Introduction
Ademhaling is een complex en levensactiviteit gecontroleerd door de hersenen, waardoor dizuurstof (O 2) opname en kooldioxide (CO 2) verwijdering. De centrale ademhalingsfrequentie wordt gegenereerd door een complex netwerk in de hersenstam beide zoogdieren 1, 2 amfibieën, reptielen 3, 4 vogels en vissen 5. Zelfs als de studie van de ademhaling in vivo kan worden verwerkt, nauwkeurig mechanistische onderzoeken vereisen directe toegang tot de luchtwegen besturingsnet. Hiertoe Adrian en Buytendijk ontwikkelde een verminderde preparaat goud vis, waarbij de hersenstam registratiedrager elektroden gegenereerd ritme geassocieerd met gill ventilatie 5. Deze benadering werd vervolgens Suzue aangepast 1.984 6 voor gebruik bij pasgeboren knaagdieren. De komst van deze voorbereiding heeft geleid tot een significante vooruitgang in de luchtwegen neurobiologie. Aangezien het betrekkelijk eenvoudig is de techniek voorgesteld here vatbaar is voor een breed scala aan fundamentele onderzoek van ritmische motor gedrag en hun oorsprong bij pasgeboren knaagdieren.
Het algemene doel van deze methode is het neurale correlaat van inspiratoire activiteit opnemen, respiratoire-achtig ritme genoemd fictieve ademhaling, geproduceerd door de luchtwegen netwerk. Deze methode kan worden gebruikt in een breed scala van onderzoek doelstellingen, gericht op inspiratoire reacties op de luchtwegen variaties of farmacologie zowel wild type 7 en 8 transgene dieren. Aangezien experimenten worden uitgevoerd bij een lage temperatuur, zonder sensorische afferenten en onder omstandigheden waarbij de concentratie van glucose en O2 in de aCSF hoog zijn vragen gerezen over de fysiologische relevantie van het opgenomen signaal. Hoewel er duidelijke verschillen tussen de in vivo en in vitro (bijv., De frequentie van inspiratoire bursts) blijft het een feit dat de aanwezigheid vande kernelementen van de luchtwegen netwerk 6 het mogelijk om een robuuste ritme verbonden met een vitale functie homeostatische 9,10 bestuderen.
De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om directe toegang tot de hersenstam elementen van de luchtwegen netwerk, die moeilijk te bereiken in vivo, in het bijzonder bij pasgeborenen vergemakkelijken. De hersenstam wordt onder strikt gecontroleerde omstandigheden geplaatst: de opgenomen ritme wordt niet gemoduleerd door perifere afferente input van de longen of de halsslagader lichamen, waardoor het onderzoek om zich te concentreren op het centrale respiratoire drive zelf 11. Daarom is deze toegang gebruikt voor stimuli toe te passen en registreer het uitgangssignaal. In tegenstelling tot opnames plethysmografie, wordt de ademritme gemoduleerd door alle componenten in het lichaam (bv., Long- distensie, perifere chemosensors), waardoor het moeilijk nauwkeurige stimuli passen.
In eenewborn rat, het protocol bestaat uit het opnemen van de vierde ventrale wortel signaal op een geïsoleerde hersenstam en een afgeknotte ruggenmerg, gehandhaafd in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF). Het ritme die door de hersenstam ruggenmerg preparaten bestaat uit afzonderlijke langzame bursts die verband houden met de inspiratiefase signaal 9. Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen zijn gemakkelijk opneembaar bij ratten van postnatale dag 0-4 (P0 - P4) 7. Deze benadering wordt gewoonlijk gebruikt om de hypoxische respons van de luchtwegen netwerk, en ook de reactie op hypercapnie, acidose of drugs evalueren. Een acute hypoxie-protocol wordt hier gepresenteerd. Deze stimulering wordt verkregen door intrekking van O2 in het aCSF; Deze benadering wordt gewoonlijk gebruikt om de tolerantie en gevoeligheid voor hypoxische beledigingen beoordelen. Het protocol induceert een ritme depressie vanaf de eerste minuut tot het einde van de blootstelling aan hypoxie (figuur 1) 12. Deze depressie wordt omgekeerdtijdens posthypoxische herstel 12. Wat betreft de experimentele opzet, is het belangrijk op te merken dat de pons, bij het rostrale deel van de hersenstam, heeft een remmende werking op de ritmegenerator 8. Zo, de voorbereidingen van de volledige hersenstam en rostrale ruggenmerg weer een lager ritme. Opname van de pons in het geïsoleerde monster voor de opname wordt bepaald afhankelijk van de doelstelling van het experiment 13; de studie van pontine invloed op de medulla oblongata netwerk zou opnames met en zonder pons vereisen de resultaten 14 vergelijken. Bovendien is een van de voordelen van deze techniek is de mogelijkheid om de rostrale deel van het preparaat mesencefalische en / of diencephalic gebieden 15,16 omvatten, waardoor het effect van deze gebieden op het ponto-medullaire respiratoire netwerk beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze methode vereist het gebruik van proefdieren, toegestaan door Laval University Dier Ethische Commissie (protocol # 2012-170).
1. Setup en Voorbereiding
- Oplossingen
- ACSF Bereid voorraadoplossingen volgens de volgende recepten 7,17. Andere recepten met concentratie variaties zijn in de literatuur. Winkel stock oplossingen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
- Zout oplossing: voeg 75,39 g NaCl (129 mM final); 2,5 g KCl (3,35 mM final); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mmol final); 2,33 g MgCl2 (1,15 mmol final); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Oplossen in 800 ml gedestilleerd water en vervolgens te vullen tot 1 l met gedestilleerd water.
- Bicarbonaat oplossing: voeg 17,65 g NaHCO3 (21 mm definitief). Oplossen in 900 ml gedestilleerd water en vervolgens te vullen tot 1 L met gedestilleerd water. Variaties van de bicarbonaatconcentratie leiden tot schommelingen in de pH.
- Glucose-oplossing: voeg 54,06g glucose (30 mM eind). Oplossen in 400 ml gedestilleerd water vul aan met water tot 500 ml.
- Bereid door verdunning aCSF 100 ml zoutoplossing, 100 ml bicarbonaatoplossing en 50 ml glucose-oplossing in 1 liter gedestilleerd water. Bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
- Bereid een glazen elektrode door opwarming en stretching een glazen buis tot het breekt. Zand langs de tip voor gebruik. De elektrode kan worden hergebruikt veel tijd zolang het schoon blijft.
- ACSF Bereid voorraadoplossingen volgens de volgende recepten 7,17. Andere recepten met concentratie variaties zijn in de literatuur. Winkel stock oplossingen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
- Experimentele opstelling
Opmerking: De set-up gegevens zijn weergegeven in figuur 2.- Zet de versterker, bewegende middelingelement, data-acquisitie systeem, temperatuurregelaar en pomp. Controleer de signaalversterking (winst = 10.000), de filtratie (lage drempel, 10 Hz, hoge drempel, 5 kHz), en de sampling rate van de analoge naar digitale conversie van de ruwe signaal (2,5 kHz).
- Vul een fles met aCSF en bel met carbogen (95% O 2 2). Leiden tot een bubbled- en opgewarmde aCSF stroming in de opname kamer (volume 5 ml) en 4 ml / min. Houd de temperatuur van de opname kamer bij 26 (± 1) ° C. pH moet 7,4 in deze algemene voorwaarden.
- Houd 50 ml RT en carbogen geborreld aCSF in een 50 ml spuit in de buurt van de dissectie kamer.
- Zet de computer en start de opname software.
2. Dissection
- Weeg en visueel het geslacht van het dier te bepalen (mannetjes hebben een langere ano-genitale afstand, terwijl de vrouwtjes hebben een korte ano-genitale afstand; mannetjes genitaliën zijn vaak donker terwijl de vrouwelijke genitaliën zijn roze).
- Verdoven pasgeboren knaagdieren door een van de volgende mogelijkheden: cryoanesthesia (het dier ijs volledig onderdompelen gedurende 4 - 5 min 18), injectie (equitensine bij 4 ml / kg) 19 of inhalatie van vluchtige anesthetica (isofluraan 20 of ether 21). Confirm een adequate vlak van anesthesie door de afwezigheid van een poot terugtrekking reflex.
- Leg het dier op de bank, ventrale gezicht naar beneden. Sectie de rostrale deel van het hoofd coronaalwaarts met een scalpel in de bregma niveau (zichtbaar door de huid en de schedel). Voer deze stap onmiddellijk nadat het dier is verdoofd.
- Sectie lichaam coronaalwaarts met een scalpel onder de voorste leden.
- Verwijder de huid, spieren, vetweefsel en viscus met chirurgische en dun schaar en tang. Aangezien botten zijn zacht op deze leeftijd, wees voorzichtig aan het zenuwstelsel niet beschadigen. Voer deze stap op de bank.
- Plaats de voorbereiding in de dissectie kamer. Gebruik de aCSF opgeslagen in de spuit met de bereiding van zuurstof. Vanaf dit punt aan het einde van de opname gebruikt een microscoop.
- Aan de dorsale zijde van de voorbereiding, snijd de schedel en wervels van de rostraal van de caudale deel langs de medium-as met chirurgische en dun schaar en tang. Open de cut schedelen wervels om het zenuwweefsel bloot. Gebruik de aCSF strored in de spuit aan de voorbereiding van zuurstof.
- Met de tang, verwijder de Arachnoid membraan, een dun weefsel dat het oppervlak van het zenuwweefsel. Bewaar de pia mater en bloedvaten tegen het zenuwweefsel. Gebruik de aCSF opgeslagen in de spuit met de bereiding van zuurstof.
- Plaats het preparaat met de dorsale gezicht naar beneden, en zorgvuldig omlaag brengen van de hersenstam en het ruggenmerg door het snijden van de zenuwen en bindweefsel met de schaar terwijl de voorbereiding op zijn plaats. Een dorsale benadering is ook mogelijk. Houd de wortels en zenuwen zo lang mogelijk. Verwijder de botten naar de hersenstam en het ruggenmerg isoleren. Gebruik de aCSF opgeslagen in de spuit met de bereiding van zuurstof.
- Verwijder het cerebellum en de resterende rostrale structuren snijden ze met de scalpel. Gebruik de aCSF opgeslagen in de naald aan de voorbereiding van zuurstof.
- Eventueel afhankelijk ExperimenTal ontwerp, verwijder de pons met de scalpel door een coronale sectie anterior aan de inferieure cerebellaire slagader 22. Merk op dat het houden van de hele pons vertraagt het ritme bij ratten en volledig remt in muizen. Preparaten die alleen het caudale deel van de pons bevatten vertonen een ademhalings-achtige activiteit met een stabiele frequentie van de C4 wortel.
3. Opname
- Plaats de voorbereiding in de opname kamer, ventrale zijde naar boven. Bevestig het preparaat met pennen in het laagste gedeelte van het ruggenmerg en rostrale-grootste gedeelte van de hersenstam.
- Met behulp van een injectiespuit verbonden met de elektrode van de naald, leiden tot een depressie bij de elektrode (glas tip diameter: 150 - 225 um) door het uittrekken van de spuit zuiger, teneinde gedeeltelijk vullen elektrode met aCSF.
- Met behulp van een micromanipulator voorzichtig plaatst de elektrode nabij een van de vierde ventrale wortels. Andere ventrale wortels zou ook kunnen presenteren een respiratoire-achtige activiteit (e.g., XII hersenzenuw, C1 ventrale root).
- Leiden tot een depressie in de elektrode tank via de spuit door het uittrekken van de zuiger om voorzichtig zuigen de zenuw worteltje. Dan gaan voorzichtig de elektrode toe te passen tegen het ruggenmerg.
Opmerking: Idealiter zou de grootte van de worteltje overeenkomt met het formaat van de elektrode opening en creëert zo een afdichting tussen de interne en externe compartimenten van de elektrode. Aangezien verschilversterkers gewoonlijk gebruikt voor dergelijke opnamen openingen tussen de binnenzijde van de elektrode en de opname kamer vermindert de kwaliteit van het signaal en maakt het moeilijk om achtergrondruis te elimineren. - Start de opname.
- Noteer het ritme door het preparaat onder normoxische omstandigheden (dwz aCSF geborreld carbogen: 95% O2 en 5% CO2) gedurende ten minste 20 min op de basislijn parameters van het preparaat te bepalen.
- Schakel de perfusie van-carbogen geborreld aCSF aanstimulus aCSF (dwz geborreld met 95% N2 en 5% CO2 gedurende hypoxie stimulus) gedurende 15 min. Alter blootstellingsduur, afhankelijk van de experimentele protocol. Noteer de blootstelling duur van de opname en dierlijke datasheet. Gebruik roestvrij stalen buizen tussen de aCSF fles en de kamer zoveel mogelijk te vermijden gasdiffusie naar de buitenzijde van de buis.
- Schakel de perfusie terug naar standaard-carbogen geborreld aCSF gedurende minstens 15 min voor een herstel van de opname. Noteer deze op de opname en dier datasheet.
- Het einde van de opname.
4. Statistische analyse
- Van het geïntegreerde signaal, berekent de frequentie als het aantal bursts per minuut (uitgedrukt in bursts / min), de amplitude als het verschil tussen de basislijn en de piek van de burst (uitgedrukt in mV), de salvoduur de duur van het begin tot het einde van de burst (uitgedrukt in s), de burst gebied als het gebied onder de curve van de burst op het geïntegreerde signaal (in mV · s) (figuur 3).
- Bereken de frequentie, amplitude, duur en barstte barsten gebied onder normoxische (baseline), hypoxie (stimulus) en posthypoxische (post-stimulus) herstel omstandigheden als het gemiddelde van de laatste 5 minuten van de opnames voor elke conditie. Heeft het eerste gedeelte van elke voorwaarde niet te analyseren omdat er een vertraging tussen het schakelen van de perfusie en aCSF homogenisering in de opname kamer.
- Express dan stimulus (bijvoorbeeld hypoxie) en post-stimulus (dwz posthypoxische) restwaarde als percentage van de basislijn-waarden voor de overeenkomstige opname. Geef de resultaten als gemiddelden ± SD
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals vermeld in de inleiding, een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is de directe toegang tot de hersenstam op verschillende stimuli passen. Als voorbeeld werd hypoxie hier toegepast. Figuur 1. AB toont een volledig protocol opname, zowel normoxische en hypoxische omstandigheden. Figuur 1.CE toont het ritme opgenomen in normoxische omstandigheden (dwz aCSF geborreld met 95% O2 en 5% CO 2 bij 26 ° C). Zoals eerder aangetoond in deze exacte preparaat 11, de frequentie ongeveer 8 bursts / min, en de amplitude ongeveer 0,800 mV. Merk op dat de amplitude is slechts indicatief vanwege zijn belangrijke inter-voorbereiding variaties. De bovenste trace vertegenwoordigt het geïntegreerde signaal terwijl de onderste lijn vertegenwoordigt het grove signaal. Figuur 1.DF toont het ritme opgenomen in hypoxische omstandigheden (bijv., ACSF geborreld met 95% N2 en 5% CO <sub> 2 bij 26 ° C). Zoals eerder gekenmerkt 23, de frequentie sterk afgenomen tijdens hypoxie. Figuur 1.GH toont een enkele uitbarsting met typische patronen in normoxische en hypoxische condities.
Figuur 1. Voorbeelden van opnamen verkregen uit hersenstam ruggenmerg voorbereidingen. Uitgang van de ademhalingsorganen opgenomen van de C4 ventrale wortel van de voorbereidingen van P4 ratten onder normoxische, hypoxische en posthypoxische herstel omstandigheden ((A) geïntegreerd signaal en (B) ruwe signaal) . Voor elke voorwaarde, vergrote opnamen ((C) geïntegreerd normoxische signaal; (D) geïntegreerd hypoxische signaal; (E) ruwe normoxische signaal; (F) rauw hypoxie signaal) en single burst ((G) normoxische bursten (H) hypoxische burst) getoond. Zoals vermeld in de tekst, dan kunt u er rekening mee dat de amplitude moet zorgvuldig worden geïnterpreteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Lijsten schema van de Setup. Het borrelde aCSF wordt opgewarmd en gestuurd door een pomp in de opname kamer. aCSF overschot in de opname kamer is opgezogen door een pomp en afgevoerd. De opname kamer is verbonden met de grond en de temperatuurregelaar. De elektrode-uitgang wordt direct doorgegeven aan de versterker, dan naar de bewegende gemiddelde waardebepaler en de data-acquisitie-systeem, en tenslotte de computer. Klik hier to bekijk een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3. Geanalyseerd Burst parameters. De frequentie wordt berekend als het aantal bursts per minuut (uitgedrukt in bursts / min), de amplitude als het verschil tussen de basislijn en de piek van de burst (uitgedrukt in mV), de salvoduur als de duur van het begin tot het einde van de uitbarsting (uitgedrukt in s), de burst gebied als het gebied onder de curve van de burst op geïntegreerde signaal (uitgedrukt in mV · s). Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nauwkeurige kwantificering van respiratoire activiteit kan een uitdaging zijn. Inderdaad, de ademhaling is een functie die zowel automatisch als vrijwillig kan zijn, en dat wordt gemoduleerd volgens het milieu, de behoeften van het lichaam, de emotionele toestand en het gedrag. Het voordeel van deze techniek is het isoleren van neurale elementen bevoegd zijn de opdracht luchtwegen. Aldus elektrofysiologische opnames van de hersenstam ruggenmerg preparaten en plethysmografie complementair technieken om het gehele neuronale luchtwegen netwerk, respectievelijk bestuderen in vitro en in vivo. Patch-clamp in de hersenstam ruggenmerg preparaat (bijv., Het naderen van het ventrale oppervlak) zijn eveneens denkbaar en het bestuderen van een bepaald neuron in een bewaarde respiratoire netwerk 24.
Dit protocol bevat een aantal kritische stappen, vooral in de dissectie. Om zenuwweefsel schade te voorkomen,alle dissectie stappen het moet snel en nauwkeurig worden uitgevoerd. Het zenuwweefsel mag niet worden beschadigd en worden zorgvuldig bewaard door voortdurende onderdompeling in aCSF. Zoals eerder vermeld, de kwaliteit van de verbinding tussen de zenuw worteltje en de elektrode een tweede kritische stap. Aspiratie van het worteltje kan de elektrode dichter bij de voorbereiding te brengen. Terwijl het contact tussen de elektrode en de hersenstam de kwaliteit van de afdichting te verbeteren, moet men vermijden dat een depressie of fysiek te beschadigen het preparaat.
De geïntegreerde signaal moet altijd worden gebruikt voor de analyse, maar rauw signalen kunnen nuttig zijn om de juiste barst van achtergrondgeluid te onderscheiden zijn. Bovendien kan een luidspreker worden toegevoegd aan het setup om het ritme te luisteren en te bepalen kwaliteit van het signaal en achtergrondgeluid aanwezig door auditie. Inderdaad zouden sommige variaties in de achtergrond basislijn aanwezig zijn door elektrische interferentie en veroorzaken een onstabiele basislijn. Dergelijke Interfwijzingen moeten worden voorkomen door het controleren van de kabelverbindingen en de wortel uitzuigen door de elektrode. Omdat bovendien burst amplitude afhankelijk van zowel achtergrondruis en de verbinding tussen de wortel en de elektrode, frequentie veel van een betrouwbare parameter. Aldus zullen burst amplitude altijd uitgedrukt als percentage van de basislijn waarden inter-individuele variaties vanwege een verkeerde instelling te voorkomen.
Beperkingen van de techniek wordt bepaald door de leeftijd van het dier waarvan het preparaat kan worden gerealiseerd. Dit maakt een nauwkeurige studie van de oprichting van de centrale luchtwegen rijden bij de geboorte, die zeer interessant en klinisch relevant, maar het richt zich op deze jonge leeftijd en kan niet worden uitgebreid tot latere leeftijd. Oudere volwassenen kan in arterieel geperfuseerd werkende hart-hersenstam preparaten 25, maar met aanzienlijke wijzigingen protocol (zie hieronder). Een geïsoleerde hersenstam ruggenmerg preparaat uit volwassen cavia's is te ontwikkelened door Morin-Surun et al. 26, waarbij de hersenstam wordt geperfuseerd via de basilaire slagader en het ritme is opgenomen in de XII hersenzenuw. Een andere beperking is de duur van het experiment. Het preparaat kan niet langer dan 7 uur worden bewaard in de hiervoor beschreven omstandigheden 6. Daarom is deze techniek niet geschikt voor langdurige experimenten, zelfs wanneer preparaten van kikkervisjes (zie hieronder) zijn gehouden 24 uur in het laboratorium.
Verscheidene modificaties kunnen worden toegepast om deze techniek. Hier is hypoxische challenge uitgevoerd, maar andere gas variaties zijn ook denkbaar (bv., Hypercapnie 27 evenals pH variaties 28). Op dezelfde wijze kan het preparaat worden geperfuseerd met aCSF waarbij geneesmiddelen zijn opgelost en aangebracht op de hersenstam als voorbehandeling 29 of 30 tijdens de opname. In dit geval kan het ritme worden versneld of vertraagd 29 down 30 volgens het experimentele geneesmiddel. Bovendien, met een gecompartimenteerde opname kamer, verschillende aCSF kan worden aangebracht op selectieve delen van de bereiding 6 en temperatuurwisselingen 9 kunnen worden toegepast. Deze compartimentering maakt de studie van de betrokkenheid van geselecteerde delen van de hersenstam stimulus-geïnduceerde effecten. Terwijl de gepresenteerde techniek maakt gebruik van pasgeboren ratten is ook toepasbaar op andere diermodellen. Met behulp van een protocol vergelijkbaar met die toegepast voor ratten, muizen kunnen worden gebruikt vanaf zwangerschapsdiabetes dag 16 (E16) 12 tot P4. Het belangrijkste verschil is de noodzaak om op te warmen en carbogen-bubble de aCSF tijdens de dissectie. Schildpadden, kikkervisjes en volwassen kikkers kunnen ook worden gebruikt; Maar deze soorten vereisen verschillende dissectie technieken en aanpassingen van de samenstelling van de aCSF.
Deze techniek kan ook worden gekoppeld patch-clamp opnamen op de rostrale zijde van het preparaat 31, waardoorgelijktijdige visualisatie van het netwerk uitgangssignaal en de activiteit van een bepaalde cel van het netwerk. Spanningsgevoelige kleurstof beeldvorming kan ook bij pasgeboren ratten hersenstam ruggenmerg preparaten worden toegepast op de geactiveerde gebieden op de ventrale zijde van de hersenstam 32 lokaliseren. c-fos-analyse in de preparaten kunnen worden gerealiseerd om de neurale populaties betrokken bij inademing specifieke oplossingen te onderzoeken. Tenslotte kan het preparaat worden aangepast aan andere organen houden zoals het hart 25, ribben 6 of fysiologische slagader perfusie met andere fysiologische ritme 33. Echter, zouden deze belangrijke wijzigingen andere dissectie protocollen vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
- Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
- Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
- Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
- Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
- Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
- Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
- Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
- Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
- Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
- Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
- Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
- Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
- Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
- Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
- Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
- Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
- Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
- Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
- Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
- Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
- Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
- Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
- Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
- Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
- St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).
