Tejido picado en colágeno comprimido: Un Bio Transplant que contiene células para la reparación reconstructiva-puesta en escena individual

Summary

La ingeniería de tejidos incluye a menudo la expansión in vitro con el fin de crear autoinjertos para la regeneración de tejidos. En este estudio se desarrolló un método para la expansión del tejido, la regeneración, y la reconstrucción in vivo con el fin de reducir al mínimo el procesamiento de células y materiales biológicos fuera del cuerpo.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

La mayoría de los estudios de ingeniería de tejidos en el trasplante a la piel y el tracto urogenital incluyen cosechas de células autólogas a partir de tejido sano y la expansión de células en los centros de cultivo de células especialmente equipados ^1,2.

Después de la expansión de células, las células se suelen almacenar para su uso posterior, cuando se prepara al paciente para recibir el autoinjerto. congeladores de nitrógeno permiten el almacenamiento a largo plazo a bajas temperaturas de -150 ° C o inferior. El proceso de congelación debe ser cuidadoso y controlado con el fin de no perder las células. Uno de los riesgos de la muerte celular es la cristalización del agua intracelular durante el proceso de descongelación, lo que puede conducir a la ruptura de las membranas celulares. congelación de células se realiza generalmente por un enfriamiento lento y controlado (-1 ° C por minuto), utilizando una alta concentración de células, suero bovino fetal, y sulfóxido de dimetilo. Después de la descongelación, las células necesitan ser procesados ​​de nuevo mediante la eliminación del medio de congelación y el cultivo sobre plástico de cultivo de células o unabiomaterial antes del trasplante de nuevo al paciente.

Todas las etapas mencionadas anteriormente requieren mucho tiempo, laboriosa y costosa ^3. Además, todo el procesamiento in vitro de células destinados a trasplantes paciente son altamente regulado y requiere de personal y laboratorios ⁴ bien entrenados y acreditados. Con todo, para procurar un proceso de fabricación seguro y fiable, la técnica sólo se puede establecer en un número muy reducido de centros de tecnología avanzada y un uso más amplio de trastornos quirúrgicos comunes es dudosa.

Con el fin de superar las limitaciones de cultivo de células en el entorno de laboratorio, el concepto de trasplantar tejido picado para la expansión de células in vivo se introduce por el uso del cuerpo como un biorreactor. A estos efectos, los autoinjertos preferentemente se trasplantaron en un molde 3D de acuerdo a la forma que se necesita para la reconstrucción final del órgano de interés ^5-7.

Originalmente, la idea de trasplantar epitelio picada fue presentado por Meek en 1958 cuando describió cómo el epitelio crece a partir de los bordes de una herida. Demostró que un pequeño trozo de piel aumentaría sus márgenes y por lo tanto su potencial para la expansión de células en un 100% por el corte de la pieza dos veces en direcciones perpendiculares (Figura 1) ^8. La teoría ha sido apoyado por el uso de injertos de piel de espesor parcial en malla para el trasplante de piel ^{9 y} en la piel de la herida modelos ¹⁰ de cicatrización.

Figura 1:. Teoría Meek Según la teoría de Meek, epitelio crece a partir de los bordes de una herida. Al aumentar el área expuesta por la tecnología de picar carne, tejido picado epithelializes heridas de muchos puntos.

El presente estudio se basa en el hipotesis de que el mismo principio podría aplicarse al tejido subcutáneo mediante la colocación de epitelio picada alrededor de un molde. Las células epiteliales se movilizarían de trasplantes picados (reorganizar), cubren las áreas de heridas (migrar) y dividir (ampliar) con el fin de formar un neoepithelium continua que cubre el área de la herida y separa el cuerpo extraño (el molde) del cuerpo interior ( la Figura 2).

Figura 2:. Dibujos animados de un molde 3D ​​con epitelio picada para la expansión del tejido in vivo intracorporal según la teoría de Meek Mediante el uso de tejido picado colocado en un molde y luego trasplantadas en el tejido subcutáneo, la hipótesis es que las células epiteliales migran desde el bordes del tejido picado, reorganizan, y se expanden con el fin de formar un neoepithelium continua que cubre el área de la herida y se separa el cuerpo extraño (el molde) del cuerpo interior.

Aunque estudios previos in vivo muestran resultados prometedores, mejoras adicionales podrían alcanzarse mediante el refuerzo de los autoinjertos de modo que el epitelio regenerado podría soportar trauma mecánico mejor ^7. A estos efectos, se identificaron requisitos importantes para un biomaterial éxito, tales como: fácil difusión de nutrientes y productos de desecho, posibilidad de molde de una manera 3D y facilidad de manejo quirúrgico. Conclusiones Se hicieron que estas necesidades podrían satisfacerse mediante la adición de un biomaterial compuesto al tejido picado.

El estudio tuvo como objetivo desarrollar un andamio compuesto de tejido colágeno en picada plástico comprimido que contiene un núcleo de refuerzo de un tejido biodegradable. Por estos medios, las células viables podrían migrar de las partículas de tejido desmenuzado y proliferar con características morfológicas característica del epitelio original (piel o urotelio). Uso de la compresión de plástico, el andamio era reducird en tamaño de 1 cm a alrededor de 420 micras como las partículas picadas se encerrado en el colágeno de la capa superior. El tejido básico podría ser cualquier polímero pero necesita ser modificado con una superficie hidrófila con el fin de interconectar con las capas de colágeno que cubren ^11.

El método proporciona una integridad andamio mejorada mediante la incorporación de una malla tejida que consiste en poli (ε-caprolactona) (PCL) dentro de los dos geles de colágeno de plástico comprimido de usarlo como un andamio para el cultivo de la mucosa de la vejiga o de la piel picada picada a partir de cerdos. La construcción se mantiene en condiciones de cultivo celular para un máximo de 6 semanas in vitro, lo que demuestra la formación con éxito de una, de varias capas urotelio o epitelio estratificado escamoso de piel en la parte superior de una construcción híbrida bien consolidada. La construcción era fácil de manejar y puede ser suturado en su lugar con fines de aumento de la vejiga o de cobertura de defectos de la piel. Todas las partes del andamio de tejido están aprobados por la FDA y la técnicapodría ser utilizado para los procedimientos de una sola etapa por la recolección de tejido, picado, compresión de plástico, y el trasplante de nuevo al paciente como una intervención por etapas sola. El procedimiento puede ser realizado por la expansión del tejido y la reconstrucción en condiciones estériles en cualquier unidad de cirugía general.

Protocol

Todos los animales protocolos fueron aprobados previamente por el Comité del Condado de Estocolmo sobre los animales y todos los procedimientos se ajustaban a las normas para el uso de animales, así como las leyes federales pertinentes. 1. Procedimientos de Animales Preparación del animal para la cirugía Preparar la mesa de operaciones con todos los materiales y los instrumentos necesarios para la operación en condiciones estériles. Realizar la cirugía exclusivamen…

Representative Results

Este estudio presenta un método que muestra cómo producir un biomaterial para el trasplante utilizando la compresión de plástico de colágeno y tejido picado. Mucosa de la vejiga y la piel pueden ser cosechadas mecánicamente y luego picado en pequeñas partículas (Figura 3). Por compresión de plástico, las partículas picadas se incorporan dentro de la armazón de material compuesto compuesta de un polímero biodegradable colocado en posición central que es mecánic…

Discussion

Este estudio presenta un enfoque fácil de usar para producir parches pared de la vejiga con tejido autólogo para el trasplante en la mesa quirúrgica. Los parches están formados por la combinación de un tejido de punto de polímero biodegradable en el medio y el colágeno, con y sin tejido picado en las superficies exteriores en combinación con la compresión de plástico. Compresión de plástico es un método descrito previamente por otros autores y se puede definir como una rápida expulsión de fluido a partir …

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3