Tissue engineering inkluderer ofte in vitro ekspansjon for å skape autografts for vev gjenfødelse. I denne studien ble en metode for vev ekspansjon, regenerering, og rekonstruksjon in vivo ble utviklet for å minimere behandling av celler og biologisk materiale utenfor kroppen.
Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.
De fleste vev ingeniørstudier på transplantasjon til huden og urogenitaltractus inkluderer autologe celle avlinger fra friskt vev og celle ekspansjon i spesialutstyrte celle-dyrking fasiliteter 1,2.
Etter celle ekspansjon, blir cellene vanligvis lagres for senere bruk når pasienten er forberedt på å motta autograft. Nitrogen frysere tillate langtidslagring ved lave temperaturer på -150 ° C eller lavere. Fremgangsmåte for frysing må være forsiktig og kontrollert for ikke å miste cellene. En risiko for celledød er krystallisering av intracellulært vann i løpet av tineprosessen, noe som kan føre til ødeleggelse av cellemembraner. Celle frysing utføres vanligvis ved langsom og kontrollert avkjøling (1 ° C per minutt), ved anvendelse av en høy konsentrasjon av celler, føtalt bovint serum, og dimetylsulfoksyd. Etter tining ble cellene må bearbeides på nytt ved å fjerne frysemediet og dyrking av cellekultur plast eller enbiomateriale før transplantasjon tilbake til pasienten.
Alle de ovennevnte fremgangsmåten er tidkrevende, arbeidskrevende og kostbar tre. I tillegg er alle in vitro behandling av celler som er ment for pasienten transplantasjon er svært regulert og krever godt trente og akkrediterte personell og laboratorier 4. Alt i alt, å skaffe en trygg og pålitelig produksjonsprosessen, teknikken kan bare være etablert i et svært lite antall teknisk avanserte sentre og en bredere bruk i vanlige kirurgiske lidelser er tvilsomt.
For å overvinne begrensningene ved celledyrking i laboratorieomgivelser, er begrepet transplantere vev hakket for celle ekspansjon in vivo innføres ved hjelp av kroppen selv som en bioreaktor. For disse formålene, ville autografts fortrinnsvis bli transplantert på en 3D-form i henhold til den form som er nødvendig for den endelige gjenoppbyggingen av organet interest 5-7.
Opprinnelig var ideen om å transplantere hakket epitel presentert av Meek i 1958 da han beskrev hvordan epitel vokser fra kantene av et sår. Han viste at en liten del av huden vil øke dets marginer og derved dets potensial for celle utvidelse med 100% ved å skjære stykket to ganger i perpendikulære retninger (figur 1) 8. Teorien har vært støttet av bruk av stormasket delvis tykkelse hud grafts for hudtransplantasjon 9 og i huden sårtilheling modeller 10.
Fig. 1: Meek teori Ifølge Meek teori, vokser epitelet fra kantene av et sår. Ved å øke området avslørt av hakking teknologi, epithelializes hakket vev sår fra mange steder.
Denne studien er basert på hypoOppgaven at samme prinsipp kan anvendes på det subkutane vev ved å plassere hakket epitel rundt en form. Epitelcellene ville mobiliserer fra hakket transplantasjoner (reorganisere), dekke såret områder (migrerer) og dividere (ekspandere) i for å danne en sammenhengende neoepithelium at dekker sårområdet og skiller fremmedlegeme (mold) fra den indre legemet ( Figur 2).
Fig. 2: Cartoon over en 3D mould med kvernet epitelet i in vivo intracorporal ekspansjon vevet ifølge teorien om Meek ved hjelp av hakket vev legges på en form og deretter transplantert til det subkutane vev, er hypotesen at epitelceller migrere fra kantene til kvernet vevet, omdanne, og ekspandere for derved å danne en kontinuerlig neoepithelium det dekker sårområdet og skiller fremmedlegeme (mold) fra den indre legemet.
Selv om tidligere in vivo studier viser lovende resultater, kan ytterligere forbedringer oppnås ved å forsterke de autografts slik at det regenererte epitel kunne motstå mekanisk traume bedre 7. For disse formålene, ble viktige forutsetninger for en vellykket biomateriale identifisert, for eksempel: enkel diffusjon av næringsstoffer og avfallsprodukter, mulighet til å forme i en 3D måte og easiness av kirurgisk behandling. Konklusjoner ble gjort at disse behov kan oppfylles ved å tilsette en kompositt biomateriale til hakket vev.
Studien sikte på å utvikle et stillas som består av kvernet vev i plast-komprimert kollagen som inneholder en forsterkende kjerne av et biologisk nedbrytbart stoff. Ved hjelp av disse midler, kan levedyktige celler migrere fra hakket vevspartikler og proliferere med morfologiske egenskaper karakteristisk for den opprinnelige epitel (hud eller urothelium). Ved hjelp av plastiske kompresjon, stillaset var redusered i størrelse fra 1 cm til omtrent 420 um som hakket partiklene ble innesluttet i det øvre lag kollagen. Kjernen stoff kan være noen polymer, men må endres med en hydrofil overflate for å interlink med dekker kollagen lag 11.
Fremgangsmåten ga en forbedret stillaset integritet ved inkorporering av en strikket maske som består av poly (ε-kaprolakton) (PCL) i løpet av to plast komprimert kollagen geler ved å bruke det som et stillas for dyrking av kvernet blære slimhinner eller kvernet hud fra svin. Konstruksjonen ble opprettholdt i celledyrkningsforholdene i opptil seks uker in vitro, demonstrere vellykkede dannelsen av en lagdelt, flerlags urothelium eller plateepitel hud epitel på toppen av en godt konsolidert hybrid konstruksjon. Konstruksjonen var lett å håndtere og kan sys på plass i blæren forsterkningsformål eller tildekking av hud defekter. Alle deler av vev stillaset er FDA-godkjent og teknikkenkunne brukes til ett-trinns prosedyrer ved vev høsting, hakking, plast komprimering, og transplantere tilbake til pasienten som en enkelt-iscenesatt intervensjon. Fremgangsmåten kan utføres for vev ekspansjon og rekonstruksjon under sterile betingelser i en hvilken som helst generell kirurgi enhet.
Denne studien viser en lett-å-bruke metode for å fremstille blærevegg plasteret med autologt vev for transplantasjon på operasjonsbordet. Flekkene blir dannet av en kombinasjon av en bionedbrytbar polymer strikking på midten og kollagen med og uten hakket vev i de ytre overflater i kombinasjon med plastiske kompresjon. Plastiske kompresjon er en metode beskrevet tidligere av andre forfattere, og kan defineres som en rask utstøting av væske fra kollagen geler 12,13. Hakket vev av blæren slimhinne eller…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the Swedish Society for Medical Research, the Promobilia Foundation, the Crown Princess Lovisa Foundation, the Freemason Foundation for Children’s Welfare, the Swedish Society of Medicine, the Solstickan Foundation, Karolinska Institutet, and the Stockholm City Council for financial support.
Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
DMEM 10X | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
3'3,'5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
Stainless mold (33x22x10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
Ham´s F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Lucose 25 mg/mL | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
NaOH 1N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
PLGA Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
Scalpel blade – 15 | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
Shaving shears | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
Steril gloves | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
Sterile gowns | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
Sterile drapes | |||
Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg | Preparing the animal for surgery , Section 1 | ||
Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10X (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with distilled water. Dilute to 1X with distilled water. | ||
X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery , Section 1 | |
Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |