对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行电生理记录可实现神经呼吸网络输出信号的监测

摘要

中枢呼吸驱动位于脑干。通过在第四腹根放置电极，可记录离体脑干-脊髓自发产生的呼吸运动输出。该实验方法对于研究药物作用、评估呼吸挑战以及遗传操作对节律性运动行为的影响具有重要价值。

摘要

尽管已知中枢呼吸驱动位于脑干，但其基本功能、发育过程以及对刺激的反应仍有许多方面尚未完全阐明。为了克服在完整动物体内难以接触脑干的困难，可分离脑干及部分脊髓进行研究。该标本被置于人工脑脊液中，其中气体浓度、成分和温度均受到控制并持续监测。呼吸神经网络的输出信号通过放置在第四腹根上的吸吮电极记录。通过这种方式，可直接向脑干施加刺激，并直接记录其效应。所记录的信号与经由膈神经传递至膈肌的吸气信号相关，表现为规律性爆发活动（约每分钟8次爆发）。通过对这些爆发活动（包括频率、幅度、持续时间及曲线下面积）的分析，可精确表征刺激对呼吸神经网络的影响。该方法的主要局限在于标本在出生后早期阶段之外难以维持活性。因此，该技术主要集中于研究新生大鼠中不受外周输入影响的完整呼吸网络。

引言

呼吸是一种由大脑控制的复杂而重要的活动，能够实现氧气（O₂）的摄取和二氧化碳（CO₂）的排出。中枢呼吸驱动由位于脑干的复杂神经网络产生，在哺乳动物¹、两栖动物²、爬行动物³、鸟类⁴以及鱼类⁵中均存在。尽管呼吸研究可以在体内（in vivo）进行，但深入的机制性研究需要直接接触呼吸控制网络。为此，Adrian 和 Buytendijk 开发了一种简化版的金鱼模型，通过在脑干表面放置电极，记录与鳃部通气相关的节律活动⁵。此后，Suzue 于1984年⁶将该方法改进并应用于新生啮齿类动物。这一模型的出现极大地推动了呼吸神经生物学的发展。由于该技术相对简便，本文所介绍的方法适用于对新生啮齿类动物节律性运动行为及其起源开展广泛的基礎研究。

该方法的总体目标是记录呼吸网络产生的、与吸气活动相关的神经信号，即一种称为“拟呼吸”的呼吸样节律。该方法可广泛应用于多种研究目的，旨在探究野生型⁷和转基因⁸动物中吸气活动对呼吸变化或药物干预的响应。由于实验在低温条件下进行，缺乏感觉传入神经，且人工脑脊液（aCSF）中葡萄糖和O₂浓度较高，因此有人对所记录信号的生理相关性提出了质疑。尽管体内（in vivo）与体外（in vitro）条件之间存在明显差异（例如，吸气爆发的频率），但呼吸网络核心组分的存在⁶使得研究与重要稳态功能相关的稳定节律成为可能^9,10。

开发和使用该技术的原理在于便于直接接触呼吸网络的脑干组成部分，这些部分在体内极难接近，尤其是在新生儿中。in vivo 条件下，脑干处于严格控制的环境中：所记录的节律不受来自肺部或颈动脉体的外周传入信号的调节，从而可使研究集中于中枢呼吸驱动本身¹¹。因此，可通过该途径施加刺激并记录输出信号。与体积描记法记录相比，呼吸节律受到全身各组成部分（e.g., 肺扩张、外周化学感受器）的调节，难以施加精确的刺激。

在新生大鼠中，该方案包括记录离体脑干和截短脊髓的第四腹根信号，标本置于人工脑脊液（aCSF）中维持。脑干-脊髓制备物产生的节律由单个慢爆发组成，这些爆发与吸气信号相关联。 ⁹分离的脑干-脊髓标本在出生后第0至4天（P0 - P4）的大鼠中易于记录 ⁷该方法常用于评估呼吸网络对低氧的反应，以及对高碳酸血症、酸中毒或药物的反应。本文介绍了一种急性低氧实验方案。该刺激通过撤除O₂₂ 在aCSF中；该方法常用于评估对缺氧损伤的耐受性和反应性。该方案在第一分钟内即引发节律抑制 直到缺氧暴露结束图1)¹²该抑制效应在缺氧后恢复期间得以逆转 ¹²关于实验设计，需要注意的是，位于脑干头端的脑桥对节律发生器具有抑制作用 ⁸因此，包含完整脑干和头段脊髓的标本表现出较慢的节律。在分离标本中是否包含脑桥，应根据实验目的来确定。 ¹³；要研究脑桥对延髓网络的影响，需在有脑桥和无脑桥的情况下进行记录，以比较结果 ¹⁴此外，该技术的一个优势在于可延伸制备样本的吻侧部分，以包含中脑和/或间脑区域。 ^15,16，从而可以评估这些区域对脑桥-延髓呼吸网络的影响。

方案

本方法需使用动物实验对象，已获拉瓦尔大学动物伦理委员会批准（方案编号 # 2012-170）。

1. 设置与准备

1. 溶液
   1. 根据以下配方制备 aCSF 储存液 ^7,17其他具有浓度变化的配方可在文献中找到。储存储备液于4 °C，最长可保存一个月。
      1. 盐溶液：加入75.39 g NaCl（终浓度129 mM）；2.5 g KCl（终浓度3.35 mM）；0.81 g NaH2PO4（终浓度0.58 mM）；2.33 g MgCl2（终浓度1.15 mM）；1.85 g CaCl2（终浓度1.26 mM）。溶于800 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。
      2. 碳酸氢盐溶液：加入17.65 g NaHCO₃₃ （终浓度21 mM）。先溶于900 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。碳酸氢盐浓度的改变将导致pH值的变化。
      3. 葡萄糖溶液：加入54.06 g葡萄糖（终浓度30 mM），溶于400 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至500 ml。
   2. 通过将100 ml盐溶液、100 ml碳酸氢盐溶液和50 ml葡萄糖溶液加入1 L蒸馏水中进行稀释，配制aCSF。4 °C保存备用。
   3. 通过加热和拉伸玻璃管制备玻璃电极，直至其断裂。使用前将尖端打磨光滑。只要保持清洁，该电极可多次重复使用。
2. 实验装置
   注意：设置细节如下所示 图2.
   1. 打开放大器、移动平均器、数据采集系统、温度控制器和泵。检查信号放大倍数（增益 = 10,000）、滤波设置（低频阈值 10 Hz；高频阈值 5 kHz）以及原始信号模数转换的采样率（2.5 kHz）。
   2. 用aCSF填充瓶子，并用碳合气（95% O₂，5% CO₂）通气₂，5% CO₂₂在记录室（体积5 ml）中以4 ml/min的流速灌注含气泡并预热的aCSF，维持记录室温度为26（±1）°C。在这些标准条件下，pH值应为7.4。
   3. 在解剖室附近准备一个50 ml注射器，内含50 ml室温且通入碳合气（carbogen）的aCSF。
   4. 打开计算机并启动记录软件。

2. 解剖

1. 称重并目视确定动物性别（雄性肛殖距较长 ，而雌性肛殖距较短 ；雄性生殖器通常呈深色，雌性生殖器则呈粉红色）。
2. 通过以下任一方法对新生啮齿类动物进行麻醉：低温麻醉（将动物完全浸入冰中4–5分钟¹⁸）、注射麻醉（按4 ml/kg剂量注射equitensine）¹⁹，或吸入挥发性麻醉剂（异氟烷²⁰或乙醚²¹）。通过观察肢体回缩反射是否消失来确认麻醉深度是否足够。
3. 将动物腹面朝下置于实验台面上。使用手术刀在前囟（bregma）水平位置（可通过皮肤和颅骨观察到）对头部进行冠状面切割。此步骤应在动物麻醉后立即进行。
4. 使用手术刀在前肢下方对躯体进行冠状面切割。
5. 使用手术剪和细剪以及镊子去除皮肤、肌肉、脂肪组织和内脏。由于此阶段骨骼较软，操作时需小心避免损伤神经系统。该步骤在实验台面上进行。
6. 将制备好的标本放入解剖室中。使用注射器中储存的人工脑脊液（aCSF）对组织进行氧合。从此时起至记录结束，均需使用显微镜进行操作。
7. 在标本背侧，使用手术剪和细剪及镊子沿中轴线从头端至尾端剪开颅骨和椎骨。打开切开的颅骨和椎骨以暴露神经组织。使用注射器中储存的aCSF对组织进行氧合。
8. 使用镊子去除覆盖在神经组织表面的蛛网膜（一层薄膜组织）。保留紧贴神经组织的软脑膜和血管。使用注射器中储存的aCSF对组织进行氧合。
9. 将标本背侧朝下放置，用剪刀在固定标本的同时剪断神经和结缔组织，小心地将脑干和脊髓下拉。也可采用背侧入路方式。尽可能保留神经根和神经的长度。去除骨骼以分离出脑干和脊髓。使用注射器中储存的aCSF对组织进行氧合。
10. 使用手术刀切断小脑及其余头端结构并予以去除。使用针头中储存的aCSF对组织进行氧合。
11. 根据实验设计需要，可选择使用手术刀在小脑下动脉前方进行冠状切面切除脑桥²²。需注意，保留完整脑桥会使大鼠的节律变慢，并完全抑制小鼠的节律。仅包含脑桥尾侧部分的标本可在C4神经根处表现出频率稳定的呼吸样活动。

3. 记录

1. 将制备好的标本置于记录室中，腹面朝上。用固定针将标本固定在脊髓最下部和脑干最前端。
2. 使用通过针头与电极相连的注射器，向外拉动注射器活塞，使电极内产生负压（玻璃尖端直径：150 - 225 µm），从而部分充满人工脑脊液（aCSF）。
3. 利用显微操作器，小心地将电极靠近第四腹根之一。其他腹根也可能表现出类似呼吸的活动（例如，舌下神经 XII，C1 腹根）。
4. 通过拉动注射器活塞，在电极储液腔内产生负压，轻柔地吸住神经根丝。然后小心移动电极，使其紧贴脊髓表面。
   注意：理想情况下，根丝的直径应与电极开口大小相匹配，从而在电极内外腔之间形成密封。由于此类记录通常使用差分放大器，电极内部与记录室之间的任何泄漏都会降低信号质量，并增加背景噪声的去除难度。
5. 开始记录。
6. 在常氧条件下（即，用碳合气饱和的 aCSF：95% O₂ 和 5% CO₂）至少记录 20 分钟，以确定标本的基础节律参数。
7. 将灌流液从碳合气饱和的 aCSF 切换为刺激性 aCSF（即，用 95% N₂ 和 5% CO₂ 饱和以产生缺氧刺激），持续 15 分钟。根据实验方案调整刺激持续时间。在记录文件和动物数据表中记录暴露时长。尽可能使用不锈钢管连接 aCSF 瓶与记录室，以避免气体向管外扩散。
8. 将灌流液重新切换回标准的碳合气饱和 aCSF，至少灌流 15 分钟以进行恢复期记录。在记录文件和动物数据表中记录此过程。
9. 结束记录。

4. 统计分析

1. 根据整合信号，计算频率（以每分钟脉冲次数表示，单位为 bursts/min）、振幅（基线与脉冲峰值之间的差值，单位为 mV）、脉冲持续时间（脉冲起始到结束的持续时间，单位为 s）以及脉冲面积（整合信号中脉冲曲线下面积，单位为 mV·s）图3).
2. 在常氧（基线）、低氧（刺激）和低氧后（刺激后恢复）条件下，分别取每种条件下记录的最后5分钟数据进行平均，计算频率、振幅、簇状放电持续时间和簇状放电下面积。每种条件的初始阶段不进行分析，因为在切换灌流液与记录室中人工脑脊液（aCSF）达到均匀混合之间存在延迟。
3. 表达随后刺激（即， 缺氧）和刺激后（即， 以相应记录的基线值的百分比表示缺氧后恢复值。结果以均值 ± 标准差表示。

结果

如引言中所述，该技术最重要的优势之一是能够直接接触脑干以施加各种刺激。例如，本实验中应用了低氧刺激。 图1.A.B. 展示了完整实验方案的记录，包括常氧和低氧条件。 图1.C.E. 显示在常氧条件下记录的节律（即，用95% O₂混合气体饱和的aCSF₂ 和5% CO₂ 在 26 °C）。如先前在此完全相同的制备中已证实的那样 ¹¹，频率约为每分钟8次爆发，振幅约为0.800 mV。需要注意的是，由于不同样本之间存在显著差异，振幅仅具有参考意义。上部曲线表示积分信号，下部曲线表示原始信号。 图1.D.F. 显示在缺氧条件下记录的节律（即，用95% N₂混合5% CO₂饱和的aCSF₂ 和5% CO₂₂ 在 26 °C）。如先前所描述的那样²³在缺氧期间，频率显著降低。 图1.G.H. 显示单次爆发，呈现常氧...

讨论

准确量化呼吸活动可能具有挑战性。事实上，呼吸是一种既可自动进行又可受意识控制的功能，且会根据环境、机体需求、情绪状态和行为而发生调节。该技术的优势在于能够分离出产生呼吸指令的神经元结构。因此，脑干-脊髓离体标本的电生理记录与体积描记法分别作为互补技术，可用于在体外和体内研究完整的呼吸神经网络in vitro和in vivo。在脑干-脊髓离体标本上进行膜片钳记录（例如，从腹侧表面接近）也是可行的，可在保持完整的呼吸神经网络环境中研究特定神经元²⁴。

该方案包含若干关键步骤，主要集中在解剖过程。为避免神经组织损伤，所有解剖操作均应迅速而精确地进行。神经组织不得受损，并须通过持续浸入人工脑脊液（aCSF）中加以小心保护。如前所述，神经根丝与电极之间连接的质量是第二个关键步骤。通过吸吮根丝可使电极更贴近制备样本。虽然电极与脑干之间的接触可提高封接质量，但必须避免造成凹陷或对样本产生物理性损伤。

分析时应始终使用积分信号，但原始信号有助于区分真实的簇状放电与背景...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	在通风橱中使用
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-葡萄糖	Bioshop	GLU501
碳酰气	Linde	343-02-0006
温度控制器	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
吸引电极	A-M Systems, Everett, WA, USA	型号 573000
差分交流放大器	A-M Systems, Everett, WA, USA	型号 1700
移动平均器	CWE, Ardmore, PA, USA	型号 MA-821
数据采集系统	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	型号 DI-720
LabChart 软件	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism 软件	Graphpad, La Jolla, CA, USA
解剖室	塑料盒（例如培养皿）即可
记录室	自制
底座	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
显微操作器	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
底座	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
蠕动泵	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
法拉第屏蔽笼	自制
计算机