Summary

Tissu haché en comprimé Collagen: Un Biotransplant contenant des cellules de réparation Reconstructive simple mise en scène

Published: February 24, 2016
doi:

Summary

L'ingénierie tissulaire comprend souvent dans l'expansion in vitro dans le but de créer des autogreffes pour la régénération tissulaire. Dans cette étude, un procédé pour l'expansion des tissus, la régénération, la reconstruction et in vivo a été mis au point afin de réduire la transformation des cellules et des matières biologiques en dehors du corps.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

La plupart des études d'ingénierie tissulaire sur la transplantation de la peau et des voies génito-urinaire comprennent récoltes de cellules autologues de tissu sain et l'expansion des cellules spécialement aménagées dans les installations de culture de cellules 1,2.

Après l'expansion des cellules, les cellules sont généralement stockés pour une utilisation ultérieure lorsque le patient est prêt à recevoir l'autogreffe. congélateurs d'azote permettent un stockage à long terme à de basses températures de -150 ° C ou moins. Le processus de congélation doit être prudent et contrôlé afin de ne pas perdre les cellules. Un risque de mort cellulaire est cristallisation de l'eau intracellulaire au cours du processus de décongélation, ce qui peut conduire à la rupture des membranes cellulaires. Cellule gel est généralement effectuée par un refroidissement lent et contrôlé (-1 ° C par minute) en utilisant une concentration élevée de cellules, du sérum foetal bovin, et le diméthylsulfoxyde. Après décongélation, les cellules doivent être traitées à nouveau par l'élimination du milieu de congélation et mise en culture sur des cellules de culture en matière plastique ou d'unbiomatériaux avant la transplantation au patient.

Toutes les étapes mentionnées ci-dessus sont longs, laborieux et coûteux 3. En outre, tout le traitement in vitro de cellules destinés à la transplantation des patients sont très réglementé et nécessite du personnel et les laboratoires 4 bien formés et accrédités. Dans l'ensemble, de se procurer un coffre-fort et fiable processus de fabrication, la technique ne pouvait être établie dans un très petit nombre de centres techniquement avancés et une plus large utilisation dans les troubles chirurgicales courantes est douteux.

Afin de surmonter les limitations de la culture de cellules dans l'environnement du laboratoire, le concept de la transplantation de tissu haché pour l'expansion des cellules in vivo est introduit en utilisant le corps lui-même en tant que bioréacteur. A ces fins, les autogreffes seraient préférentiellement être transplantés sur un moule 3D en fonction de la forme qui est nécessaire pour la reconstruction finale de l'organe d'iINTÉRÊT 5-7.

À l'origine, l'idée de transplanter épithélium hachée a été présenté par Meek en 1958 quand il a décrit comment l'épithélium se développe à partir des bords de la plaie. Il a démontré qu'un petit morceau de peau augmenterait ses marges et ainsi leur potentiel pour l'expansion des cellules de 100% en coupant la pièce deux fois dans des directions perpendiculaires (figure 1) 8. La théorie a été soutenue par l'utilisation de greffes partielles maillés de peau d'épaisseur pour la transplantation de la peau 9 et dans la peau cicatrisation modèles 10.

Figure 1
Figure 1:. Théorie Meek Selon la théorie de Meek, l'épithélium se développe à partir des bords de la plaie. En augmentant la surface exposée par la technologie de hachage, tissu haché epithelializes blessures de nombreux endroits.

La présente étude est basée sur l'hypothèse que le même principe pourrait être appliqué aux tissus sous-cutanés en plaçant épithélium hachée autour d'un moule. Les cellules épithéliales se mobiliser de greffes hachées (réorganiser), couvrent les domaines de la plaie (migration) et diviser (expansion) afin de former un neoepithelium continue qui couvre la zone de la plaie et sépare le corps étranger (le moule) du corps intérieur ( la figure 2).

Figure 2
Figure 2:. Cartoon d'un moule 3D avec épithélium hachée pour vivo l'expansion des tissus caverneux en fonction de la théorie de Meek En utilisant tissu haché placé sur un moule, puis transplantées dans le tissu sous-cutané, l'hypothèse est que les cellules épithéliales migrent de la les bords du tissu haché, réorganiser, et d'élargir de manière à former un neoepithelium continu qui recouvre la surface de la plaie et qui sépare les corps étrangers (le moule) à partir du corps interne.

Bien que des études in vivo précédents montrent des résultats prometteurs, d'autres améliorations pourraient être atteints par le renforcement des autogreffes de telle sorte que l'épithélium régénéré pourrait mieux résister à 7 traumatisme mécanique. À cet effet, des conditions importantes pour un biomatériau succès ont été identifiés, tels que: simple diffusion des nutriments et des déchets, possibilité de moule d'une manière 3D et de facilité de manipulation chirurgicale. Les conclusions ont été faites que ces besoins peuvent être satisfaits par l'ajout d'un biomatériau composite du tissu haché.

La présente étude vise à développer un échafaudage composé de tissu haché dans le collagène de plastique compressé contenant un noyau de renforcement d'un tissu biodégradable. Par ces moyens, les cellules viables pourraient migrer à partir des particules de tissu et proliférer hachées avec des caractéristiques morphologiques caractéristiques de l'épithélium d'origine (ou de la peau urothélium). Utilisation de la compression en plastique, l'échafaud était de réduired de la taille moyenne de 1 cm à environ 420 um en tant que particules hachées ont été enfermé dans la couche supérieure de collagène. Le tissu de base pourrait être tout polymère mais doit être modifié avec une surface hydrophile afin de relier les couches de collagène couvrant 11.

Le procédé a fourni une intégrité d'échafaudage amélioré en incorporant un filet tricoté se composant de poly (ε-caprolactone) (PCL) dans les deux gels de collagène comprimé en plastique de l'utiliser comme un échafaudage pour la culture de muqueuse vésicale hachée ou de la peau de porc haché. Le produit d'assemblage a été maintenu dans des conditions de culture cellulaire pendant un maximum de 6 semaines in vitro, ce qui démontre la formation réussie d'un stratifié multicouche ou urothélium épithélium squameux de la peau sur le dessus d'une construction d'hybride bien consolidé. La construction est facile à manipuler et peut être suturée en place à des fins d'augmentation de la vessie ou de couverture des défauts de la peau. Toutes les pièces de l'échafaudage pour tissu sont approuvés par la FDA et la techniquepourraient être utilisés pour les procédures en une seule étape par prélèvement de tissu, émincer, compression plastique, et la transplantation au patient comme une intervention unique mis en scène. La procédure peut être effectuée à l'expansion et à la reconstruction tissulaire dans des conditions stériles dans une unité de chirurgie générale.

Protocol

Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés au préalable par le comité du comté de Stockholm sur les animaux et toutes les procédures conformes à la réglementation pour l'utilisation des animaux, ainsi que les lois fédérales pertinentes. 1. Procédures d'animaux Préparation de l'animal pour la chirurgie Préparer la table d'opération avec tous les matériaux et les instruments nécessaires à l'opération dans des conditions stéri…

Representative Results

Cette étude présente une méthode qui montre comment produire un biomatériau pour la transplantation en utilisant la compression plastique de collagène et le tissu haché. Muqueuse vésicale et de la peau peuvent être récoltées puis hachées mécaniquement en petites particules (figure 3). Par compression en matière plastique, les particules hachées sont incorporés dans la matrice de support composite constitué d'un polymère biodégradable qui est placé en p…

Discussion

Cette étude présente une approche facile à utiliser pour produire des plaques de paroi de la vessie avec des tissus autologues pour la transplantation à la table chirurgicale. Les patchs sont formés par la combinaison d'un tricotage de polymère biodégradable dans le milieu et le collagène avec ou sans tissu haché dans les surfaces extérieures, en combinaison avec une compression plastique. Compression plastique est un procédé décrit ci-dessus par d'autres auteurs et peut être définie comme une exp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Swedish Society for Medical Research, the Promobilia Foundation, the Crown Princess Lovisa Foundation, the Freemason Foundation for Children’s Welfare, the Swedish Society of Medicine, the Solstickan Foundation, Karolinska Institutet, and the Stockholm City Council for financial support.

Materials

Silicone catheter 10-French Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X Gibco 31885-023 Plastic compression section 4
24 well plates Falcon 08-772-1 Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine Sigma-Aldrich IRMM469   In vitro culture; Section 5
4% PFA Labmed Solutions 200-001-8 Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol Histolab Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit Vector PK6102 Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol Histolab 1399.01 Immunocytochemistry; Section 6
Adenine Sigma-Aldrich A8626   In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg  Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg  Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood  Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. Vector The blocking solution depends of the  origin of  first antibody Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg    Rimadyl, Orion Pharma, Sweden Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate  Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin  Sigma-Aldrich C8052   In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling Histolab 6150 Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made Plastic compression; Section 4
DMEM Gibco 3188-5023 Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor Sigma-Aldrich E9644   In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) Ethicon Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10437-036 Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth) Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)  Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12 Gibco 31765-027 Plastic compression section 4
Hematoxylin Histolab 1820 Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber DALAB Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888   In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30% Sigma-Aldrich H1009 Immunocytochemistry; Section 6
Insulin Sigma-Aldrich I3536   In vitro culture; Section 5
Isoflurane  Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml Xylocaine, AstraZeneca, Sweden Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL  Baxter, Deerfield, IL Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen Sigma-Aldrich Z377821-1EA Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg  Domitor, Orion Pharma, Sweden Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device Applied Tissue Technologies LLC  Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament) Ethicon Surgery, Section 1
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N Merck Millipore 106462 Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection APL Vnr 336164 Surgery, Section 1
PBS Gibco 14190-094 Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg  Pentobarbital, APL, Sweden Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen First LINK, Ltd, UK 60-30-810 Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15 Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size  Plastic compression; Section 4
Steril gloves Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium Bode Chemie HAMBURG Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin  Sigma-Aldrich T8158   In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC  Sigma-Aldrich T6066 Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit Vector SK4600 Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded) Ethicon Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent) DALAB 41-5213-810 Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride Zoletil, Virbac, France Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips Veet Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium Lundbeck Termination, Section 3

References

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Chamorro, C. I., Zeiai, S., Reinfeldt Engberg, G., Fossum, M. Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair. J. Vis. Exp. (108), e53061, doi:10.3791/53061 (2016).

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