Introduction
La respiration est une activité complexe et vital commandé par le cerveau, ce qui permet dioxygène (O 2) et l'absorption du dioxyde de carbone (CO 2) d'élimination. L'entraînement respiratoire centrale est généré par un réseau complexe situé dans le tronc cérébral dans les deux mammifères 1, 2 amphibiens, reptiles, oiseaux 3 4 et 5 poissons. Même si l'étude de la respiration peut être traitée in vivo, les enquêtes mécanistes précises nécessitent un accès direct au réseau de contrôle respiratoire. À cette fin, Adrian et Buytendijk développé une préparation de poisson rouge réduite, dans laquelle des électrodes placées sur le record de surface du tronc cérébral le rythme généré associé à la ventilation des branchies 5. Cette approche a ensuite été adapté par Suzue en 1984 6 pour une utilisation chez les rongeurs nouveau-nés. L'avènement de cette préparation a conduit à des avancées significatives dans la neurobiologie respiratoire. Étant donné qu'il est relativement simple, la technique présentée here se prête à un large éventail d'enquêtes de base de comportements moteurs rythmiques et leurs origines chez les rongeurs nouveau-nés.
L'objectif global de cette méthode est d'enregistrer le corrélat neuronal de l'activité inspiratoire, un rythme respiratoire de type appelé respiration fictive, produite par le réseau des voies respiratoires. Ce procédé peut être utilisé dans un large éventail d'objectifs de recherche, visant les réponses inspiratoires aux variations ou la pharmacologie respiratoires dans les deux sauvages de type 7 et 8 animaux transgéniques. Étant donné que les expériences sont réalisées à basse température, sans afférences sensorielles, et dans des conditions où les concentrations de glucose et de O 2 dans le aCSF sont élevés, des questions ont été soulevées quant à la pertinence physiologique du signal enregistré. Bien qu'il existe des différences claires entre in vivo et in vitro de conditions (par exemple., La fréquence de salves inspiratoire) le fait demeure que la présence deles éléments de base du réseau des voies respiratoires 6 permettent d'étudier un rythme robuste associée à une fonction homéostatique essentiel 9,10.
La raison derrière le développement et l'utilisation de cette technique est de faciliter l'accès direct aux éléments du tronc cérébral du réseau des voies respiratoires, qui sont difficilement accessibles in vivo, en particulier dans les nouveaux-nés. Le tronc cérébral est placé dans des conditions strictement contrôlées: le rythme enregistré est pas modulée par des apports afférents périphériques des poumons ou les organes de la carotide, ce qui permet l'étude de se concentrer sur l'entraînement respiratoire centrale elle-même 11. Ainsi, cet accès est utilisé pour appliquer des stimuli et enregistrer le signal de sortie. Contrairement à la pléthysmographie enregistrements, le rythme respiratoire est modulée par la totalité de ses composants dans tout le corps (par ex., Distension pulmonaire, senseurs chimiques périphériques), ce qui rend difficile l'application de stimuli précis.
Dans unewborn rat, le protocole consiste à enregistrer le quatrième signal de la racine ventrale sur un tronc cérébral isolé et une moelle épinière tronqué, maintenue dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF). Le rythme généré par les préparations de la moelle du tronc cérébral-spinal est constituée de salves lentes individuels qui sont liés au signal inspiratoire 9. Préparations isolées de la moelle épinière tronc cérébral sont facilement enregistrables chez les rats de jour postnatal 0 à 4 (P0 - P4) 7. Cette approche est couramment utilisé pour évaluer la réponse hypoxique du réseau des voies respiratoires, ainsi que la réponse à l'hypercapnie, acidose ou de drogues. Un protocole d'hypoxie aiguë est présenté ici. Cette stimulation est obtenue par retrait de O 2 dans le aCSF; cette approche est couramment utilisé pour évaluer la tolérance et de la réactivité à des insultes hypoxiques. Le protocole induit une dépression du rythme dès la première minute jusqu'à la fin de l'exposition de l'hypoxie (figure 1) 12. Cette dépression est inversépendant la post-hypoxique 12 de récupération. En ce qui concerne la conception expérimentale, il est important de noter que le pont, situé à la partie rostrale du tronc cérébral, a une action inhibitrice sur le générateur de rythme 8. Ainsi, les préparations de pleine tronc cérébral et la moelle épinière rostrale affichent un rythme plus faible. L'inclusion de la protubérance dans l'échantillon isolé de l'enregistrement est déterminée en fonction du but de l'expérience 13; l'étude de l'influence pontique sur le réseau bulbe rachidien de exigerait enregistrements avec et sans les pons de comparer les résultats 14. En outre, l'un des avantages de cette technique est la possibilité d'étendre la partie rostrale de la préparation d'inclure mésencéphalique et / ou régions diencéphaliques 15,16, ce qui permet d'évaluer l'effet de ces régions sur le réseau des voies respiratoires ponto-médullaire.
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Protocol
Cette méthode nécessitait l'utilisation de sujets animaux, autorisés par le Comité d'éthique animale de l'Université Laval (protocole N ° 2012-170).
1. Configuration et préparation
- Solutions
- Préparer des solutions de ACSF selon les recettes 7,17 suivantes. D'autres recettes avec des variations de concentration sont disponibles dans la littérature. Solutions magasin d'achat d'actions à 4 ° C pour jusqu'à un mois.
- Sel solution: ajouter 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0.58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Dissoudre dans 800 ml d'eau distillée puis remplir à 1 L avec de l'eau distillée.
- Une solution de bicarbonate: ajouter 17,65 g de NaHCO 3 (21 mM final). Dissoudre dans 900 ml d'eau distillée puis remplir à 1 L avec de l'eau distillée. Les variations de la concentration en bicarbonate se traduiront par des variations de pH.
- Une solution de glucose: ajouter 54.06g de glucose (30 mM final). Dissoudre dans 400 ml d'eau distillée puis remplir à 500 ml avec de l'eau distillée.
- Préparer aCSF en diluant 100 ml d'une solution de sel, 100 ml d'une solution de bicarbonate et 50 ml de solution de glucose dans 1 litre d'eau distillée. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer une électrode de verre par chauffage et étirage d'un tube de verre jusqu'à ce qu'elle se casse. Poncer la pointe avant de l'utiliser. L'électrode peut être réutilisé plusieurs fois aussi longtemps qu'il reste propre.
- Préparer des solutions de ACSF selon les recettes 7,17 suivantes. D'autres recettes avec des variations de concentration sont disponibles dans la littérature. Solutions magasin d'achat d'actions à 4 ° C pour jusqu'à un mois.
- Installation expérimentale
Remarque: Les détails de mise en place sont présentés dans la figure 2.- Mettez l'amplificateur, le déplacement de calcul de moyenne, le système d'acquisition de données, le contrôleur de température et la pompe. Vérifiez l'amplification du signal (gain = 10 000), la filtration (seuil bas, 10 Hz; seuil haut, 5 kHz), et le taux d'échantillonnage de la conversion analogique-numérique du signal brut (2,5 kHz).
- Remplissez une bouteille avec aCSF et bulle avec carbogène (95% O 2 2). Induire une bubbled- et réchauffé aCSF écoulement dans la chambre d'enregistrement (volume 5 ml) à 4 ml / min. Maintenir la température dans la chambre d'enregistrement à 26 (± 1) ° C. pH devrait être de 7,4 dans ces conditions standard.
- Maintenir 50 ml de carbogène et RT-aCSF barboter dans une seringue de 50 ml à proximité de la chambre de dissection.
- Allumez l'ordinateur et lancez le logiciel d'enregistrement.
2. Dissection
- Peser et de déterminer visuellement le sexe de l'animal (les mâles ont une ano-génitale plus longue distance, tandis que les femelles ont une distance ano-génitale court; les mâles les organes génitaux sont souvent sombres tandis que les organes génitaux féminins sont de couleur rose).
- Anesthésier les rongeurs nouveau-nés par l'une des options suivantes: cryoanesthesia (immerger complètement l'animal dans la glace pendant 4 - 5 min 18), l'injection (equitensine à 4 ml / kg) 19 ou par inhalation d'anesthésiques volatiles (isoflurane 20 ou éther 21). Confirm un plan adéquat de l'anesthésie par l'absence d'un réflexe de retrait de la patte.
- Placez l'animal sur le banc, face ventrale vers le bas. Section de la partie rostrale de la tête coronaire avec un scalpel au niveau du bregma (visible à travers la peau et le crâne). Effectuez cette étape immédiatement après que l'animal est anesthésié.
- Section du corps coronaire avec un scalpel dans les membres antérieurs.
- Enlever la peau, les muscles, les tissus adipeux et viscère avec des ciseaux et des pinces chirurgicales et minces. Depuis os sont mous à cet âge, être prudent pour ne pas endommager le système nerveux. Effectuez cette étape sur le banc.
- Placer la préparation dans la chambre de dissection. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation. De ce point à la fin de l'enregistrement, utiliser un microscope.
- Sur la face dorsale de la préparation, couper le crâne et les vertèbres de la rostrale à la partie caudale long de l'axe moyen avec des ciseaux et des pinces chirurgicales et minces. Ouvrez le crâne de coupeet vertèbres afin d'exposer le tissu nerveux. Utilisez la aCSF strored dans la seringue pour oxygéner la préparation.
- Avec la pince, retirer l'arachnoïde, un tissu mince recouvrant la surface du tissu nerveux. Conserver la pie-mère et les vaisseaux sanguins contre le tissu nerveux. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation.
- Placer la préparation avec la dorsale face vers le bas, et soigneusement abattre le tronc cérébral et la moelle épinière en coupant les nerfs et du tissu conjonctif avec les ciseaux tout en maintenant la préparation en place. Une approche dorsale est également possible. Garder les racines et les nerfs aussi longtemps que possible. Retirez les os pour isoler le tronc cérébral et la moelle épinière. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation.
- Retirer le cervelet et le reste des structures rostrales en les sectionnant avec le scalpel. Utilisez le aCSF stockée dans l'aiguille pour oxygéner la préparation.
- Eventuellement fonction sur expériconception tal, retirez le pont avec le scalpel par une section coronale antérieure à l'artère cérébelleuse inférieure 22. Notez que le maintien de l'ensemble des pons va ralentir le rythme chez les rats et entièrement inhiber chez les souris. Les préparatifs qui ne comprennent que la partie caudale du pont affichent une activité respiratoire-like avec une fréquence stable à la racine de la C4.
3. Enregistrement
- Placez la préparation dans la chambre d'enregistrement, ventrale face vers le haut. Fixer la préparation avec des épingles dans la partie inférieure de la moelle épinière et rostrale-plus partie du tronc cérébral.
- En utilisant une seringue reliée à l'électrode par son aiguille, induire une dépression dans l'électrode (diamètre de la pointe de verre: de 150 à 225 um) en tirant sur le piston de la seringue, afin de combler partiellement l'électrode avec aCSF.
- Utilisation d'un micromanipulateur, placer soigneusement l'électrode à proximité de l'un des quatrième racines ventrales. Autres racines ventrales peuvent aussi présenter une respiratoires comme l'activité (e.g., nerf crânien XII, C1 racine ventrale).
- Provoquer une dépression dans le réservoir d'électrode via la seringue en tirant le piston afin d'aspirer délicatement le radicelles de nerf. Puis déplacez doucement l'électrode pour l'appliquer contre la moelle épinière.
Remarque: Idéalement, la taille des radicelles correspond à la taille de l'ouverture de l'électrode et crée un joint d'étanchéité entre les compartiments interne et externe de l'électrode ainsi. Depuis amplificateurs différentiels sont couramment utilisés pour de tels enregistrements, toute ouverture entre l'intérieur de l'électrode et la chambre d'enregistrement réduit la qualité du signal et il est difficile d'éliminer les bruits de fond. - Commencez l'enregistrement.
- Enregistrer le rythme produit par la préparation dans des conditions normoxiques (c.-à barboter avec du carbogène aCSF: 95% O 2 et 5% CO 2) pendant au moins 20 min afin de déterminer les paramètres de base de la préparation.
- Mettez la perfusion de carbogène-barboter à aCSFaCSF stimulus (par exemple, par barbotage avec 95% de N 2 et 5% de CO2 pendant l'hypoxie stimulus) pendant 15 min. Modifier la durée d'exposition en fonction du protocole expérimental. Consigner la durée de l'exposition sur l'enregistrement et animale fiche. Utilisation tubes en acier inoxydable entre la bouteille et le ACSF chambre chaque fois que possible pour éviter la diffusion de gaz vers l'extérieur du tube.
- Mettez la perfusion retour à aCSF carbogène-barboter norme pendant au moins 15 minutes pour un enregistrement de récupération. Inscrire ce sur l'enregistrement et animale fiche.
- Terminez l'enregistrement.
4. Analyse statistique
- A partir du signal intégré, le calcul de la fréquence que le nombre de paquets par minute (exprimée en salves / min), l'amplitude de la différence entre la ligne de base et le pic de la salve (exprimée en mV), la durée de salve que la durée de du début à la fin de la salve (exprimé en s), la région d'éclatement comme l'aire sous la curve de la salve sur le signal intégré (exprimée en mV · s) (Figure 3).
- Calculez la fréquence, l'amplitude, la durée et la zone éclater éclater sous normoxique (de base), hypoxique (stimulus) et post-hypoxiques conditions (post-stimulus) de récupération comme la moyenne des les 5 dernières minutes des enregistrements pour chaque condition. Ne pas analyser la première partie de chaque condition, car il ya un délai entre la commutation de la perfusion et aCSF homogénéisation dans la chambre d'enregistrement.
- Exprimez puis stimulus (ie, l'hypoxie) et post-stimulus (ie, post-hypoxiques) valeurs de récupération en pourcentage des valeurs de référence pour l'enregistrement correspondant. Exprimer les résultats en tant que moyen ± SD
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Representative Results
Comme mentionné dans l'introduction, l'un des avantages les plus importants de cette technique est l'accès direct au tronc cérébral pour appliquer divers stimuli. A titre d'exemple, l'hypoxie a été appliqué ici. La Figure 1. AB affiche un enregistrement de protocole complète, avec les deux conditions normoxiques et hypoxiques. Figure 1.CE affiche le rythme enregistrés dans des conditions normoxiques (par exemple, aCSF barboter avec 95% O 2 et 5% CO 2 à 26 ° C). Comme démontré précédemment dans cette préparation 11 exact, la fréquence est d'environ huit salves / min, et l'amplitude est d'environ 0,800 mV. Notez que l'amplitude est seulement indicative en raison de ses importantes variations inter-préparation. Le tracé supérieur représente le signal intégré tandis que le tracé inférieur représente le signal brut. Figure 1.DF affiche le rythme enregistré dans des conditions hypoxiques (ie., ACSF barboter avec 95% de N 2 et 5% de CO <sub> 2 à 26 ° C). Comme précédemment caractérisé 23, la fréquence considérablement diminué au cours de l'hypoxie. Figure 1.GH affiche une seule rafale montrant modèles typiques dans des conditions normoxiques et hypoxiques.
Figure 1. Exemples d'enregistrements obtenus à partir de préparations de cordon Brainstem-spinales. Sortie respiratoire enregistrée à partir de la racine ventrale C4 de préparations de rats P4 sous normoxique, des conditions hypoxiques et de récupération post-hypoxiques ((A) signal intégré et (B) de signal brut) . Pour chaque condition, enregistrements agrandies ((C) intégré du signal normoxique; (D) signal hypoxique intégré; (E) signal de normoxique premières; (F) signal hypoxique brut) et salve unique ((G) à l'éclatement normoxiqueet (H) hypoxique burst) sont présentées. Comme mentionné dans le texte, s'il vous plaît noter que l'amplitude doit être interprété avec précaution. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma récapitulatif de l'installation. Le aCSF barboter est réchauffé et envoyé par une pompe dans la chambre d'enregistrement. aCSF excès dans la chambre d'enregistrement est aspiré par une pompe et disposé de. La chambre d'enregistrement est reliée à la masse et le contrôleur de température. La sortie de l'électrode est directement transmis à l'amplificateur, puis au calcul de moyenne mobile et le système d'acquisition de données, et enfin l'ordinateur. S'il vous plaît cliquez ici to voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Analyse des paramètres de rafale. La fréquence est calculé comme le nombre de paquets par minute (exprimée en salves / min), l'amplitude de la différence entre la ligne de base et le pic de la salve (exprimée en mV), la durée de salve la durée du début à la fin de la salve (exprimé en s), la zone d'éclatement que l'aire sous la courbe de la salve sur signal intégré (exprimé en mV · s). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Quantification précise de l'activité respiratoire peut être difficile. En effet, la respiration est une fonction qui peut être à la fois automatique et volontaire, et que est modulée en fonction de l'environnement, les besoins de l'organisme, l'état émotionnel et le comportement. L'avantage de cette technique est l'isolement des éléments neuronaux responsables de la production de la commande respiratoire. Ainsi, les enregistrements électrophysiologiques de préparations pléthysmographie et la moelle du tronc cérébral-spinal sont des techniques complémentaires pour étudier l'ensemble du réseau neuronal respiratoire in vitro et in vivo, respectivement. Patch-clamp enregistrements dans la préparation de la moelle épinière (tronc-ex., Approchant de la surface ventrale) sont également envisageables et permettent l'étude d'un neurone particulier dans un réseau respiratoires préservé 24.
Ce protocole comprend certaines étapes critiques, principalement dans la dissection. Afin d'éviter d'endommager le tissu nerveux,toutes les étapes de dissection doivent être exécutées rapidement et avec précision. Le tissu nerveux ne doit pas être endommagé et être soigneusement conservée par immersion constante dans aCSF. Comme mentionné précédemment, la qualité de la connexion entre le nerf et radicelles de la seconde électrode est une étape critique. L'aspiration de la radicule peut amener l'électrode plus près de la préparation. Alors que le contact entre l'électrode et le tronc cérébral peut améliorer la qualité de l'étanchéité, on doit éviter de faire une dépression ou d'endommager physiquement la préparation.
Le signal intégré doit toujours être utilisé pour l'analyse, mais les signaux premières peut être utile pour différencier rafales appropriées de bruit de fond. En outre, un haut-parleur peut être ajouté à la configuration d'écouter le rythme et déterminer la qualité du signal et le bruit de fond présent sur audition. En effet, quelques variations dans le niveau de référence de fond pourraient être présents à cause d'interférences électriques et la cause à une base instable. Cette interfrences devraient être évités en vérifiant les connexions des câbles et l'aspiration de la racine par l'électrode. En outre, parce que salve amplitude dépend à la fois le bruit de fond et la liaison entre la racine et l'électrode, une fréquence est beaucoup plus fiable d'un paramètre. Ainsi, l'amplitude de la rafale doit toujours être exprimé en pourcentage des valeurs de référence pour éviter des variations inter-individuelles en raison de la configuration.
Limites de la technique sont déterminés par l'âge de l'animal dont la préparation peut être réalisée. Cela permet une étude précise de la mise en place de l'entraînement respiratoire centrale à la naissance, ce qui est très intéressant et cliniquement pertinent, mais il se concentre sur ces premiers âges et ne peut être étendue à des âges plus avancés. Des âges plus avancés peuvent être utilisés dans des préparations de travail cœur du tronc cérébral artérielle perfusés 25, mais avec des modifications substantielles de protocole (voir ci-dessous). Une préparation isolée de cordon tronc cérébral-spinal de cobayes adultes a été développé,ed par Morin-Surun et al. 26, dans laquelle le tronc cérébral est perfusé par l'artère basilaire et le rythme est enregistré dans le nerf crânien XII. Une autre limite est la durée de l'expérience. La préparation ne peut être maintenu pendant plus de 7 heures dans les conditions décrites précédemment 6. Par conséquent, cette technique ne convient pas pour des expériences à long terme, même si les préparatifs de têtards (voir ci-dessous) ont été maintenus 24 heures dans le laboratoire.
Diverses modifications peuvent être apportées à cette technique. Ici, provocation hypoxique a été effectuée, mais d'autres variations de gaz sont également envisageables (par ex., L'hypercapnie 27 ainsi que des variations de pH 28). De la même façon, la préparation peut être perfusé avec aCSF dans lequel les médicaments ont été dissous et appliqué sur le tronc cérébral en tant que pré-traitement ou au cours de 30 29 l'enregistrement. Dans ce cas, le rythme peut être accélérée ou ralentie Dow 29n 30 selon le médicament expérimental. En outre, avec une chambre d'enregistrement compartimenté, aCSF différent peut être appliqué sur des parties sélectives des préparations 6 et 9 variations de température peuvent être utilisés. Cette compartimentation permet l'étude de l'implication des parties du tronc cérébral sélectionnés dans les effets induits relance. Bien que la technique présentée utilise des rats nouveau-nés, il est également applicable à d'autres modèles animaux. En utilisant un protocole similaire à celui appliqué pour les rats, les souris peuvent être utilisés à partir de 16 jours de gestation (E16) jusqu'à 12 P4. La principale différence est la nécessité de se réchauffer et de carbogène-bulle du aCSF lors de la dissection. Tortues, des têtards et des grenouilles adultes peuvent également être utilisés; cependant, ces espèces ont besoin de différentes techniques de dissection ainsi que des ajustements à la composition de la aCSF.
Cette technique peut également être couplé avec des enregistrements de patch-clamp sur le visage rostrale de la préparation 31, ce qui permetvisualisation simultanée du signal de sortie du réseau et l'activité d'une cellule particulière de ce réseau. Tension imagerie de colorant sensible peut également être appliqué chez le rat nouveau-né préparatifs de la moelle épinière tronc cérébral pour localiser les zones activées sur la face ventrale du tronc cérébral 32. analyse de c-fos dans les préparations peut également être réalisée afin d'identifier les populations de neurones impliqués dans les réponses respiratoires spécifiques. Enfin, la préparation peut être modifié pour garder d'autres organes tels que le cœur 25, nervures 6, ou perfusion des artères physiologique avec d'autres rythmes physiologiques 33. Cependant, ces modifications très importantes auraient besoin d'autres protocoles de dissection.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
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