Tissue tritata in Compressed Collagene: A Biotransplant cellulare contenente per la riparazione singolo-messa in scena Ricostruttiva
Summary
L'ingegneria dei tessuti include spesso espansione in vitro per creare autologhi per la rigenerazione tissutale. In questo studio un metodo per l'espansione del tessuto, rigenerazione e ricostruzione in vivo è stata sviluppata al fine di minimizzare la trasformazione di cellule e materiali biologici di fuori del corpo.
Abstract
Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.
Introduction
La maggior parte degli studi di ingegneria tissutale su trapianti di pelle e del tratto urogenitale includono i raccolti di cellule autologhe da tessuto sano e l'espansione delle cellule in strutture cellulari-coltura appositamente attrezzati 1,2.
Dopo l'espansione delle cellule, le cellule sono in genere memorizzati per un uso successivo quando il paziente viene preparato a ricevere la autologo. congelatori azoto permettono la conservazione a lungo termine a bassa temperatura di -150 ° C o inferiore. Il processo di congelamento devono fare attenzione e controllato in modo da non perdere le cellule. Un rischio di morte cellulare è la cristallizzazione di acqua intracellulare durante il processo di scongelamento, che può portare alla rottura delle membrane cellulari. Cella di congelamento è di solito eseguita da lento e controllato raffreddamento (-1 ° C per min), con un'alta concentrazione di cellule, siero fetale bovino, e dimetilsolfossido. Dopo lo scongelamento, le celle devono essere nuovamente elaborate rimuovendo il mezzo congelamento e coltura su colture cellulari di plastica o unabiomateriale prima del trapianto di nuovo al paziente.
Tutti i passi di cui sopra sono in termini di tempo, laboriosa e costosa 3. Inoltre, tutta l'elaborazione in vitro delle cellule destinati ai trapianti dei pazienti sono altamente regolamentato e richiede personale e laboratori 4 ben addestrati e accreditati. Nel complesso, per procurare un processo di produzione sicuro ed affidabile, la tecnica potrebbe essere stabilito solo in un piccolo numero di centri tecnicamente avanzati e un uso più ampio nei disturbi chirurgiche comuni è dubbia.
Per superare le limitazioni di coltura cellulare in ambiente di laboratorio, il concetto di trapianto di tessuto macinate per l'espansione delle cellule in vivo è introdotto utilizzando il corpo stesso come un bioreattore. Per questi scopi, i autoinnesti sarebbero preferenzialmente da trapiantare su uno stampo 3D in base alla forma che è necessario per la ricostruzione finale dell'organo di interest 5-7.
In origine, l'idea di trapiantare l'epitelio tritata è stato presentato da Meek nel 1958, quando ha descritto come epitelio cresce dai margini di una ferita. Egli ha dimostrato che un piccolo pezzo di pelle sarebbe aumentare i margini e così il suo potenziale di espansione delle cellule del 100% tagliando il pezzo due volte in direzioni perpendicolari (Figura 1) 8. La teoria è stata sostenuta con l'uso di maglie innesti cutanei parziali spessore per il trapianto di pelle 9 e in pelle ferite modelli 10 guarigione.
Figura 1:. Teoria Meek Secondo la teoria di Meek, epitelio cresce dai bordi di una ferita. Aumentando l'area esposta dalla tecnologia di macinazione, tessuto tritato epithelializes ferite da molti punti.
Il presente studio si basa sulla ipotesi che lo stesso principio può essere applicato al tessuto sottocutaneo posizionando dell'epitelio macinata intorno uno stampo. Le cellule epiteliali mobilitavano da trapianto macinate (riorganizzare), coprono le aree ferita (migrare) e dividere (espansione) per formare un neoepithelium continuo che copre l'area della ferita e separa il corpo estraneo (stampo) dal corpo interno ( Figura 2).
Figura 2:. Fumetto di uno stampo 3D con epitelio macinate per vivo espansione tissutale intracorporal in base alla teoria di Meek Utilizzando tessuto tritato posto su uno stampo e poi trapiantato al tessuto sottocutaneo, l'ipotesi è che le cellule epiteliali migrano dal bordi del tessuto tritato, riorganizzano e si espandono in modo da formare un neoepithelium continuo che copre l'area della ferita e separa il corpo estraneo (stampo) dal corpo interno.
Sebbene precedenti studi in vivo mostrano risultati promettenti, ulteriori miglioramenti potrebbero essere realizzati rafforzando i autologhi in modo che l'epitelio rigenerato potrebbe resistere a traumi meccanici meglio 7. A tal fine, sono stati individuati requisiti importanti per un biomateriale successo, come ad esempio: facile diffusione di nutrienti e scarti, possibilità di stampo in una maniera 3D e facilità di manipolazione chirurgica. Le conclusioni sono state fatte che queste esigenze possono essere soddisfatte con l'aggiunta di un biomateriale composito al tessuto tritato.
L'attuale studio volto a sviluppare un'impalcatura composta di tessuto tritato in collagene plastica compresso contenente un'anima di rinforzo di un tessuto biodegradabile. Con questi mezzi, cellule vitali potrebbero migrare dalle particelle di tessuto tritate e proliferare con caratteristiche morfologiche caratteristiche dell'epitelio originale (pelle o urotelio). Utilizzando la compressione di plastica, l'impalcatura era ridurred nel formato da 1 cm a circa 420 micron come le particelle macinate sono stati racchiusi in collagene strato superiore. Il tessuto di base potrebbe essere qualsiasi polimero, ma ha bisogno di essere modificato con una superficie idrofila al fine di interconnettere con il rivestimento strati di collagene 11.
Il metodo ha fornito una integrità impalcatura migliorata incorporando una maglia a maglia costituito da poli (ε-caprolattone) (PCL) entro due gel di collagene di plastica compressa usando come impalcatura per la coltura di mucosa vescicale macinate o pelle tritata di maiale. Il costrutto è stato mantenuto in condizioni di coltura cellulare, per 6 settimane vitro, dimostrando formazione di successo di una stratificata, urotelio multistrato o squamose dell'epitelio pelle sulla parte superiore di un costrutto ibrido ben consolidata. Il costrutto era facile da gestire e potrebbe essere suturato in atto ai fini della vescica di aumento o la copertura dei difetti della pelle. Tutte le parti del patibolo tessuti sono approvati dalla FDA e la tecnicapotrebbe essere utilizzato per le procedure a singolo stadio per la raccolta dei tessuti, macinazione, la compressione di plastica, e il trapianto di nuovo al paziente come un intervento singolo-messa in scena. La procedura può essere eseguita per espansione tissutale e ricostruzione in condizioni sterili in qualsiasi unità chirurgia generale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio presenta un approccio facile da usare per la produzione di cerotti parete vescicale con tessuto autologo per il trapianto al tavolo operatorio. I cerotti sono formati dalla combinazione di una maglia polimero biodegradabile in mezzo e collagene con e senza il tessuto macinate nelle superfici esterne in combinazione con compressione di plastica. Compressione plastica è un metodo precedentemente descritto da altri autori e può essere definito come una rapida espulsione di liquido dal gel di collagene …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Swedish Society for Medical Research, the Promobilia Foundation, the Crown Princess Lovisa Foundation, the Freemason Foundation for Children’s Welfare, the Swedish Society of Medicine, the Solstickan Foundation, Karolinska Institutet, and the Stockholm City Council for financial support.
Materials
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| DMEM 10X | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3'3,'5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33x22x10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| Ham´s F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Lucose 25 mg/mL | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| PLGA Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade – 15 | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10X (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with distilled water. Dilute to 1X with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
References
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
