Tissu haché en comprimé Collagen: Un Biotransplant contenant des cellules de réparation Reconstructive simple mise en scène

Summary

L'ingénierie tissulaire comprend souvent dans l'expansion in vitro dans le but de créer des autogreffes pour la régénération tissulaire. Dans cette étude, un procédé pour l'expansion des tissus, la régénération, la reconstruction et in vivo a été mis au point afin de réduire la transformation des cellules et des matières biologiques en dehors du corps.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

La plupart des études d'ingénierie tissulaire sur la transplantation de la peau et des voies génito-urinaire comprennent récoltes de cellules autologues de tissu sain et l'expansion des cellules spécialement aménagées dans les installations de culture de cellules ^1,2.

Après l'expansion des cellules, les cellules sont généralement stockés pour une utilisation ultérieure lorsque le patient est prêt à recevoir l'autogreffe. congélateurs d'azote permettent un stockage à long terme à de basses températures de -150 ° C ou moins. Le processus de congélation doit être prudent et contrôlé afin de ne pas perdre les cellules. Un risque de mort cellulaire est cristallisation de l'eau intracellulaire au cours du processus de décongélation, ce qui peut conduire à la rupture des membranes cellulaires. Cellule gel est généralement effectuée par un refroidissement lent et contrôlé (-1 ° C par minute) en utilisant une concentration élevée de cellules, du sérum foetal bovin, et le diméthylsulfoxyde. Après décongélation, les cellules doivent être traitées à nouveau par l'élimination du milieu de congélation et mise en culture sur des cellules de culture en matière plastique ou d'unbiomatériaux avant la transplantation au patient.

Toutes les étapes mentionnées ci-dessus sont longs, laborieux et coûteux ^3. En outre, tout le traitement in vitro de cellules destinés à la transplantation des patients sont très réglementé et nécessite du personnel et les laboratoires ⁴ bien formés et accrédités. Dans l'ensemble, de se procurer un coffre-fort et fiable processus de fabrication, la technique ne pouvait être établie dans un très petit nombre de centres techniquement avancés et une plus large utilisation dans les troubles chirurgicales courantes est douteux.

Afin de surmonter les limitations de la culture de cellules dans l'environnement du laboratoire, le concept de la transplantation de tissu haché pour l'expansion des cellules in vivo est introduit en utilisant le corps lui-même en tant que bioréacteur. A ces fins, les autogreffes seraient préférentiellement être transplantés sur un moule 3D en fonction de la forme qui est nécessaire pour la reconstruction finale de l'organe d'iINTÉRÊT ^5-7.

À l'origine, l'idée de transplanter épithélium hachée a été présenté par Meek en 1958 quand il a décrit comment l'épithélium se développe à partir des bords de la plaie. Il a démontré qu'un petit morceau de peau augmenterait ses marges et ainsi leur potentiel pour l'expansion des cellules de 100% en coupant la pièce deux fois dans des directions perpendiculaires (figure 1) ^8. La théorie a été soutenue par l'utilisation de greffes partielles maillés de peau d'épaisseur pour la transplantation de la peau ^{9 et} dans la peau cicatrisation modèles ^10.

Figure 1:. Théorie Meek Selon la théorie de Meek, l'épithélium se développe à partir des bords de la plaie. En augmentant la surface exposée par la technologie de hachage, tissu haché epithelializes blessures de nombreux endroits.

La présente étude est basée sur l'hypothèse que le même principe pourrait être appliqué aux tissus sous-cutanés en plaçant épithélium hachée autour d'un moule. Les cellules épithéliales se mobiliser de greffes hachées (réorganiser), couvrent les domaines de la plaie (migration) et diviser (expansion) afin de former un neoepithelium continue qui couvre la zone de la plaie et sépare le corps étranger (le moule) du corps intérieur ( la figure 2).

Figure 2:. Cartoon d'un moule 3D avec épithélium hachée pour vivo l'expansion des tissus caverneux en fonction de la théorie de Meek En utilisant tissu haché placé sur un moule, puis transplantées dans le tissu sous-cutané, l'hypothèse est que les cellules épithéliales migrent de la les bords du tissu haché, réorganiser, et d'élargir de manière à former un neoepithelium continu qui recouvre la surface de la plaie et qui sépare les corps étrangers (le moule) à partir du corps interne.

Bien que des études in vivo précédents montrent des résultats prometteurs, d'autres améliorations pourraient être atteints par le renforcement des autogreffes de telle sorte que l'épithélium régénéré pourrait mieux résister à ⁷ traumatisme mécanique. À cet effet, des conditions importantes pour un biomatériau succès ont été identifiés, tels que: simple diffusion des nutriments et des déchets, possibilité de moule d'une manière 3D et de facilité de manipulation chirurgicale. Les conclusions ont été faites que ces besoins peuvent être satisfaits par l'ajout d'un biomatériau composite du tissu haché.

La présente étude vise à développer un échafaudage composé de tissu haché dans le collagène de plastique compressé contenant un noyau de renforcement d'un tissu biodégradable. Par ces moyens, les cellules viables pourraient migrer à partir des particules de tissu et proliférer hachées avec des caractéristiques morphologiques caractéristiques de l'épithélium d'origine (ou de la peau urothélium). Utilisation de la compression en plastique, l'échafaud était de réduired de la taille moyenne de 1 cm à environ 420 um en tant que particules hachées ont été enfermé dans la couche supérieure de collagène. Le tissu de base pourrait être tout polymère mais doit être modifié avec une surface hydrophile afin de relier les couches de collagène ^{couvrant 11.}

Le procédé a fourni une intégrité d'échafaudage amélioré en incorporant un filet tricoté se composant de poly (ε-caprolactone) (PCL) dans les deux gels de collagène comprimé en plastique de l'utiliser comme un échafaudage pour la culture de muqueuse vésicale hachée ou de la peau de porc haché. Le produit d'assemblage a été maintenu dans des conditions de culture cellulaire pendant un maximum de 6 semaines in vitro, ce qui démontre la formation réussie d'un stratifié multicouche ou urothélium épithélium squameux de la peau sur le dessus d'une construction d'hybride bien consolidé. La construction est facile à manipuler et peut être suturée en place à des fins d'augmentation de la vessie ou de couverture des défauts de la peau. Toutes les pièces de l'échafaudage pour tissu sont approuvés par la FDA et la techniquepourraient être utilisés pour les procédures en une seule étape par prélèvement de tissu, émincer, compression plastique, et la transplantation au patient comme une intervention unique mis en scène. La procédure peut être effectuée à l'expansion et à la reconstruction tissulaire dans des conditions stériles dans une unité de chirurgie générale.

Protocol

Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés au préalable par le comité du comté de Stockholm sur les animaux et toutes les procédures conformes à la réglementation pour l'utilisation des animaux, ainsi que les lois fédérales pertinentes. 1. Procédures d'animaux Préparation de l'animal pour la chirurgie Préparer la table d'opération avec tous les matériaux et les instruments nécessaires à l'opération dans des conditions stéri…

Representative Results

Cette étude présente une méthode qui montre comment produire un biomatériau pour la transplantation en utilisant la compression plastique de collagène et le tissu haché. Muqueuse vésicale et de la peau peuvent être récoltées puis hachées mécaniquement en petites particules (figure 3). Par compression en matière plastique, les particules hachées sont incorporés dans la matrice de support composite constitué d'un polymère biodégradable qui est placé en p…

Discussion

Cette étude présente une approche facile à utiliser pour produire des plaques de paroi de la vessie avec des tissus autologues pour la transplantation à la table chirurgicale. Les patchs sont formés par la combinaison d'un tricotage de polymère biodégradable dans le milieu et le collagène avec ou sans tissu haché dans les surfaces extérieures, en combinaison avec une compression plastique. Compression plastique est un procédé décrit ci-dessus par d'autres auteurs et peut être définie comme une exp…

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3