Introduction
Vejrtrækning er en kompleks og vital aktivitet styres af hjernen, så dioxygen (O2) optagelse og kuldioxid (CO2) afskaffelse. Den centrale respiratorisk drive genereres af et komplekst netværk placeret i hjernestammen i begge pattedyr 1, padder 2, krybdyr, fugle 3 4 og 5 fish. Selv hvis kan behandles studiet af vejrtrækning in vivo, præcise mekanistiske undersøgelser kræver direkte adgang til det respiratoriske kontrol-netværket. Til dette formål, Adrian og Buytendijk udviklet en reduceret guldfisk forberedelse, hvor elektroder placeret på hjernestammen overfladen rekord den genererede rytme forbundet med gælle ventilation 5. Denne tilgang blev efterfølgende tilpasset af Suzue i 1984 6 til brug hos nyfødte gnavere. Fremkomsten af dette præparat har ført til betydelige fremskridt i respiratorisk neurobiologi. Da det er relativt enkel, teknikken præsenteret here er modtagelig for en bred vifte af grundlæggende undersøgelser af rytmiske motoriske adfærd og deres oprindelse i nyfødte gnavere.
Det overordnede mål med denne metode er at registrere neurale korrelat for inspiratorisk aktivitet, en respiratorisk-lignende rytme kaldes fiktive vejrtrækning, produceret af det respiratoriske netværk. Denne metode kan anvendes i en bred vifte af forskningsmål, målretning inspiratoriske reaktioner på respiratoriske variationer eller farmakologi i begge vilde type 7 og transgene 8 dyr. Eftersom eksperimenter udføres ved en lav temperatur, uden sensoriske afferente, og under betingelser, hvor koncentrationen af glucose og O2 i aCSF er høje, er der blevet rejst spørgsmål om fysiologiske relevans af signalet registreres. Mens der er klare forskelle mellem in vivo og in vitro (f.eks., Hyppigheden af inspiratoriske brister) faktum er, at tilstedeværelsen afde centrale elementer i det respiratoriske netværk 6 gør det muligt at studere en solid rytme forbundet til en vital homøostatisk funktion 9,10.
Rationalet bag udviklingen og anvendelsen af denne teknik er at lette den direkte adgang til hjernestammen elementer i luftvejene netværk, som er svært tilgængelige in vivo, især i nyfødte. Hjernestammen er placeret under strengt kontrollerede forhold: det optagede rytmen ikke moduleres af perifere afferente input fra lungerne eller carotis organer, gør det muligt for undersøgelsen at fokusere på den centrale respiratoriske drev selv 11. Således anvendes denne adgang til at anvende stimuli og registrere udgangssignalet. I modsætning til plethysmografi optagelser, er det respiratoriske rytme moduleret af alle sine komponenter i hele kroppen (f.eks., Lunge udspiling, perifere chemosensors), hvilket gør det vanskeligt at anvende præcise stimuli.
I enewborn rotte, protokollen består af optagelse fjerde ventrale rod signal på en isoleret hjernestamme og en trunkeret rygmarv, holdes i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Rytmen genereret af hjernestamme-rygmarv præparater er sammensat af individuelle langsomme byger, der er knyttet til den inspiratoriske signal 9. Isolerede hjernestamme-rygmarv præparater let optages, i rotter fra postnatale dag 0 til 4 (P0 - P4) 7. Denne fremgangsmåde er almindeligt anvendt til at evaluere hypoksiske respons i åndedrætsorganerne netværk og også svaret på hyperkapni, acidose eller narkotika. En akut hypoxi-protokol præsenteres her. Denne stimulering er opnået ved tilbagetrækning af O 2 i aCSF; denne fremgangsmåde er almindeligt anvendt til at vurdere tolerance og lydhørhed over for hypoxiske fornærmelser. Protokollen inducerer en rytme depression fra det første minut indtil udgangen af hypoxi eksponering (figur 1) 12. Denne fordybning er vendtunder post-hypoksisk opsving 12. Med hensyn til eksperimentelle design, er det vigtigt at bemærke, at pons, placeret på rostrale del af hjernestammen, har en inhiberende virkning på rytmen generator 8. Således præparater af fuld hjernestamme og rostral rygmarven vise et lavere rytme. Inddragelse af pons i den isolerede prøve til optagelsen er fastlagt i henhold til målet om eksperimentet 13; studiet af pontine indflydelse på medulla oblongata netværk vil kræve optagelser med og uden pons at sammenligne resultaterne 14. Desuden er en af fordelene ved denne teknik er muligheden for at udvide den rostrale del af forberedelsen til at omfatte mesencephale og / eller diencephalic regioner 15,16, hvilket gør det muligt at vurdere effekten af disse regioner på Ponto-medullær respiratorisk netværk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne metode kræves anvendelse af animalske emner, tilladt af Laval University Animal Ethics Committee (protokol # 2012-170).
1. Opsætning og klargøring
- Løsninger
- Forbered aCSF stamopløsninger efter følgende opskrifter 7,17. Andre opskrifter med koncentration variationer er tilgængelige i litteraturen. Store stamopløsninger ved 4 ° C i op til en måned.
- Saltopløsning: tilføj 75,39 g NaCl (129 mM endelig), 2,5 g KCl (3,35 mM endelig); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM endelig); 2,33 g MgCl2 (1,15 mM endelig); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Opløses i 800 ml destilleret vand derefter fylde til 1 l med destilleres vand.
- Bicarbonatopløsning: tilføj 17,65 g NaHCO3 (21 mM endelig). Opløses i 900 ml vand destilleres derefter fyldes op til 1 l med destilleret vand. Variationer af bikarbonatkoncentrationen vil resultere i pH-variationer.
- Glucoseopløsning: tilføje 54,06g glucose (30 mM endelig). Opløses i 400 ml destilleres vand derefter udfylde til 500 ml med destilleret vand.
- Forbered aCSF ved at fortynde 100 ml saltopløsning, 100 ml bicarbonatopløsning, og 50 ml glucoseopløsning i 1 liter destilleret vand. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
- Forbered et glas elektrode ved opvarmning og strække et glasrør, indtil det bryder. Sand ned spidsen før brug. Elektroden kan genbruges mange gange, så længe det forbliver ren.
- Forbered aCSF stamopløsninger efter følgende opskrifter 7,17. Andre opskrifter med koncentration variationer er tilgængelige i litteraturen. Store stamopløsninger ved 4 ° C i op til en måned.
- Forsøgsopstillingen
Bemærk: set-up detaljer præsenteres i figur 2.- Tænd for forstærkeren, flytter averager, dataopsamlingssystem, temperatur controller og pumpe. Kontroller signalet forstærkning (gain = 10.000), filtreringen (lav tærskel, 10 Hz, høj tærskel, 5 kHz), og samplingfrekvens af analog til digital konvertering af det rå signal (2,5 kHz).
- Fyld en flaske med aCSF og boble den med carbogen (95% O 2 5% CO2). Fremkalde en bubbled- og varmes-aCSF flow i optagelsen kammer (volumen 5 ml) ved 4 ml / min. Hold temperaturen i optagelsen kammer ved 26 (± 1) ° C. pH skal være 7,4 i disse standardbetingelser.
- Hold 50 ml RT og carbogen-boblede aCSF i en 50 ml sprøjte nær dissektion kammer.
- Tænd for computeren, og start optagelsen software.
2. Dissektion
- Vejes og visuelt bestemme køn af dyret (hanner har en længere ano-genital afstand, mens hunnerne har en kort ano-genital afstand; hanner kønsdele er ofte mørke, mens kvindelige kønsorganer er lyserøde).
- Bedøver de nyfødte gnavere på en af følgende muligheder: cryoanesthesia (helt fordybe dyret i is i 4 - 5 min 18), injektion (equitensine på 4 ml / kg) 19 eller indånding af flygtige anæstetika (isofluran 20 eller ether 21). Fortrorm en passende plan af anæstesi ved fraværet af en tilbagetrækning af poten refleks.
- Placer dyret på bænken, ventrale nedad. Afsnittet rostrale del af hovedet coronalt med en skalpel på bregma niveau (synlige gennem huden og kraniet). Udfør dette trin umiddelbart efter at dyret er bedøvet.
- Afsnit kroppen coronalt med en skalpel under de forreste medlemmer.
- Fjern hud, muskler, fedtvæv og Indgange med kirurgiske og tynde sakse og tænger. Da knoglerne er bløde i denne alder, være forsigtig for ikke at beskadige nervesystemet. Udfør dette trin på bænken.
- Placer forberedelse i dissektion kammeret. Brug aCSF lagret i sprøjten for at ilte præparatet. Fra dette punkt til slutningen af optagelsen, skal du bruge et mikroskop.
- På den dorsale flade af præparatet, skåret kraniet og ryghvirvler fra rostralt for bageste del langs aksen medium med kirurgiske og tynde sakse og tænger. Åbn cut kranietog ryghvirvler med henblik på at udsætte nervevævet. Brug aCSF strored i sprøjten for at ilte præparatet.
- Med tangen fjernes araknoid membran, et tyndt væv, der dækker overfladen af nervevævet. Behold pia mater og blodkar mod nervevævet. Brug aCSF lagret i sprøjten for at ilte præparatet.
- Placer forberedelse med dorsale billedsiden nedad, og omhyggeligt bringe ned hjernestammen og rygmarven ved at skære nerver og bindevæv med saksen, mens du holder forberedelse på plads. En dorsale tilgang er også mulig. Hold rødderne og nerver så længe som muligt. Fjern knoglerne til at isolere hjernestammen og rygmarven. Brug aCSF lagret i sprøjten for at ilte præparatet.
- Fjern lillehjernen og resterende rostralt strukturer ved sektionering dem med skalpel. Brug aCSF lagret i nålen til at ilte præparatet.
- Eventuelt afhængigt af eksperimenterendedesign tal, fjerne pons med skalpel af en koronalt sektion forreste til den ringere cerebellare arterie 22. Bemærk, at holde de hele pons vil bremse rytmen i rotter og fuldt hæmme den i mus. Præparater, der indeholder kun caudale del af pons vise en respiratorisk-lignende aktivitet med en stabil frekvens på C4 roden.
3. Optagelse
- Placer forberedelse i optagelsen kammer, ventrale opad. Fastgør forberedelse med knappenåle i den nederste del af rygmarven og rostral-meste del af hjernestammen.
- Anvendelse af en sprøjte forbundet til elektroden ved sin nål, inducere en fordybning i elektroden (glas tip diameter: 150 - 225 um) ved at trække sprøjtestemplet, for delvist at fylde elektrode med aCSF.
- Ved hjælp af en mikromanipulator, anbring forsigtigt elektroden tæt på en af de fjerde ventrale rødder. Andre ventrale rødder kunne også fremlægge en respiratorisk-lignende aktivitet (e.g., XII kranienerve, C1 ventrale rod).
- Fremkalde en fordybning i elektroden tanken via sprøjten ved at trække stemplet med henblik på at aspirere forsigtigt nerve rootlet. Derefter forsigtigt bevæge elektroden at anvende den mod rygmarven.
Bemærk: Ideelt størrelsen af rootlet svarer til størrelsen af elektroden åbning og dermed skaber en forsegling mellem de indre og ydre rum i elektroden. Da differensforstærkere er almindeligt anvendt til sådanne optagelser, enhver åbning mellem indersiden af elektroden og optagelse kammeret forringer kvaliteten af signalet og gør det vanskeligt at fjerne baggrundsstøj. - Start optagelsen.
- Optag rytmen produceret af præparatet under normoxiske betingelser (dvs. aCSF gennemboblet med carbogen: 95% O2 og 5% CO2) i mindst 20 minutter for at bestemme basislinieparametre af præparatet.
- Skift perfusionen fra carbogen-boblet aCSF tilstimulus aCSF (dvs. gennemboblet med 95% N2 og 5% CO2 i hypoxi stimulus) i 15 minutter. Alter eksponeringsvarighed afhængigt af forsøgsprotokollen. Optag eksponeringen varighed på optagelsen og dyrs datablad. Brug rustfrie stålrør mellem aCSF flasken og kammeret når det er muligt at undgå gasdiffusion til ydersiden af røret.
- Skift perfusion tilbage til standard carbogen-boblet aCSF i mindst 15 minutter for en genopretning optagelse. Optag dette på optagelsen og dyrs datablad.
- Afslutte optagelsen.
4. Statistisk analyse
- Af det integrerede signal, beregne frekvens som antallet af bursts per minut (udtrykt i bursts / min), amplituden som forskellen mellem baseline og toppen af burst (udtrykt i mV), burst varighed som varigheden fra begyndelsen til slutningen af burst (udtrykt i s), burst område som området under curve af burst på det integrerede signal (udtrykt i mV · s) (figur 3).
- Beregn frekvensen, amplituden, brast varighed og brast område under normoxiske (baseline), hypoxiske (stimulus) og post-hypoxisk (post-stimulus) inddrivelse betingelser som gennemsnittet af de sidste 5 minutter af optagelserne for hver tilstand. Analyserer ikke den første del af hver betingelse, fordi der er en forsinkelse mellem skift af perfusion og aCSF homogenisering i optagelsen kammeret.
- Hurtig derefter stimulus (dvs. hypoxi) og post-stimulus (dvs., post-hypoksiske) nyttiggørelse værdier som en procentdel af grundværdierne for den tilsvarende optagelse. Resultaterne udtrykkes som middelværdi ± SD
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som nævnt i indledningen, en af de vigtigste fordele ved denne teknik er den direkte adgang til hjernestammen at anvende forskellige stimuli. Som et eksempel blev hypoxi anvendes her. Figur 1. AB viser en fuldstændig rapport optagelse, med både normoksiske og hypoxiske betingelser. Figur 1.CE viser rytmen registreret i normoxiske betingelser (dvs., aCSF gennemboblet med 95% O2 og 5% CO2 ved 26 ° C). Som tidligere påvist i netop dette præparat 11, er frekvensen ca. 8 brister / min, og amplituden er omkring 0.800 mV. Bemærk, at amplituden er kun vejledende på grund af dens vigtige inter-forberedelse variationer. Den øvre spor repræsenterer det integrerede signal, mens den nedre spor repræsenterer det rå signal. Figur 1.DF viser rytmen registreret i hypoxiske betingelser (dvs.., ACSF gennemboblet med 95% N2 og 5% CO <sub> 2 ved 26 ° C). Som tidligere karakteriseret 23, frekvensen faldet drastisk i løbet af hypoxi. Figur 1.GH viser en enkelt byge, som viser typiske mønstre i normoxiske og hypoxiske betingelser.
Figur 1. Eksempler på Optagelser Opnåede fra Brainstem-rygmarven Forberedelser. Respiratory output registreret fra C4 ventrale rod af præparater fra P4 rotter under normoxiske, hypoxisk og post-hypoxiske inddrivelse forhold ((A) integreret signal- og (B) rå signal) . For hver betingelse, forstørrede optagelser ((C) integreret normoxisk signal; (D) integreret hypoxisk signal; (E) råt normoxisk signal; (F) råt hypoxiske signal) og en enkelt burst ((G) normoxisk burstog (H) hypoxisk burst) er vist. Som nævnt i teksten, Bemærk venligst at amplituden skal fortolkes forsigtigt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. LISTER Schema af Opsætning. Det boblede aCSF opvarmes og sendes af en pumpe i optagelsen kammer. aCSF overskud i optagelsen kammer aspireres med en pumpe og bortskaffes. Optagelsen kammer er forbundet med jorden og temperaturregulatoren. Elektroden output er direkte videresendes til forstærkeren, derefter til den bevægelige averager og dataopsamlingssystem, og til sidst computeren. Klik her to se en større version af dette tal.
Figur 3. Analyseret Burst Parametre. Er Hyppigheden beregnes som antallet af byger per minut (udtrykt i byger / min), amplituden som forskellen mellem baseline og toppen af burst (udtrykt i mV), burst varighed som varigheden fra begyndelsen til slutningen af burst (udtrykt i s), burst område som området under kurven for burst om integreret signal (udtrykt i mV · s). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøjagtig kvantificering af respiratorisk aktivitet kan være udfordrende. Faktisk vejrtrækning er en funktion, der kan være både automatisk og frivilligt, og det er moduleret i forhold til omgivelserne, kroppens behov, den følelsesmæssige tilstand og adfærd. Fordelen ved denne teknik er isoleringen af de neurale elementer, der er ansvarlige for at producere det respiratoriske kommando. Således elektrofysiologiske optagelser af hjernestamme-rygmarv præparater og plethysmografi er komplementære teknikker til at studere hele neuronal respiratoriske netværk in vitro og in vivo, hhv. Patch-clamp optagelser i hjernestammen-rygmarven forberedelse (fx., Der nærmer sig fra den ventrale overflade) er også tænkelige og tillade studiet af et bestemt neuron i et fredet respiratorisk netværk 24.
Denne protokol indeholder nogle kritiske trin, hovedsageligt i dissektion. For at undgå skader nervevæv,alle dissektion trin skal udføres hurtigt og præcist. Nervevævet bør ikke blive beskadiget, og omhyggeligt bevaret ved konstant nedsænkning i aCSF. Som tidligere nævnt, at kvaliteten af forbindelsen mellem nerve rootlet og elektroden er et andet kritisk trin. Aspiration af rootlet kan bringe elektroden tættere på præparatet. Mens kontakten mellem elektroden og hjernestammen kan forbedre kvaliteten af tætningen, må man undgå at en depression eller fysisk skade præparatet.
Den integrerede signal bør altid anvendes til analyse, men rå signaler kan være nyttigt at skelne ordentlige byger fra baggrundsstøj. Desuden kan en højttaler føjes til opsætningen for at lytte til rytmen og bestemme signalkvaliteten og baggrundsstøj til stede ved audition. Faktisk kunne nogle variationer i baggrunden baseline være til stede på grund af elektrisk interferens og årsag til en ustabil baseline. Sådanne Interferences bør forhindres ved at kontrollere kabelforbindelser og rod sugning af elektroden. Desuden, på grund burst amplitude er afhængig af både baggrundsstøj og forbindelsen mellem roden og elektroden, frekvens er en stor del af en pålidelig parameter. Således bør burst amplituden altid udtrykt i procent af baseline-værdier for at undgå inter-individuelle variationer på grund af opsætningen.
Begrænsninger af teknikken bestemmes i en alder af det dyr, som præparatet kan realiseres. Dette giver en præcis undersøgelse af oprettelsen af den centrale respiratoriske drev ved fødslen, som er meget interessant og klinisk relevant, men den fokuserer på disse tidlige aldre, og kan ikke udvides til senere aldre. De ældre aldersgrupper kan anvendes i arterielt perfunderede arbejder hjerte-hjernestamme præparater 25, men med betydelige modifikationer protokol (se nedenfor). Isoleret hjernestamme-rygmarven præparat fra voksne marsvin har været at udvikleed af Morin-Surun et al. 26, hvor hjernestammen perfunderes via basilar arterie og rytmen er registreret i XII kranienerve. En anden begrænsning er varigheden af eksperimentet. Præparatet kan ikke opbevares i mere end 7 timer i de tidligere beskrevne betingelser 6. Derfor er denne teknik ikke egnet til langvarige forsøg, selv om præparater fra haletudser (se nedenfor) er blevet holdt i 24 timer i laboratoriet.
Forskellige modifikationer kan anvendes på denne teknik. Her er hypoksisk udfordring udført, men andre variationer er gas også tænkes (f.eks., Hyperkapni 27 samt pH-variationer 28). På samme måde kan præparatet perfunderet med aCSF, hvor lægemidler er blevet opløst og påført på hjernestammen som en forbehandling 29 eller under 30 optagelsen. I dette tilfælde kan rytmen fremskyndes 29 eller bremset down 30 ifølge den eksperimentelle lægemiddel. Desuden er det med en rumopdelt registreringskammer, forskellige aCSF kan anvendes på selektive dele af præparatet 6 og temperaturvariationer 9 kan anvendes. Denne opdeling gør det muligt at studere konsekvenserne af udvalgte hjernestammen dele i stimulus-inducerede effekter. Mens teknikken præsenteret anvender nyfødte rotter, kan den også anvendes på andre modeller dyr. Ved hjælp af en protokol svarende til den, der anvendes for rotter, mus kan bruges fra drægtighedsdag 16 (E16), indtil P4 12. Den væsentligste forskel er behovet for at varme og carbogen-boble på aCSF under dissektion. Skildpadder kan haletudser og voksne frøer også anvendes; Men disse arter kræver forskellige dissektion teknikker samt justeringer af sammensætningen af aCSF.
Denne teknik kan også kobles med patch-clamp optagelser på rostrale flade af præparatet 31, giversamtidig visualisering af nettet udgangssignal og aktiviteten af en bestemt celle i dette netværk. Spænding farvestof billeddannelse kan også anvendes i nyfødte rotter hjernestamme-rygmarv præparater at lokalisere de aktiverede områder på den ventrale side af hjernestammen 32. c-fos analyse i præparaterne kan også realiseres med henblik på at identificere de neurale populationer involveret i specifikke respiratoriske responser. Endelig kan fremstillingen modificeres til at holde andre organer såsom hjertet 25, ribber 6, eller fysiologisk arterie perfusion med andre fysiologiske rytmer 33. Imidlertid ville disse meget vigtige ændringer kræver andre dissektion protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
- Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
- Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
- Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
- Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
- Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
- Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
- Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
- Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
- Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
- Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
- Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
- Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
- Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
- Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
- Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
- Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
- Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
- Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
- Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
- Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
- Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
- Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
- Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
- Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
- St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).
