Gehakt Tissue in Compressed Collageen: A-cel met Biotransplant voor Single-geënsceneerde Reconstructieve Repair

Summary

Weefselmanipulatie omvat vaak in vitro expansie om autologe voor weefselregeneratie creëren. Deze studie geeft een werkwijze voor weefselexpansie, regeneratie, reconstructie en in vivo werd ontwikkeld om de verwerking van cellen en biologische materialen buiten het lichaam te minimaliseren.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

Meest tissue engineering studies op transplantatie in de huid en het urogenitale kanaal omvatten autologe cel oogsten van gezond weefsel en celexpansie in speciaal uitgeruste-cel kweken faciliteiten ^1,2.

Na celexpansie, worden cellen gewoonlijk opgeslagen voor later gebruik bij de patiënt bereid de autograft ontvangen. Stikstof diepvriezers mogelijk langdurige opslag bij lage temperaturen van -150 ° C of lager. Het proces van invriezen moet voorzichtig en gecontroleerd zodat de cellen niet te verliezen. Een kans op celdood kristallisatie van intracellulair water tijdens het ontdooien, wat kan leiden tot breuk van de celmembranen. Cel bevriezen wordt meestal uitgevoerd door langzame en gecontroleerde afkoeling (-1 ° C per minuut), onder toepassing van een hoge concentratie van cellen, foetaal runderserum en dimethylsulfoxide. Na het ontdooien, moet de cellen opnieuw worden verwerkt door het verwijderen van bevriezing medium en kweken op celkweek of een plasticbiomateriaal voordat transplantatie terug naar de patiënt.

Alle bovengenoemde stappen zijn tijdrovend, arbeidsintensief en kostbaar ^3. Bovendien zijn alle in vitro verwerking van cellen die bestemd zijn voor de patiënt transplantatie zijn sterk gereguleerd en vereist goed opgeleide en geaccrediteerde personen en laboratoria ^4. Al met al, om een ​​veilige en betrouwbare productieproces te schaffen, de techniek kan alleen in een zeer klein aantal van de technisch geavanceerde centra worden opgezet en een breder gebruik in voorkomende chirurgische aandoeningen is twijfelachtig.

Om de beperkingen van celcultuur in de laboratoriumomgeving te overwinnen, is het concept van het transplanteren gehakt weefsel voor celexpansie in vivo geïntroduceerd door het lichaam zelf als bioreactor. Daartoe zou autografts voorkeur worden getransplanteerd op een 3D matrijs volgens de vorm die nodig is voor de uiteindelijke reconstructie van het orgaan van iBELANG ^5-7.

Oorspronkelijk was het idee van het transplanteren van gehakt epitheel werd gepresenteerd door Meek in 1958, toen hij beschreef hoe epitheel groeit van de randen van een wond. Hij aangetoond dat een klein stukje huid de marges zijn potentieel voor celexpansie zouden verhogen en daardoor met 100% door het snijden van het stuk tweemaal loodrechte richtingen (figuur 1) ^8. De theorie wordt ondersteund door het gebruik van mazen gedeeltelijke dikte huidtransplantaties voor huidtransplantatie ^{9 en} in de huid wondgenezing modellen ^10.

Figuur 1:. Meek theorie Volgens de theorie Meek, groeit epitheel van de randen van een wond. Door het verhogen van het gebied blootgelegd door het hakken techniek, gehakt weefsel epithelializes wonden van vele plekken.

De huidige studie is gebaseerd op de hypostelling dat hetzelfde principe in het onderhuidse weefsel door het plaatsen gehakt epithelium om een ​​mal kan worden toegepast. De epitheelcellen zou mobiliseren van gehakt transplantaties (reorganiseren), omvatten de wondgebieden (migratie) en delen (vergroten) om een ​​continue neoepithelium die het wondgebied bedekt en scheidt het vreemde lichaam (de matrijs) vanaf het binnenlichaam vormen ( figuur 2).

Figuur 2:. Cartoon van een 3D vorm met gehakt epitheel in vivo intracorporale weefseluitbreiding volgens de theorie van Meek Via gehakt weefsel geplaatst op een mal en vervolgens getransplanteerd in het onderhuidse weefsel is de hypothese dat de epitheelcellen migreren van de randen van gehakt weefsel reorganiseren en te voeren zodat een continue neoepithelium die het wondgebied bedekt en scheidt het vreemde lichaam (de matrijs) vanaf het binnenlichaam vormen.

Hoewel eerdere in vivo studies tonen veelbelovende resultaten, kan verdere verbeteringen worden bereikt door het versterken van de autografts zodat de geregenereerde epitheel mechanisch trauma kon weerstaan ​​beter ^7. Voor deze doeleinden zijn belangrijke voorwaarden voor een succesvolle biomateriaal geïdentificeerd, zoals: gemakkelijke diffusie van voedingsstoffen en afvalproducten, mogelijkheid om schimmel in een 3D-wijze en gemak van chirurgische behandeling. Conclusies werden gemaakt dat deze behoeften kan worden voldaan door het toevoegen van een composiet biomateriaal aan gehakt weefsel.

Het huidige onderzoek gericht op de ontwikkeling van een steiger bestaande uit gehakt weefsel in plastic-gecomprimeerde collageen bevattende een versterkende kern van een biologisch afbreekbare stof. Op deze manier kon levensvatbare cellen migreren van het gehakt weefsel deeltjes en vermenigvuldigen met morfologische kenmerken kenmerk van de oorspronkelijke epitheel (huid of urotheel). Met behulp van plastic compressie, het schavot was verminderend in grootte van 1 cm tot ongeveer 420 urn als het gehakte deeltjes ingekapseld in de bovenlaag collageen. De kern kan elk polymeer materiaal zijn, maar moet worden gemodificeerd met een hydrofiel oppervlak om elkaar te verbinden met de betreffende collageenlagen ^11.

De werkwijze verschaft een verbeterd scaffold integriteit doordat een gebreid gaas bestaande uit poly (ε-caprolacton) (PCL) binnen twee plastic gecomprimeerd collageen gels gebruikt als een steiger voor het kweken gehakt blaasmucosa of gehakt huid van varkens. Het construct werd in celkweek omstandigheden gedurende tot 6 weken in vitro, demonstreren succesvolle vorming van een gelaagde, meerlaagse urotheel of squameus epitheel huid op de bovenkant van een goed geconsolideerd hybride construct. Het construct was gemakkelijk te hanteren en kan plaats gehecht voor blaas augmentatie doeleinden of deksel van defecten. Alle delen van het weefsel scaffold zijn FDA goedgekeurd en de techniekkunnen worden gebruikt voor eentraps procedures weefsel oogsten, hakken, plastic compressie en transplanteren naar de patiënt als eenmalig gefaseerde interventie. De procedure kan worden uitgevoerd voor weefselexpansie en wederopbouw onder steriele omstandigheden in een algemene chirurgie unit.

Protocol

Alle dieren protocollen werden vooraf goedgekeurd door de County Comite Stockholm on Animals en alle procedures voldeden aan de regels voor diergeneeskundig gebruik, alsmede relevante federale statuten. 1. Dierlijke Procedures De voorbereiding van de Animal voor Heelkunde Bereid de operatietafel alle materialen en instrumenten die voor de werking onder steriele omstandigheden. Voer de operatie uitsluitend onder steriele omstandigheden het risico op infectie te verminderen…

Representative Results

Deze studie presenteert een methode die laat zien hoe een biomateriaal voor transplantatie te produceren met behulp van plastic compressie van collageen en gehakt weefsel. Blaasslijmvlies en huid kunnen worden geoogst en vervolgens mechanisch in kleine deeltjes gehakt (figuur 3). Door kunststof compressie, worden de gehakte deeltjes opgenomen in de samengestelde steiger bestaande uit een centrale bioafbreekbaar polymeer dat mechanisch sterke binnen buitenlagen van een collag…

Discussion

Deze studie geeft een gemakkelijk te gebruiken benadering blaaswand vlekken met autologe weefsels voor transplantatie produceren de operatietafel. De pleisters worden gevormd door de combinatie van een biologisch afbreekbaar polymeer breien in het midden en collageen met en zonder gehakt weefsel in de buitenvlakken kunststof verbonden met compressie. Plastic compressie is een methode eerder beschreven door andere auteurs en kan worden gedefinieerd als een snelle verwijdering van vocht uit collageen gels ^{12,13.</sup…}

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3