec agitation continue à 1400 tours par minute pendant 2 heures à 37 ° C. Ajouter la trypsine et incuber avec agitation continue à 1400 rpm O / N à 37 ° C.
REMARQUE: la suspension de l'ECM-riche qui a commencé trouble lors de la reconstitution initiale dans l'urée 8M apparaît clair après O / N digestion (voir la vidéo). - Ajouter une deuxième aliquote de la trypsine à l'échantillon et incuber, sous agitation continue à 1400 tours par minute pendant encore 2 heures à 37 ° C. </ Li>
- Ajouter Lys-C et incuber avec agitation continue à 1400 tours par minute pendant 2 heures à 37 ° C. Ajouter la trypsine et incuber avec agitation continue à 1400 rpm O / N à 37 ° C.
- Acidification
- Après achèvement de la digestion, inactiver la trypsine en acidifiant l'échantillon fraîchement préparée avec 50% d'acide trifluoro-acétique (TFA). L'échantillon devrait atteindre un pH <2. Nous suggérons l'ajout de 1-1,5 ul de TFA à 50% à un moment et en utilisant 1 pl de la solution de peptide pour mesurer le pH de la solution en utilisant du papier pH (voir la vidéo).
- Centrifuger l'échantillon acidifié à 16 000 xg pendant 5 min à température ambiante. Recueillir le surnageant dans un tube à faible rétention propre. À ce stade, la solution de peptide peut être conservé à -20 ° C.
- Dessalage
Remarque: cette dernière étape est habituellement réalisée à une installation de spectrométrie de masse selon leurs propres méthodes préférées.- Avant l'analyse protéomique, dessaler les échantillons et les peptides élues avec fraîchement préparée de 60% d'acétonitrile, l'acide trifluoroacétique à 0,1%, suivie d'une concentration dans un concentrateur sous vide. Reprendre les peptides dans fraîchement préparé 3% acetonitrile, 0,1% d'acide trifluoroacétique 8.
REMARQUE: après que le dessalage, la concentration de la solution de peptide peut être mesurée par spectrophotométrie (voir la section résultats attendus). - Maintenant analyser l'échantillon par spectrométrie de masse, de nouveau conformément aux modes opératoires optimaux de l'installation de spectrométrie de masse.
NOTE: Nous encourageons les chercheurs intéressés à caractériser la composition des ECM en utilisant la spectrométrie de masse pour se référer à nos autres publications 8 - 10 et le site Web qui fournissent des explications plus détaillées, y compris les paramètres LC-MS / MS, la recherche de masse de données de spectrométrie pour l'identification et les données de protéines analyse utilisant le silico matrisome outil d'annotation, nous avons développé en 8.
- Avant l'analyse protéomique, dessaler les échantillons et les peptides élues avec fraîchement préparée de 60% d'acétonitrile, l'acide trifluoroacétique à 0,1%, suivie d'une concentration dans un concentrateur sous vide. Reprendre les peptides dans fraîchement préparé 3% acetonitrile, 0,1% d'acide trifluoroacétique 8.
Representative Results
Contrôle de la qualité de la procédure de décellularisation
L'efficacité de la décellularisation peut être surveillée par l'analyse de la teneur en protéine de chaque fraction par western blot. Le tableau 2 donne la liste des protéines d'intérêt diagnostique pour évaluer la qualité de la procédure de décellularisation. La figure 2A montre l'extraction efficace dans les fractions intermédiaires de cytosolique (GAPDH ), histones nucléaires (), la membrane (β1 intégrine) et du cytosquelette (actine) des protéines, tandis que les pas de protéines d'ECM (collagène I) est détectée dans ces fractions (Figure 2). À son tour, le culot final est enrichie en protéines de la MEC et largement appauvri en protéines intracellulaires (figure 2A). La figure 2B présente satisfaisant épuisement de la protéine intracellulaire (pas d'histone est détecté dans la fraction de l'ECM riche), bien que, l'actine peut encore être détecté dans la fraction de l'ECM riches et l'appauvrissement de monomère collagène I- Poids moléculaire apparent ~ 110 kDa, correspondant présumée au collagène démonté I - peut être observée dans la fraction CS.
Nous aussi surveiller régulièrement protéines ECM supplémentaires tels que la fibronectine et la laminine, bien que, dans certains tissus ces composants peuvent être partiellement solubilisés dans les fractions 8 à 10 précédentes. Par exemple, la fibronectine se produit également de la fibronectine plasmatique soluble qui ne sont pas incorporés dans l'ECM. La perfusion du tissu avant l'extraction réduit la concentration de fibronectine plasmatique mais toujours ne l'élimine pas. Dans certains tissus, les laminines sont trouvés lâchement associés à la surface cellulaire ou l'ECM et extrait dans les fractions intermédiaires. Si cela se produit, il peut être résolu en modifiant les conditions d'extraction (voir la discussion).
Notez que l'enrichissement de protéines de la MEC et l'épuisement concomitant de composants intracellulaires sont basées sur le rapport de la solubilité des protéines dans les différents tampons. Thest diffère entre les différents tissus - dans certains cas, les histones et actine sont plus facilement extraits que dans d'autres. Notons aussi que, bien que les histones sont censés être extrait dans la fraction N (figure 2B), on observe souvent un épuisement plus complet des histones dans la M ou fraction CS (Figure 2A et B).
Concentration de peptide indicatif prévu
La concentration de la solution de peptide obtenu après digestion, de l'acidification et de dessalage peut être mesurée par spectrophotométrie, soit par mesure de l'absorbance de la solution de peptide en utilisant la longueur d'onde de 280 nm correspondant à la tryptophane, la tyrosine, ou en utilisant la longueur d'onde de 205 nm correspondant à l'absorbance du peptide obligations.
Nous avons mesuré la concentration des solutions de peptides obtenus à partir de la décellularisation de trois échantillons poumons murins (82 mg, 100 mg et 100 mg, respectivement) préparouge en parallèle et obtenu de chaque: 424 ng / ul, 450 ng / ul et 580 ng / ul de peptides respectivement.
Identification des peptides ECM par spectrométrie de masse
Analyse par spectrométrie de masse de la composition d'échantillons de protéines ECM enrichi, préparés comme décrit ici, a montré que> 70% de l'intensité de signal correspond à ECM et protéines ECM associé à 10/08.
Tableau 1. Volume de réactifs de kit compartimentés Extraction à decellularize 100 mg (poids humide) de tissu ou une tumeur. Ce tableau présente la composition et le volume de chaque tampon utilisé pour mener l'décellularisation de 100 mg de tissu ou une tumeur. Un cocktail d'inhibiteurs de proteases est fourni en solution 50x et doit être ajouté à chaque tampon 2.
| Réactifs de kit d'extraction de protéines Compartiment | Volume pour 100 mg de tissu | Composition (basé sur Millipore Fiche chat # 2145 1) |
| Tampon C | 500 ul | HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, HAE 4, sucrose, glycérol, orthovanadate de sodium 5 |
| Buffer W | 400 ul | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, l'EDTA, le saccharose, le glycerol, orthovanadate de sodium |
| Buffer N | 2 x 150 ul | HEPES (pH 7,9), MgCl 2, NaCl, EDTA, le glycerol, orthovanadate de sodium |
| Buffer W | 400 ul | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, l'EDTA, le saccharose, le glycerol, orthovanadate de sodium |
| Tampon M | 100 ul | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycérol, le désoxycholate de sodium (DOC) 6, NP-40 6 |
| Buffer CS | 200 ul | PIPES (pH 6,8), MgCl 2, NaCl, EDTA, le saccharose, dodécylsulfate de sodium (SDS) 7, orthovanadate de sodium |
| Tampon C | 150 ul | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, l'EDTA, le saccharose, le glycerol, orthovanadate de sodium |
| PBS 1x | 500 pi / lavage | - |
Notes:
1 Pour des raisons de propriété, nous avons été incapables d'obtenir la composition précise des tampons du fournisseur du kit, mais nous incluons ici quelques notes sur la base de notre propre expérience en utilisant des tampons faits maison pour effectuer des extractions similaires.
Inhibiteur de la protéase 2: il est souhaitable d'inclure une variété d'inhibiteurs contre la cystéine, la sérine et la thréonine peptidases, des estérases à sérine, les métalloprotéinases dépendantes des cations divalents etc.De nombreux cocktails disponibles dans le commerce des inhibiteurs de protéase existent.
3 pH supérieur à 7,0 est un inhibiteur efficace de proteases lysosomales.
4 EDTA (généralement utilisé à 2 mM) est un inhibiteur efficace de protéases dépendant des cations divalents.
5 orthovanadate de sodium est un inhibiteur de la phosphatase. Une concentration typique efficace serait 0,5-5 mM.
6 NP40 à 0,1% -0,5% est suffisante pour solubiliser les lipides membranaires plus. La combinaison de NP40 et DOC - souvent utilisé à des concentrations égales (par exemple, 0,5% de chaque) - est souvent utilisé comme une extraction plus strictes qui laisse encore de nombreuses interactions protéine-protéine intacte.
7 SDS est un détergent ionique plus strictes (CMC 0,1%). Il peut également être utilisé en combinaison avec les deux autres détergents SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% en tant que tampon de stringence intermédiaire.
Tableau 2. Les protéines de diagnostic àsurveiller la qualité de la procédure de décellularisation. Ce tableau donne des exemples de protéines qui sont caractéristiques de chaque compartiment subcellulaire (cytosol, le noyau, membrane plasmique, cytosquelette et ECM) qui peut être utilisé pour surveiller la qualité de la procédure de décellularisation et l'efficacité de la ECM-enrichissement.
| Intracellulaire Compartiment | Protéines de diagnostic |
| Protéines cytosoliques | La glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) |
| Des protéines nucléaires | Histones, lamines, nucléoporine |
| Les protéines membranaires | Les intégrines, de récepteur de la transferrine |
| Protéines du cytosquelette | Actine, tubuline, Vimentin |
| protéines ECM de la membrane basale | Le collagène IV, Nidogens, laminines |
| Protéines ECM interstitiels (interstitielles) | Collagène I, collagène III, collagène VI, fibronectine |
Pour la recommandation sur les anticorps, consultez nos publications 8-10.
Tableau 3. Volume de réactifs pour digérer les échantillons ECM enrichi en peptides. Ce tableau répertorie les réactifs utilisés pour remettre en suspension les échantillons de protéines ECM enrichi et de réduire, alkylation, deglycosylate et de digérer les échantillons de protéines en peptides avant l'analyse par spectrométrie de masse.
| Réactifs | Préparation | Concentration finale / Montant pour pastille 1 mm d'épaisseur (~ 5-10 mg de poids sec) | Volume pour pastille 1 mm d'épaisseur (~ 5-10 mg de poids sec) |
| du bicarbonate d'ammonium (NH 4 HCO 3) | Solution 100 mM dans de l'eau de qualité HPLC | - | - |
| Urée | Solution 8 M en mM de bicarbonate d'ammonium 100 | 8 M | 50 ul |
| Dithiothreitol | Reconstituer dans l'eau de qualité HPLC à 500 mM | 10 mM | 1 ul |
| Iodoacetamide | Reconstituer dans l'eau de qualité HPLC à 500 mM | 25 mM | 2,5 ul |
| Peptide N -Glycosidase F (PNGaseF) | Solution commerciale à 500 U / pl | 1000 U | 2 ul |
| Endoprotéinase LysC, spectrométrie de masse de qualité | Reconstituer dans l'eau de qualité HPLC à 0,5 pg / pl | 1 pg | 2 ul |
| Trypsine, la spectrométrie de masse de qualité (1 tour) | Solution commerciale à 0,5 pg / pl | 3 pg | 6 pi |
| Trypsine, la spectrométrie de masse de qualité (phase 2) | Solution commerciale à 0,5 pg / pl | 1,5 pg | 3 ul |
| L'acide trifluoro-acétique (TFA) | Solution à 50% dans de l'eau de qualité CLHP | - | 2-5 pi |
| L'acétonitrile (élution) | Solution à 60% avec 0,1% de TFA dans de l'eau de qualité CLHP | - | 500 ul |
| L'acétonitrile (reconstitution) | Solution à 3% avec 0,1% de TFA dans de l'eau de qualité CLHP | - | 100 ul |
Figure 1. Schéma de la procédure expérimentale. De workflow schématique du Protocol à decellularize tissus (Section 1), le contrôle de la qualité de la décellularisation et évaluer l'enrichissement de l'ECM (Section 2) et à digérer les échantillons de protéines ECM enrichi en peptides avant l'analyse par spectrométrie de masse (section 3).
Figure 2. Contrôle de la qualité de la procédure de décellularisation par western blot Western blots ont été effectués sur poumon de souris (A) et mammaire humain carcinome xénogreffe (B) des échantillons en utilisant les anticorps suivants:. Lapin anti-actine (clone 14-1) et de lapin anti -β1 intégrine anticorps produits dans notre laboratoire; lapin anti-collagène I, souris anti-GAPDH et les anticorps de lapin anti-pan-histones étaient de Millipore. Après l'incubation de l'anticorps primaire, les membranes ont été lavées et incubées en présence de chèvre anti-lapin conjugué à HRP ou de chèvre anti-mouse anticorps secondaire de Jackson Immuno Research Laboratory. Enfin, les membranes ont été lavées et incubées dans chimioluminescence Western foudre ™ Reagent (PerkinElmer LAS). * Indique une contamination résiduelle minimale d'histone de la fraction riche en ECM. ** Indique l'épuisement partiel du monomère (présumée non monté) collagène I dans la fraction CS. *** Indique une contamination de l'actine résiduel de la fraction riche en ECM. Le frottis détecté avec l'anticorps anti-collagène représente différents niveaux de modifications post-traductionnelles (par exemple, la réticulation, glycosylation).
Discussion
Modifications
Bien que nous avons utilisé cette procédure exacte à enrichir l'ECM de dix tissus et types de tumeurs 8 - 10, des modifications du protocole devrait être considérée dans les cas suivants:
1) Détection de protéines de la MEC dans les fractions intermédiaires.
Matrices extracellulaires provenant de différents tissus ou types de tumeurs peuvent différer dans leur extractibilité / insolubilité, comme discuté ci-dessus pour la fibronectine et laminines. Par exemple, on pense que la MEC des tissus ou des tissus fibrotiques remodelage retourne très dynamique et donc on pourrait observer une plus grande proportion de protéines de la MEC dans les tissus d'être plus facilement extractible 12. En fonction de la fraction de protéines de la MEC qui sont détectés, nous suggérons de réduire le temps d'incubation de l'étape consistant à provoquer l'extraction des protéines de la MEC ou omettre cette étape.
2) DÉTECTION d'une partie importante des composants intracellulaires dans le culot enrichi ECM. Dans certains tissus ou types de tumeurs des cellules de rapport: ECM est particulièrement élevées (par exemple, les tumeurs, le foie, la rate, la non-desmoplastiques). Dans ce cas, une contamination importante de la fraction enrichie de l'ECM par des protéines intracellulaires (en particulier des protéines et / ou des histones cytosquelette) peut être observée. Pour épuiser les protéines intracellulaires efficacement, nous vous suggérons de répéter deux fois l'incubation dans le tampon M et / ou tampon CS (les deux détergents contenant, ce épuise généralement abondantes protéines intracellulaires). Une autre alternative serait d'utiliser des tampons de rechange avec des concentrations plus élevées de détergents, avec l'avertissement que cela peut conduire à l'épuisement des protéines ECM relativement plus solubles ainsi (voir paragraphe suivant).
3) Alternative à l'aide d'un kit commercial.
Nous avons été incapables, pour des raisons de propriété, pour obtenir la composition précise des tampons frosuis le fournisseur du kit d'extraction de protéines et compartimentés. Toutefois, nous avons inclus dans le tableau 1 notes basées sur notre propre expérience en utilisant des tampons faits maison avec du détergent défini (NP-40, désoxycholate de sodium et SDS) les concentrations de procéder à des extractions similaires. Une étude récente a également souligné l'importance du pH des tampons de décellularisation de conserver protéines ECM 13.
Limites de la technique
La méthode présentée ici repose sur le fait que les protéines de l'ECM sont intrinsèquement plus insoluble que la plupart des protéines intracellulaires. Cependant, le procédé décrit ici de décellularisation extrait certainement composants solubles présents dans la MEC telles que des facteurs de croissance ou des enzymes de remodelage de la MEC. Bien que les protéines d'ECM associé étroitement liés aux protéines d'ECM ont été détectés par la protéomique dans les échantillons préparés comme décrit, cette méthode peut être trop strictes au profil totalement la composition de matrisome-associéprotéines.
L'importance de la technique par rapport à d'autres méthodes
L'avantage de la méthode présentée ici par rapport aux autres procédés est qu'il peut être adapté à la nature de l'intérêt de l'ECM: les étapes intermédiaires peut être omis ou répété pour empêcher la perte de protéines de la MEC ou augmenter l'épuisement des protéines contaminantes intracellulaires respectivement. Cette méthode utilise également seulement des quantités minimales de produits de lavage qui sont rincés à empêcher leur interférence avec la préparation du peptide suivant et spectrométrie de masse. Enfin, le procédé décrit ici pour digérer les préparations de protéines ECM riche en peptides a également l'avantage de ne pas nécessiter d'être des protéines solubles et peuvent être effectuées sur les fractions enrichies ECM "bruts".
D'autres méthodes de décellularisation en utilisant chaotropes (tels que le chlorhydrate de guanidine) d'étudier la composition des ECM par spectrométrie de masse ont been rapporté dans la littérature (revue dans 14) et ont été utilisés en combinaison avec la spectrométrie de masse pour caractériser la composition de l'ECM du cartilage 15,16, coeur 17, glande mammaire 18 et 19 vasculaire et glomérulaire 20 membranes basales.
Recommandations
méthodes de Décellularisation employant trypsine à digérer sur cellules ne doivent pas être utilisés si ECM sont enrichis pour la protéomique ultérieures analyses, comme la trypsine se traduira par digestion partielle de l'ECM et la perte de protéines et de peptides ECM. De même, si digestion à la collagénase était utilisé pour faciliter une désorganisation du tissu, il serait nécessaire de surveiller attentivement car il provoque ECM digestion et la perte de protéines et de peptides ECM.
En contre-solution la digestion dans le gel? protéines de la MEC sont réticulés et fortement insoluble et, même quand on remet en suspension dans du tampon Laemmli 3x (contenant 6% de SDS) et 100 mM de DTT, po séparéorly sur des gels SDS. Ainsi en est-gel digestion pas un procédé préféré.
Les applications futures
Il est à noter que, bien que non décrit ici, la composition de chacune des fractions intermédiaires recueillies au cours de la décellularisation peut également être analysé par spectrométrie de masse. Cela peut être particulièrement utile lorsque l'on étudie de très petits échantillons (c.-à-biopsies humaines) ou lorsque l'information est demandée sur d'autres fractions cellulaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
