Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

doi: 10.3791/53078 Published: September 29, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yerli Çözünür Kolajen Çözüm 1. Hazırlık

  1. Hazırlama ya da 1-3 mg / örneğin Piez ve arkadaşları tarafından rapor edildiği gibi standart ayırma protokollerini kullanarak ml. 15 de sıçan kuyrukları kolajen asitleştirildi çözünür, tip 200 mg satın
  2. Modifiye edilen kollajen çözeltilerinin istenen son hacmine bağlı olarak, başlangıç ​​malzemesinin miktarını Scale. Yaklaşık çözünebilir doğal kolajen 200 mg, 3 mg / ml metile edilmiş 25-30 ml ve süksinillenmiş kolajen çözeltilerinin 25-30 ml her biri tercih.

2. Kolajen Metilasyon

  1. Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak.
  2. 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Bulanık olma çözüm neden kollajen çökelti gözlemleyin. 25 dakika boyunca 3000 x g'de çöktürülmüş kollajen çözüm aşağı doğru döndürün. Berrak bir jel-benzeri çökelti tüplerin alt görünür olmalıdır. Aspire ve düzgün süpernatant sıvı atmayın.
  3. 0.1 N HCI ile metanol içinde 200 ml çökelmiş kollajen yeniden süspanse edin ve metilasyon reaksiyonu 4 gün boyunca oda sıcaklığında karıştırma ile oluştuğu sağlar. Kollajen erimesi olmaz, ama çözüm bulutlu hale getirecek çok küçük görünür parçalar halinde parçalayın gerekir.
  4. Metilasyon sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g'de çözüm metıle kollajen pelet. Aspire ve asitli metanol süpernatant atın.
  5. Tekrar pipetleme ile yaklaşık 3 mg / ml'lik bir konsantrasyona vererek, steril PBS 25 ml metile edilmiş kolajen çözündürülür ve bir 60 um'lik bir hücre süzgecinden çözelti filtre edin. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın.
  6. Concentratio değerlendirinticari bir sıçan kolajen ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözümün n. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir.
  7. Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak metillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin metıle kollajen olan üst kat.
  8. 1 ay içinde kullanım için 4 ° C'da, çözelti saklayın.

3. Kolajen Succinylation

  1. Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, diğer 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak.
  2. 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Kollajen bulanık olma çözüm neden çöktürmek gerekir.
  3. Suc 40 mg çözülür(kolajen çözeltisinin hacmi inci 20/01) 10 ml aseton içinde cinic anhidrid (kolajen mg'ı başına 0.4 mg) eklenir. Yavaş yavaş (yaklaşık 0.5 mi artışlarla) sürekli pH değerine karıştırılarak kolajen çözeltisi bu karışıma ekleyin. PH 9.0 yaklaşırken 1 N NaOH, 1 veya 2 damla eklenerek pH 9.0'ın üzerinde muhafaza edin.
  4. Aseton içinde süksinik anhidrit katan 120 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin. Süksinillenmiş kollajen erir olarak açık hale çözüm gözlemleyin. Periyodik olarak 9.0 üstünde kalmasını sağlamak için pH değeri kontrol edin.
  5. 1 N HCI 20 ul artışlarla 4.0 çözeltinin pH ayarlayın. Süksinillenmiş kollajen çökeltiler gibi yine bulutlu çözüm gözlemleyin.
  6. Succinylation sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g'de çözüm süksinillenmiş kollajen pelet. Aspire ve reaksiyona girmemiş süksinik anhidrit ile asidifiye süpernatant atın.
  7. Succinylated kolajen çözülürsteril PBS, 25 ml, 60 mikron hücre süzgecinden çözeltisi tekrar pipetle ml / yaklaşık 3 mg'lık bir konsantrasyonunu vermek ve filtre bölgesi. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın.
  8. Ticari bir kollajen sıçan ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözeltinin konsantrasyonunu değerlendirin. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir.
  9. Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak süksinillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin süksinillenmiş kollajen olan üst kat.
  10. 1 ay içinde kullanım için 4 ° C'da, çözelti saklayın.

Kollajen Değişiklikler 4. Doğrulama

  1. Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kollajen çözeltilerin her birinden 1 mi örnekleri hazırlayın ve konsantre seyreltinHidrojen iyonu titrasyon için steril saf su ile 0,1 mg / ml arasında entration. Bundan başka, en azından 4 saat için her 10 kDa kesme membraneusing 3 çözeltisi değişiklikler ile suya karşı diyaliz ile tampon, en az 1000 kat seyreltilir.
  2. NaOH ve HCl az miktarda 7.3 çözeltilerin pH ayarlayın. Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri için titrasyon eğrilerini oluşturmak için Tanford 16 tarafından tarif edildiği gibi rasgele bir referans olarak pH 7.3 kullanarak, örneğin her biri hidrojen iyon titrasyonu yapın.
  3. Asit hacminin ilişkili H +, molekül başına elektron sayısına karşı eklenirler pH değişimine çizilir. Yüksek pH "Amino" sınıfı, nötr noktasına doğru süksinillenmiş kolajen bir kayma (amin gruplarının kaybı) göstermelidir ve düşük pH "karboksil" sınıfı için metile kollajen sola doğru bir kayma (karboksil gruplarının kaybı göstermelidir ) ve süksinillenmiş kollajen bir sağa kayışı (karboksil grubunda bir kazançs), doğal kolajen ile karşılaştırıldığında.
  4. Standart protokoller 17,18 takiben, 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBA) kolorimetrik yöntem kullanılarak succinylation ile ikame nativ kollajen amino gruplarının% belirleyerek succinylation reaksiyonunun etkinliğini değerlendirmek.

Mikroakışkan Cihazlar ve Hücre Yayımlamak 5. Fabrikasyon

  1. Standart yöntemler kullanılarak 9 mikroakışkan cihazları imal. 100 mikron boyunda 0,4-1,5 mm genişliğinde ve hücre büyümesi için uzun kanallar 1-10 mm mikroakışkan hücre kültürü oda oluşturmak için fotolitografi kullanarak tanımlanan silikon üzerinde SU-8 ustaları PDMS çoğaltma kalıp kullanın.
  2. Cihaz ve bir bardak slayt yüzeyini okside plazma temizleyici kullanın ve sonra bağ birlikte basın. En az 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılarak sterilize aygıtı sonra steril PBS içinde 50 ug / ml fibronektin bölmeyi doldurup, 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Fenotipinde veya farklılaşma hali stabilizasyonu için kolajen jel gerektiren primer sıçan ya da insan hepatositleri gibi hücreler, cihazı Tohum. Bu cihaz başına 14 x 10 6 hücre / ml'de tohumlanmıştır taze izole edilmiş fare primer hepatositlerinde 7,19 ya da ticari olarak temin edilebilir dondurulan primer insan hepatositleri 20 ul kullanımı.
  3. Hücreler 4-6 saat takmak ve ardından serbest hücrelerin yıkayın ve büyüme ortamı ile kaplama medya yerine izin verin. Yayılma, tam hücre sağlamak ve hücrelerin konfluent tek tabaka oluşturmak için O / N inkübe edin.

6. katman-katman, bir kollajen depolanmasının

  1. Laminer akış, doku kültürü kaputu, cihaz başına her çözeltinin 10 uygulamalar için metil ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri, yeterli miktarda, yanı sıra ortam birkaç ml hazırlar. Buz üzerinde çözüm tutun. Biz cihaz başına katmanın başına kollajen 20 ul (10-15 kat, toplam cihaz hacmi) kullanın.
  2. Olmakmetilatlanmış (Polikatyonik) çözümü ile çırçır, daha sonra 20 metillenmiş bir ul ve sahip cihazlar yıkama alternatif her uygulama arasında 1 dakika bekledikten kolajen çözümleri succinylated. Aygıtı yaklaşık 20 dakika sürer solüsyon başına 10 kez, toplam yıkayın. Hücreler medya olmadan süreyi en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın.
  3. Yavaş yavaş büyüklüğüne bağlı olarak giriş / çıkışında biriken kollajen gözlemleyin. Sıvı Akış arttıkça direnci, medya ile bir veya iki kez aygıtı yıkayın ve sonra katmanlarını devam edin.
  4. Tüm katmanları uygulandıktan sonra, taze medya ile iki kez cihazı durulayın ve inkübatör dönmek. Hücre tipine bağlı olarak, hepatositler geliştirilmiş polarizasyon gibi hücre dışı matris ile indüklenen morfolojik değişiklikler, bir kaç saat içinde görünür olmalıdır.
  5. Kollajen matrisin mevcudiyetini doğrulamak için standart yöntemler kullanılarak 9 transmisyon elektron mikroskopisi için temsili cihazlar hazırlayınkültürlenmiş hücrelerin üzerine montajı.

Hücre Fenotip ve Fonksiyon 7. Stabilizasyon

  1. Resim hücre tipi için standart yöntemler kullanılarak hücre morfolojisi, canlılık ve polaritesi. Hepatositlerde için, kollajen birikimi etkilerini göstermek için apikal polarizasyon faz mikroskobu, canlılığı için LIVE / DEAD boyama ve CMFDA boya kullanılarak 14 gün boyunca görüntüleri toplamak.
  2. Hücre morfolojisi için, durulama, 20 ul PBS ve görüntüyü faz kontrast mikroskopisi kullanılarak cihazı enjekte PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca cihazı yıkayın.
  3. Ölü / canlı boyama için, durulama, üretici talimatlarına göre hazırlanır DAPI ile ölü / canlı boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir, durulama Cihaz tekrar 20 PBS ul ve görüntünün floresan mikroskobu kullanarak cihazı ile.
  4. Safra Canaliculi boyama, imalatçının talimatları izlenerek, 37 ° C de 30 dakika inkübe hazırlanan DAPI ile 2 uM CMFDA boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için durulama PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme ile tekrar cihazı yıkayın 20 ul PBS ve görüntü floresan mikroskobu kullanarak cihazı.
  5. Harcanan ortam toplamak ve hücre fonksiyonunu belirlemek için, kültür süresi boyunca uygun zaman noktalarında hücresel metabolik ürünlerini ölçmek. Hepatositler için, harcanan ortam içinde albumin ve üre miktarını ölçer.
  6. Böyle değerlendirmek enzim aktivite düzeyleri, antikor boyama ya da RNA analiz gibi hücreler kendilerini, üzerinde son nokta fonksiyonel analizler gerçekleştirin. Hepatositlerde için, neden ve sitokrom P450 enzim faaliyetleri veya faz II konjugasyon enzim glutatyon S-transferaz ölçün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yerli kollajen tabakası-katman birikimi kullanmak için polikatyonik ve polianyonik kollajen çözümleri oluşturmak için metilasyon ve succinylation kullanılarak değiştirilebilir. Succinylation sukkinil grupları ile nativ kollajen ε-amino grupları değiştirir ve metilasyon, bir metil grubu (Şekil 1A) ile saf kollajenine karboksil gruplarını değiştirir. Kollajen proteini amino asit yan zincirlerine Bu modifikasyonlar çözeltiler pH titrasyon eğrilerini değiştirebilir. Metilasyon, amino grupları üzerinde hiçbir etkisi yoktur ve karboksil gruplarının sayısını azaltır Succinylation doğal kolajen (Şekil 1B) ile karşılaştırıldığında, amino gruplarının sayısını azaltır ve karboksil gruplarının sayısı artar. Bu modifikasyonlar, kollajen moleküllerinin yük özelliklerini değiştirebilir. Succinylation pozitif yüklü gruplarını çıkarır ve negatif yüklü gruplar ile değiştirir, ve metilasyon negatif yüklü gruplarını çıkarır (Şekil 1C </ strong>).

Metil ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri (COL Lbl) katmanı-katman depozisyon gibi hücreleri (Şekil 2A) gibi yüklü yüzeylerin üzerine bir ultra-ince kolajen matris düzeneğini oluşturur. Mikroakışkan bir cihaz (Şekil 2B) olan fibronektin kaplı cam üzerine ekildi birincil hepatositler, böyle bir saf kolajen matris takımının (Şekil 2C) ile kaplanabilir. Hücreler üzerindeki 10 iki katmanlı birikimi, yaklaşık 140 nm'de (Şekil 2B) 'in bir kollajen tabaka kalınlığını oluşturur.

COL LBL tekniği kullanılarak yatırılan ultra ince kollajen montaj tabakası mikroakışkan cihazlarda 14 gün boyunca birincil hepatositlerde dengeler. Bir üst matris kapaksız Hepatositler kendi farklılaşmış fenotip, sözleşme kaybeder ve zaman (Şek. 3A-C) üzerinde mikroakışkan cihazların yüzeyini kaldırın. Bunun aksine, hepatositler bir ultra-ince kolajen düzenindeki maintai kaplı14 gün (Şekil 3D-F) üzerinden n kendi farklılaşmış morfolojisi ve polarizasyon. Hücrelerin yaşama kabiliyeti% 90'dan daha büyük (Şekil 3G-I) muhafaza edilmiştir. Buna ek olarak, COL lbl ile tedavi hepatositlerin polarizasyon apikal safra kanalikül ağı (Şekil 3J-L) gelişimini gösteren, zamanla arttı.

Hücre canlılığı, morfoloji ve polarizasyon ek olarak, COL Lbl tekniği kurtarır ve levhalar hücreleri için standart tekniklere benzer seviyelerde primer hepatositlerinde işlevini stabilize eder. Hepatositler tarafından albümin salgılama hemen sonra kaplama düşüktür, ve hücreler, bir matris muhafazaya polarize sağlanmadıkça düşüktür. COL LBL tedavisi (Şekil 4A) stabilize önce 8-10 gün içinde hepatositler artışlar albümin salgılanması sonra. Üre üretimi hücre tohumlama hemen sonra yüksek olduğu ve n, hücrelerde zaman içinde azalırbir matris ile kaplanmış ot, üre üretim COL lbl (Şekil 4B) ile kararlı hale getirilmiş hepatositlerde 8-10 gün sonra dengeler. Sitokrom P450 (CYP) stimuliye yanıt olarak enzim sentezleme hepatositlerin bir uzman fonksiyonudur. 3-metilkolantren yanıt olarak hepatositlerde CYP1A1 indüksiyonu geri kazanılmış ve COL Lbl tedavisi (Şekil 4C) ile 14 güne kadar stabilize edildi.

figür 1
Şekil 1. Sıçan kuyruğu kollajen çözümleri kimyasal olumlu net oluşturmak için modifiye edilmiş veya net negatif polimer çözümler ücret. (A), sırasıyla, karboksil ve ε-amino gruplarını, succinylation ve metilasyon reaksiyonu şematik gösterimleri. Col sonra çözelti, pH değerini değiştiren için gerekli H + iyonları göreli sayıda değişimleri gösteren (B) Hidrojen titrasyon eğrisi türevlerilagen değişiklik. (C) net ücretleri yerli kollajen normalize olarak H + vardiya hesaplanan modifiye kollajen çözümleri (B) (ortalama ± SD). MC: kollajeni metillenmiş. SC: succinylated kollajen. AA: amino asit kalıntıları. Yeniden baskı 9 izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Modifiye edilen kollajen çözümleri Şekil 2. katman-katman bırakma hepatositlerin üstünde bir ultra-ince kollajen matris düzeneği hazırlandı. (A) microdevice üzerinde fibronektin numaralı seribaşı ve metil ve süksinillenmiş kollajen çözümleri alternatif ile kuluçkaya hepatositlerin şematik gösterimi. Temsilcinin TEM kesitleri (grup başına incelenen 20 hücre) conkontrolü (B) ve COL kültür 2 günden sonra (C) hepatositleri Lbl işlemden geçirildi. Oklar: LBL kollajen tabakası. Ölçek çubuğu:. TEM görüntüleri (n = 4 cihazlardan 20 hücrelerinden) ölçülen hücre başına 2 mikron (D) COL LBL tabakası kalınlığı (ortalama ± SD). 9'dan Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. COL LBL tekniği Hepatositler hiçbir üst mikrocihazlardaki katmanın (negatif kontrol) sözleşme. Kültürde 14 gün boyunca mikrocihazlardaki hepatosit morfolojisi, canlılığı ve kutuplaşmayı muhafaza ve yüzey zamanla (A-C) kaldırın. Değiştirilmiş kolajenlerin Lbl biriktirme hepatosit morfolojisi (D-F) viab korurility 14 gün boyunca mikrocihazlarda (G-I). CMFDA polarize olmayan hepatositler (J) sitoplazması içinde kalan bir jenerik hücresi belirleyicisidir. Zamanla, safra kanalikül geliştirme zamanı (L) üzerinden hücrelerin etrafında geliştirmek kanaliküler alanlarda (K) floroforun atılımı tarafından görülebilir. Görüntü ölçek çubuğu: 100 mikron. Ankastre ölçek çubuğu: 50 mikron. 9'dan Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4. COL Lbl mikroakışkan cihazlar 14 gün boyunca, hepatosit albümini ve üre bölümleri ve CYP aktivitesi stabilize eder. COL lbl hepatositlerde (A) Albümin salınımı düşük başladı ve zamanla artmıştır u, COL LBL hepatositler tarafından gün 10 (B) Üre salgılanmasının bir plato ulaşan ntil günde 2 düşük oldu 10. (C) Gün de CYP1A aktivitesinin uyarılmasını bir plato ulaşıncaya kadar zamanla azalmış, ancak önemli ölçüde 7. günde artmış Gün 14. Ortalama ± SEM aracılığıyla muhafaza edilmiştir seviyesi; COL LBL: hepatositler LBL kollajen birikimi sonra kültürlü; NoTop: hayır üst matris tabakası ile kültürlü hepatositler; n = 6-8 cihazlar. 9'dan Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ultra ince saf kolajen düzenekleri değiştirilmiş kolajenlerin katman-katman birikimi ile şarj hücreleri veya malzeme yüzeylerinde yatırılabilir. Bu çalışmanın sonuçları, metilasyon ve yerli kolajen succinylation hücreleri (Şekil 2) ile ilgili ultra ince kollajen matris, derlemeleri yatırmak için katman-katman tekniği kullanılabilir (Şekil 1) ve diğer yüklü polikatyonik ve polianyonik kolajen çözümleri oluşturmak göstermektedir Malzeme yüzeyler. Böyle ultra ince matris tabakaları hepatositler (Şekil 3), kendi işlevi yanı sıra, mikroakışkan cihazlarda tohumlama sonra (Şekil 4) olarak hücrelerin morfolojisi, canlılığı ve kutuplaşma stabilize olabilir.

Ultra ince tabakaların kollajen başarılı birikimi için, metil ve süksinillenmiş kolajenleri oluşturma modifikasyon reaksiyonları kritiktir. Karboksil grubu metilasyon reaksiyonu, uygun olmadığıKollajen metilasyon reaksiyonu LeChâtelier ilkesine dayanmaktadır ileri reaksiyonu tahrik etmek için asitleştirilmiş metanol içinde gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle, reaksiyon verimi artırmak için asidifiye metanol içinde çökelen kolajen erimeden önce pH çökeltme sonrası kollajen tüm fazla suyu çıkarmak çok önemlidir. Succinylation reaksiyonu için aseton içinde süksinik anhidrit eklenirken, 9 üzerinde, solüsyonun pH değerinin muhafaza önemlidir. PH ve sukkinik anhidrid aseton çözeltisinin yavaş yavaş ilave sürekli izlenmesi etkili bir reaksiyon sağlayan da yardımcı olabilir. Katman-katman birikimi sırasında, hücreler medya olmadan gitmek zamanı en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. 10 bilayers prosedürü sürece çoğu hücrelerin inkübatör dışına medya olmadan olması gerektiği gibi yaklaşık yaklaşık 20 dakika alır. Birden fazla 10 bilayers tevdi edilmesi gerekiyorsa, Colla arasında 3-4 saat için bir kuluçka makinesi içinde medya hücreleri dinlenmegen depolanmaları hücrelerin sağlığını sağlamak. Diğer uçta, çok az katmanları, hücre morfolojisi sağlanmasında etkili olmayacaktır. 10 katmanları yaptı ise bizim testlerde, 3 kat, hücre morfolojisi korumak vermedi.

Birçok değişiklikler sorunlarını gidermek için prosedürlere yapılabilir. Sorunlarının ortaya çıkması durumunda zaman ve metilasyon reaksiyonu sıcaklığı değişebilir. Örneğin, 4 ° C'ye kadar, reaksiyon sıcaklığı azaltmak ve verimliliğini artırabilir 7 gün süresi uzar. Ayrıca, pH ekstraksiyonu sırasında polimerizasyon derecesine bağlı olarak, kolajen, bazen tam olarak metilasyon reaksiyonu esnasında asidifiye metanol içinde çözülür. Bu durumda, reaksiyon, bir sonraki adım sırasında topak böylece kollajen çökeltmek için tamamlandıktan sonra 9-10 pH değerine getirmek için 10 M NaOH ilave edin. Mikroakışkan cihazlarda katman-katman birikimi uygularken, küçük kanallar veya limanlar cl olabilirCihaz akışkan direncinde bir artış ile gösterilen kollagenle ogged. Taze medya aygıtı Flushing birikme devam etmek için izin, herhangi tıkanıklıkları ortadan kaldırmak gerekir.

Burada açıklandığı gibi katman-katman kollajen manuel birikim mikroakışkan cihazların ölçekleme ve otomasyon açısından bir kısıtlama budur. Bununla birlikte, bu teknik, bir teknik otomatik ve bir seferde cihaz diziler hazırlamak için kullanılabilir valf ve pompa içeren standart mikroakışkan donanım ile uyumludur. Plâka kültürünün kullanım için bu tekniğin bir diğer sınırlaması, doğal kolajen nispeten büyük miktarda gerektirmesidir. Mikroakışkan uygulama için, metil ve süksinillenmiş kolajenlerin hacimleri birçok cihazlarda ultra-ince kollajen katmanları oluşturmak için de kullanılabilir. Standart doku plakası kültürü ile, diğer taraftan, kaplama çukurlara gerekli hacimleri de artan ebadı ile daha fazla açısından dezavantajlıdır.

Bu katmanlı-ultra ince kollajen matris tabakalarının biriktirilmesi için by-katman tekniği diğer bir alternatif ya da fonksiyonel modifikasyonları kullanılarak, hem de İnce matris düzenekleri tarafından ayrılan hücrelerin çoklu katmanlar oluşturarak geliştirilebilir. Metilasyon ve succinylation nispeten basit bir amino asit yan zinciri modifikasyon reaksiyonları burada kullanılmasına rağmen, alternatif ya da ek reaksiyonlar yerine fonksiyonalize kolajenleri oluşturmak için kullanılabilir. Işlevselleştirilmiş yan zincirler de toplam net pozitif ve negatif yüklerle birlikte proteinleri verir, ancak bu işlevselleştirme çeşitli uygulamalar için de faydalı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33, (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89, (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274, (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21, (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278, (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7, (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2, (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4, (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16, (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19, (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7, (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29, (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2, (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249, (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27, (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).More

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter